مقدمه؛ اهمیت روش انجام تست آنتی بیوگرام در آزمایشگاه میکروب‌شناسی

روش انجام تست آنتی بیوگرام یکی از مهم‌ترین فرآیندهای آزمایشگاه میکروب‌شناسی بالینی است. آنتی بیوگرام (Antibiogram) یا آزمون حساسیت آنتی‌میکروبیال (Antimicrobial Susceptibility Testing / AST) برای تعیین حساسیت یا مقاومت یک ایزوله میکروبی نسبت به داروهای ضد میکروبی انجام می‌شود. نتیجه این تست به پزشک کمک می‌کند درمان تجربی را به درمان هدفمند تبدیل کند، از مصرف غیرضروری آنتی‌بیوتیک جلوگیری شود و احتمال شکست درمان کاهش یابد.

با وجود ظاهر ساده تست، آنتی بیوگرام فقط قرار دادن چند دیسک آنتی‌بیوتیکی روی محیط کشت نیست. این آزمون به انتخاب درست ایزوله، خلوص کشت، تنظیم دقیق غلظت میکروبی، کیفیت محیط، شرایط انکوباسیون، انتخاب صحیح دیسک‌ها، استفاده از Breakpoint معتبر و کنترل کیفی وابسته است. CLSI M100 نسخه ۳۶، منتشرشده در ۲۶ ژانویه ۲۰۲۶، تأکید می‌کند که جداول تفسیر، انتخاب دارو و کنترل کیفی باید همراه با روش‌های استاندارد CLSI M02 برای دیسک دیفیوژن، CLSI M07 برای روش‌های رقتی و CLSI M11 برای بی‌هوازی‌ها استفاده شوند. CLSI M100

اجرای اشتباه آنتی بیوگرام می‌تواند باعث گزارش حساسیت کاذب، مقاومت کاذب، درمان نامناسب، افزایش مدت بستری، افزایش هزینه درمان و تشدید مقاومت میکروبی شود. بنابراین نتیجه آنتی بیوگرام باید همیشه در کنار نوع نمونه، محل عفونت، وضعیت بالینی بیمار، فارماکوکینتیک/فارماکودینامیک دارو، غلظت دارو در محل عفونت و نظر پزشک تفسیر شود. صرفاً یک عدد MIC یا قطر هاله عدم رشد برای تصمیم درمانی کافی نیست.

روش انجام تست آنتی بیوگرام

آنتی بیوگرام چیست؟ تعریف علمی و کاربردی تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی

آنتی بیوگرام، گزارش استانداردشده حساسیت یک میکروارگانیسم نسبت به داروهای ضد میکروبی است. در واقع، آزمایشگاه ابتدا آزمون حساسیت آنتی‌میکروبیال را انجام می‌دهد و سپس نتیجه را به شکل قابل استفاده بالینی در قالب گزارش آنتی بیوگرام ارائه می‌کند.

باید بین «آزمون حساسیت آنتی‌بیوتیکی» و «گزارش آنتی بیوگرام» تفاوت قائل شد. آزمون حساسیت، فرآیند فنی آزمایشگاهی است؛ مانند روش انتشار دیسک (Disk Diffusion)، روش حداقل غلظت مهارکنندگی (Minimum Inhibitory Concentration / MIC)، Broth Microdilution یا سیستم‌های اتوماتیک. اما گزارش آنتی بیوگرام خروجی تفسیرشده آزمایشگاه است که معمولاً با دسته‌بندی حساس (Susceptible)، مقاوم (Resistant) یا حساس با افزایش مواجهه دارویی (Susceptible, Increased Exposure) ارائه می‌شود.

در سیستم EUCAST، دسته‌های S، I و R به ترتیب به معنی احتمال بالای موفقیت درمان با دوز استاندارد، احتمال بالای موفقیت درمان در صورت افزایش مواجهه دارویی، و احتمال بالای شکست درمان حتی با افزایش مواجهه هستند. EUCAST تأکید می‌کند که Exposure تابعی از دوز، فاصله دوز، روش تجویز، زمان انفوزیون، توزیع و دفع دارو و غلظت دارو در محل عفونت است. EUCAST Breakpoint Tables v16.1

موارد کاربرد تست آنتی بیوگرام در تشخیص، درمان و کنترل عفونت

تست آنتی بیوگرام در چند سطح کاربرد دارد. در سطح بالینی، به پزشک کمک می‌کند آنتی‌بیوتیک مناسب را انتخاب کند و درمان هدفمند انجام دهد. در سطح آزمایشگاهی، کیفیت شناسایی میکروارگانیسم و الگوی مقاومت ایزوله را تکمیل می‌کند. در سطح بیمارستانی، داده‌های آنتی بیوگرام برای پایش مقاومت میکروبی، کنترل عفونت‌های بیمارستانی، مدیریت مصرف آنتی‌بیوتیک و طراحی سیاست آنتی‌بیوتیکی مرکز درمانی استفاده می‌شود.

کاربردهای اصلی آنتی بیوگرام شامل انتخاب آنتی‌بیوتیک مناسب، شناسایی مقاومت‌های بالینی مهم، پایش الگوی مقاومت منطقه‌ای یا بیمارستانی، کمک به برنامه‌های Antimicrobial Stewardship، کنترل طغیان‌های بیمارستانی و تهیه الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی آزمایشگاه یا بیمارستان است.

نمونه‌های مناسب برای انجام آنتی بیوگرام و اهمیت ایزوله خالص

آنتی بیوگرام باید روی ایزوله خالص، تازه و مرتبط بالینی انجام شود. انجام آنتی بیوگرام روی فلور نرمال، آلودگی محیطی، کلنی مخلوط یا ایزوله‌ای که ارتباطی با عفونت بیمار ندارد، نه‌تنها ارزش درمانی ندارد بلکه می‌تواند پزشک را به سمت درمان اشتباه هدایت کند.

نمونه‌هایی مانند ادرار، خون، زخم، ترشحات، خلط، مایعات بدن، نمونه‌های تنفسی، نمونه‌های بیمارستانی و کشت‌های مرتبط با عفونت‌های سیستمیک یا موضعی ممکن است نیازمند آنتی بیوگرام باشند؛ اما شرط اصلی این است که ایزوله جداشده عامل احتمالی عفونت باشد. برای مثال، رشد یک فلور مختلط سطحی از نمونه زخم یا رشد میکروارگانیسم‌های فلور دهانی در نمونه خلط بی‌کیفیت، معمولاً برای آنتی بیوگرام روتین مناسب نیست.

آنتی بیوگرام برای هر باکتری جداشده لازم نیست. تصمیم‌گیری باید بر اساس نوع نمونه، کیفیت نمونه، تعداد کلنی، نوع ارگانیسم، محل عفونت، وضعیت بیمار و اهمیت بالینی ایزوله انجام شود.

روش‌های انجام تست آنتی بیوگرام؛ مقایسه Disk Diffusion، MIC و سیستم‌های اتوماتیک

روش انتشار دیسک یا Kirby-Bauer Disk Diffusion

روش انتشار دیسک (Disk Diffusion) یکی از رایج‌ترین روش‌های آنتی بیوگرام در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی است. در این روش، سوسپانسیون استانداردشده باکتری روی سطح محیط مولر هینتون آگار (Mueller-Hinton Agar) تلقیح می‌شود و دیسک‌های حاوی مقدار مشخصی از آنتی‌بیوتیک روی محیط قرار می‌گیرند. پس از انکوباسیون، قطر هاله عدم رشد اندازه‌گیری و با جداول CLSI یا EUCAST مقایسه می‌شود.

مزیت این روش، سادگی، هزینه کمتر، امکان اجرای روتین، عدم نیاز به تجهیزات پیچیده و مناسب بودن برای بسیاری از باکتری‌های شایع است. محدودیت آن این است که نتیجه به شدت به کیفیت محیط، غلظت سوسپانسیون، شرایط انکوباسیون، دیسک‌ها و روش خوانش وابسته است. CLSI M02 نسخه ۱۴، منتشرشده در ۱۹ مارس ۲۰۲۴، روش مرجع دیسک دیفیوژن را برای باکتری‌های هوازی توضیح می‌دهد و شامل آماده‌سازی پلیت، استانداردسازی تلقیح، شرایط انکوباسیون، تفسیر نتایج، QC و محدودیت‌های روش است. CLSI M02

روش MIC با Broth Microdilution

در روش حداقل غلظت مهارکنندگی یا MIC، کمترین غلظت آنتی‌بیوتیک که از رشد قابل مشاهده میکروارگانیسم جلوگیری می‌کند تعیین می‌شود. Broth Microdilution یکی از روش‌های مرجع برای تعیین MIC است و در آن رقت‌های دوبرابری آنتی‌بیوتیک در محیط مایع در میکروپلیت استفاده می‌شود.

مزیت MIC این است که نتیجه کمی و دقیق‌تر از دیسک دیفیوژن است و در مواردی مانند عفونت‌های شدید، مقاومت‌های خاص، داروهای بحرانی، ارگانیسم‌های مشکل‌زا و تأیید نتایج غیرمعمول ارزش بیشتری دارد. محدودیت آن نیاز به کنترل دقیق غلظت دارو، محیط، تلقیح، خوانش و QC است. CLSI M07 نسخه ۱۲، منتشرشده در ۱۹ مارس ۲۰۲۴، روش‌های Broth Macrodilution، Broth Microdilution و Agar Dilution را برای تعیین حساسیت باکتری‌های هوازی استاندارد می‌کند. CLSI M07

روش Agar Dilution

در روش Agar Dilution، غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک داخل محیط آگار تهیه می‌شود و ایزوله‌ها روی سطح محیط تلقیح می‌شوند. این روش بیشتر در مراکز مرجع، مطالعات تحقیقاتی، ارزیابی داروها و برخی ارگانیسم‌های خاص کاربرد دارد. اجرای آن نسبت به دیسک دیفیوژن زمان‌برتر و پرهزینه‌تر است، اما در شرایط کنترل‌شده می‌تواند روش دقیقی برای تعیین MIC باشد.

روش Gradient Strip یا E-test

در روش Gradient Strip، نوار حاوی گرادیان غلظتی آنتی‌بیوتیک روی محیط تلقیح‌شده قرار می‌گیرد و پس از انکوباسیون، MIC از محل تقاطع هاله مهار رشد با نوار خوانده می‌شود. این روش برای تعیین MIC در آزمایشگاه‌هایی که امکان Broth Microdilution ندارند کاربردی است. محدودیت آن هزینه بالاتر، وابستگی به شرایط دقیق محیط و خوانش صحیح نقطه تقاطع است.

سیستم‌های اتوماتیک

سیستم‌هایی مانند VITEK، Phoenix، MicroScan و سایر پلتفرم‌های مشابه، شناسایی و آنتی بیوگرام را به شکل نیمه‌اتوماتیک یا اتوماتیک انجام می‌دهند. مزیت آن‌ها سرعت، استانداردسازی نسبی و اتصال به LIS است. با این حال، آزمایشگاه نباید خروجی سیستم اتوماتیک را بدون بررسی تخصصی گزارش کند. نتایج غیرمعمول، مقاومت‌های بحرانی، ناسازگاری با فنوتیپ شناخته‌شده ارگانیسم یا نتایج نزدیک به Breakpoint باید بر اساس الگوریتم آزمایشگاه، کنترل کیفی، تکرار تست یا روش تأییدی بررسی شوند.

روش انجام آنتی بیوگرام به روش دیسک دیفیوژن؛ مراحل اجرایی استاندارد

۱. انتخاب کلنی خالص و تازه

برای روش انجام تست آنتی بیوگرام به روش دیسک دیفیوژن، ابتدا باید از کشت خالص و تازه استفاده شود. معمولاً کلنی‌ها از کشت ۱۶ تا ۲۴ ساعته روی محیط غیرانتخابی انتخاب می‌شوند. چند کلنی با مورفولوژی مشابه باید برداشته شود تا احتمال انتخاب یک واریانت غیرمعمول کاهش یابد. در صورت مشاهده مخلوط بودن کشت، ابتدا باید خالص‌سازی انجام شود و سپس آنتی بیوگرام صورت گیرد.

خطای رایج در این مرحله، استفاده از کشت قدیمی، کشت مخلوط یا کلنی غیرمرتبط است. کشت قدیمی می‌تواند رشد ضعیف و هاله‌های غیرواقعی ایجاد کند. کشت مخلوط نیز ممکن است باعث ایجاد کلنی‌های داخل هاله یا الگوی مقاومت گمراه‌کننده شود.

۲. تهیه سوسپانسیون میکروبی

کلنی‌های انتخاب‌شده در سرم فیزیولوژی استریل یا محلول مناسب تعلیق می‌شوند تا سوسپانسیون یکنواخت ایجاد شود. EUCAST برای دیسک دیفیوژن، روش Direct Colony Suspension را توصیه می‌کند و غلظت سوسپانسیون باید معادل 0.5 McFarland تنظیم شود. برای E. coli، این کدورت تقریباً معادل ۱ تا ۲ × ۱۰۸ CFU/mL است. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

سوسپانسیون باید ترجیحاً ظرف ۱۵ دقیقه و حداکثر تا ۶۰ دقیقه پس از تهیه استفاده شود. EUCAST قانون عملی «۱۵-۱۵-۱۵» را مطرح می‌کند: استفاده از سوسپانسیون ظرف ۱۵ دقیقه، قرار دادن دیسک‌ها ظرف ۱۵ دقیقه پس از تلقیح، و شروع انکوباسیون ظرف ۱۵ دقیقه پس از قرار دادن دیسک‌ها. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۳. تنظیم کدورت بر اساس 0.5 McFarland

تنظیم دقیق کدورت یکی از حیاتی‌ترین مراحل روش انجام تست آنتی بیوگرام است. EUCAST دامنه قابل قبول 0.5 McFarland را حدود ۰.۴ تا ۰.۶ McFarland ذکر می‌کند. سوسپانسیون غلیظ‌تر باعث کاهش قطر هاله و احتمال گزارش مقاومت کاذب می‌شود. سوسپانسیون رقیق‌تر باعث افزایش قطر هاله و احتمال گزارش حساسیت کاذب می‌شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

در صورت استفاده از استاندارد دستی 0.5 McFarland، جذب نوری استاندارد در طول موج ۶۲۵ نانومتر باید حدود ۰.۰۸ تا ۰.۱۳ باشد. استاندارد مک‌فارلند باید قبل از استفاده مخلوط شود و پس از نگهداری طولانی، مثلاً هر ۶ ماه، مجدداً بررسی یا تعویض شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۴. انتخاب محیط Mueller-Hinton Agar مناسب

برای بیشتر باکتری‌های غیرسخت‌پسند، محیط استاندارد دیسک دیفیوژن، مولر هینتون آگار است. EUCAST تأکید می‌کند که برای ارگانیسم‌های غیرسخت‌پسند از MH agar و برای بسیاری از ارگانیسم‌های سخت‌پسند از MH-F استفاده شود. MH-F شامل مولر هینتون آگار همراه با ۵٪ خون اسب دفیبرینه و ۲۰ mg/L بتا-NAD است. EUCAST Media Preparation v8.0

ضخامت محیط باید ۴ ± ۰.۵ میلی‌متر باشد. برای پلیت گرد ۹۰ میلی‌متری، حجم تقریبی محیط ۲۵ میلی‌لیتر؛ برای پلیت ۱۰۰ میلی‌متری، ۳۱ میلی‌لیتر؛ و برای پلیت ۱۵۰ میلی‌متری، حدود ۷۱ میلی‌لیتر ذکر شده است. pH محیط باید در محدوده ۷.۲ تا ۷.۴ باشد. EUCAST Media Preparation v8.0

سطح محیط باید قبل از تلقیح خشک باشد، اما نباید بیش از حد خشک شود. وجود قطرات آب روی سطح آگار یا داخل درب پلیت می‌تواند باعث پخش غیرطبیعی تلقیح، هاله‌های نامنظم، مه‌آلود شدن هاله و خطای خوانش شود. در صورت نیاز، پلیت‌ها را می‌توان در دمای ۲۰ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد در طول شب یا در ۳۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه با درب برداشته‌شده خشک کرد. EUCAST Media Preparation v8.0

۵. تلقیح یکنواخت سطح پلیت

سوآب استریل در سوسپانسیون استانداردشده فرو برده می‌شود و سطح محیط در سه جهت مختلف تلقیح می‌گردد تا یک Lawn یکنواخت ایجاد شود. سطح پلیت باید بدون فضای خالی و بدون تجمع موضعی باکتری پوشانده شود. در صورتی که پس از انکوباسیون کلنی‌های جدا از هم دیده شود، تلقیح خیلی سبک بوده و تست باید تکرار شود. EUCAST رشد Confluent را برای یک تلقیح صحیح انتظار دارد. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۶. خشک شدن سطح پلیت پس از تلقیح

پس از تلقیح، دیسک‌ها نباید با تأخیر زیاد روی محیط قرار داده شوند. بر اساس روش EUCAST، دیسک‌ها باید ظرف ۱۵ دقیقه پس از تلقیح روی پلیت گذاشته شوند. اگر پلیت تلقیح‌شده مدت زیادی در دمای اتاق بماند، باکتری شروع به رشد می‌کند و قطر هاله‌ها به‌طور کاذب کاهش می‌یابد. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۷. قرار دادن دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی

دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی باید قبل از باز کردن ظرف یا کارتریج به دمای اتاق برسند تا از ایجاد رطوبت و کاهش پایداری دارو جلوگیری شود. دیسک‌ها باید به طور کامل و یکنواخت با سطح آگار تماس داشته باشند و پس از قرار گرفتن روی محیط جابه‌جا نشوند، زیرا انتشار اولیه آنتی‌بیوتیک به سرعت آغاز می‌شود. EUCAST قطر ۶ میلی‌متری دیسک‌ها را برای Breakpointهای قطر هاله و معیارهای QC خود معتبر می‌داند. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

تعداد دیسک‌ها باید به‌گونه‌ای باشد که هاله‌ها با هم تداخل نداشته باشند. معمولاً حداکثر ۶ دیسک روی پلیت ۹۰ میلی‌متری و ۱۲ دیسک روی پلیت ۱۵۰ میلی‌متری قابل استفاده است، اما انتخاب نهایی به ارگانیسم و آنتی‌بیوتیک‌ها بستگی دارد. برای بررسی مقاومت القایی کلیندامایسین در استافیلوکوک‌ها و استرپتوکوک‌ها، فاصله دیسک اریترومایسین و کلیندامایسین باید طبق دستورالعمل رعایت شود؛ در EUCAST فاصله لبه تا لبه برای استافیلوکوک‌ها ۱۲ تا ۲۰ میلی‌متر و برای استرپتوکوک‌ها ۱۲ تا ۱۶ میلی‌متر ذکر شده است. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۸. انکوباسیون

پلیت‌ها باید وارونه شوند و ظرف ۱۵ دقیقه پس از قرار دادن دیسک‌ها وارد انکوباتور شوند. تأخیر در انکوباسیون می‌تواند باعث Pre-diffusion و افزایش کاذب قطر هاله شود. انکوباسیون طولانی‌تر از زمان توصیه‌شده نیز می‌تواند باعث رشد داخل هاله و گزارش مقاومت کاذب شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

برای بسیاری از ارگانیسم‌های شایع مانند Enterobacterales، Pseudomonas spp.، Acinetobacter spp.، Staphylococcus spp. و Enterococcus spp. در روش EUCAST، انکوباسیون در دمای ۳۵ ± ۱ درجه سانتی‌گراد در هوا به مدت ۱۸ ± ۲ ساعت انجام می‌شود. برای Enterococcus spp. در بررسی گلیکوپپتیدها، خوانش نهایی موارد حساس نباید قبل از ۲۴ ساعت انجام شود. برای Streptococcus spp.، Streptococcus pneumoniae، Haemophilus influenzae، Moraxella catarrhalis، Listeria monocytogenes و Pasteurella multocida، شرایط EUCAST شامل ۳۵ ± ۱ درجه سانتی‌گراد در ۴ تا ۶٪ CO2 به مدت ۱۸ ± ۲ ساعت است. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

برای Campylobacter jejuni و C. coli، روش EUCAST شرایط متفاوتی دارد: MH-F، تلقیح 0.5 McFarland، اتمسفر میکروآئروفیلیک، دمای ۴۱ ± ۱ درجه سانتی‌گراد و زمان ۲۴ ± ۱ ساعت. در صورت رشد ناکافی برخی C. coliها، انکوباسیون تا ۴۰ تا ۴۸ ساعت ادامه داده می‌شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۹. اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد

پس از انکوباسیون، قطر هاله عدم رشد باید با خط‌کش یا کولیس و به نزدیک‌ترین میلی‌متر اندازه‌گیری شود. در روش EUCAST، لبه هاله معمولاً در نقطه مهار کامل رشد با چشم غیرمسلح خوانده می‌شود؛ پلیت حدود ۳۰ سانتی‌متر از چشم نگه داشته می‌شود و در موارد دشوار، زاویه حدود ۴۵ درجه نسبت به سطح میز می‌تواند کمک‌کننده باشد. محیط‌های بدون مکمل معمولاً از پشت پلیت و با نور بازتابی روی زمینه تیره خوانده می‌شوند، در حالی که محیط‌های مکمل‌دار از جلوی پلیت و با درب برداشته‌شده خوانده می‌شوند. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

۱۰. مقایسه با جداول CLSI یا EUCAST

قطر هاله به‌تنهایی معنی بالینی ندارد. عدد به‌دست‌آمده باید با Breakpoint معتبر همان ارگانیسم، همان آنتی‌بیوتیک، همان مقدار دیسک و همان سیستم تفسیری مقایسه شود. در حال حاضر، EUCAST Clinical Breakpoint Tables نسخه 16.1 برای بازه ۲۴ ژوئن تا ۳۱ دسامبر ۲۰۲۶ منتشر شده است و فایل رسمی آن شامل تفسیر MIC و قطر هاله است. EUCAST Clinical Breakpoint Tables

نکته مهم این است که Breakpointها ثابت نیستند. در EUCAST v16.1، تغییرات نسبت به نسخه 16.0 مشخص شده و شامل Breakpointهای جدید یا اصلاح‌شده برای برخی ارگانیسم‌ها و داروهاست. بنابراین استفاده از نسخه‌های قدیمی می‌تواند باعث گزارش اشتباه شود. EUCAST Breakpoint Tables v16.1

خلاصه مراحل انجام تست آنتی بیوگرام به روش دیسک دیفیوژن

محیط کشت مناسب برای آنتی بیوگرام؛ کنترل Mueller-Hinton Agar

Mueller-Hinton Agar به دلیل ترکیب استاندارد، قابلیت پخش مناسب آنتی‌بیوتیک‌ها، حمایت از رشد بسیاری از باکتری‌های غیرسخت‌پسند و قابلیت کنترل کیفی، محیط استاندارد دیسک دیفیوژن است. با این حال، همه ارگانیسم‌ها روی MH معمولی به‌خوبی رشد نمی‌کنند. برای ارگانیسم‌های سخت‌پسند مانند Streptococcus spp.، Streptococcus pneumoniae، Haemophilus influenzae، Moraxella catarrhalis و برخی ارگانیسم‌های دیگر، EUCAST محیط MH-F را توصیه می‌کند که شامل ۵٪ خون اسب دفیبرینه و ۲۰ mg/L β-NAD است. EUCAST Media Preparation v8.0

کیفیت محیط باید به‌طور مداوم بررسی شود. ضخامت نامناسب محیط، pH خارج از محدوده، رطوبت زیاد، خشک شدن بیش از حد، کاتیون‌های نامناسب، غلظت بالای تیمین/تیمیدین و شرایط نگهداری غلط می‌توانند نتیجه را تغییر دهند. EUCAST برای QC محیط، pH ۷.۲ تا ۷.۴، ضخامت ۴ ± ۰.۵ mm، رشد مناسب سویه‌های کنترل و قرار داشتن قطر هاله QC در محدوده قابل قبول را مطرح می‌کند. EUCAST Media Preparation v8.0

تهیه سوسپانسیون میکروبی و اهمیت 0.5 McFarland در روش انجام تست آنتی بیوگرام

0.5 McFarland یکی از نقاط کنترلی اصلی در روش انجام تست آنتی بیوگرام است. افزایش تراکم باکتری، هاله عدم رشد را کوچک‌تر می‌کند و ممکن است ایزوله به اشتباه مقاوم گزارش شود. کاهش تراکم باکتری، هاله را بزرگ‌تر می‌کند و ممکن است ایزوله به اشتباه حساس گزارش شود.

استفاده از دستگاه فتومتریک یا دنسیتومتر کالیبره‌شده نسبت به مقایسه چشمی ارجح است. اگر مقایسه چشمی انجام می‌شود، باید در برابر زمینه سفید با خطوط سیاه انجام شود. در مورد برخی ارگانیسم‌ها، دستورالعمل اختصاصی وجود دارد؛ مثلاً در EUCAST، اگر Streptococcus pneumoniae از پلیت شکلات آگار سوسپند شود، تلقیح باید معادل 1.0 McFarland با دامنه قابل قبول ۰.۹ تا ۱.۱ باشد. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

انتخاب دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی در تست آنتی بیوگرام

انتخاب دیسک‌ها باید بر اساس نوع ارگانیسم، محل عفونت، نوع نمونه، دستورالعمل CLSI یا EUCAST، سیاست آنتی‌بیوتیکی مرکز درمانی، الگوی مقاومت منطقه‌ای و ارتباط بالینی انجام شود. هر آنتی‌بیوتیکی برای هر باکتری یا هر محل عفونت قابل تست یا گزارش نیست.

برای مثال، یک آنتی‌بیوتیک ممکن است در عفونت ادراری قابل گزارش باشد اما برای عفونت سیستمیک مناسب نباشد. یا ممکن است دارویی در جدول Breakpoint برای یک ارگانیسم وجود نداشته باشد. در EUCAST، علامت Dash در جدول Breakpoint نشان می‌دهد دارو برای درمان عفونت ناشی از آن ارگانیسم مناسب نیست و باید از تست و کاربرد بالینی آن پرهیز شود؛ اگر تست انجام شده باشد، معمولاً نباید به‌عنوان گزینه درمانی گزارش شود. EUCAST Breakpoint Tables v16.1

شرایط انکوباسیون در روش انجام تست آنتی بیوگرام

شرایط انکوباسیون باید دقیقاً با دستورالعمل انتخاب‌شده هماهنگ باشد. دما، زمان، اتمسفر، تعداد پلیت‌های روی هم، رطوبت انکوباتور و زمان ورود پلیت به انکوباتور همگی روی نتیجه اثر دارند. در روش EUCAST، پلیت‌ها باید پس از قرار دادن دیسک‌ها ظرف ۱۵ دقیقه انکوبه شوند و روی هم چیدن زیاد پلیت‌ها می‌تواند به دلیل گرمایش غیر یکنواخت نتیجه را تحت تأثیر قرار دهد. برای بیشتر انکوباتورها، حداکثر پنج پلیت در هر Stack مناسب دانسته شده است. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

شرایط معمول EUCAST برای بسیاری از باکتری‌های روتین، ۳۵ ± ۱ درجه سانتی‌گراد و ۱۸ ± ۲ ساعت است؛ اما این عدد برای همه ارگانیسم‌ها یکسان نیست. برخی ارگانیسم‌ها به CO2، اتمسفر میکروآئروفیلیک، زمان طولانی‌تر یا محیط مکمل‌دار نیاز دارند. بنابراین آزمایشگاه باید SOP خود را بر اساس سیستم تفسیری رسمی و نوع ارگانیسم تدوین کند.

خواندن و تفسیر هاله عدم رشد در تست آنتی بیوگرام

خواندن هاله یکی از بخش‌های پرخطای آنتی بیوگرام است. قطر هاله باید در نقطه مهار کامل رشد اندازه‌گیری شود، اما در برخی آنتی‌بیوتیک‌ها و ارگانیسم‌ها استثنا وجود دارد. برای مثال، در Proteus spp. باید Swarming نادیده گرفته شود و مهار رشد واقعی خوانده شود. در مورد E. coli با فسفومایسین، EUCAST توصیه می‌کند کلنی‌های جداگانه داخل هاله نادیده گرفته و لبه بیرونی هاله خوانده شود. برای Enterococcus faecalis و Enterococcus faecium با وانکومایسین، لبه فازی یا کلنی داخل هاله می‌تواند نشانه مقاومت باشد و نباید قبل از ۲۴ ساعت نتیجه حساس گزارش شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

در صورت مشاهده هاله دوگانه، کلنی‌های واضح داخل هاله یا الگوی غیرمنتظره، ابتدا باید خلوص کشت بررسی شود. اگر کشت آلوده باشد، تست باید تکرار شود. اگر کشت خالص باشد، کلنی‌های داخل هاله ممکن است نشان‌دهنده زیرجمعیت مقاوم، جهش، هترو‌رزیستانس یا مقاومت القایی باشند و باید بر اساس دستورالعمل معتبر تفسیر شوند.

تفسیر نتایج S، I و R در گزارش آنتی بیوگرام

در سیستم CLSI، دسته‌های Susceptible، Intermediate و Resistant استفاده می‌شود، اگرچه مفهوم Intermediate در سال‌های اخیر باید با احتیاط بیشتری تفسیر شود و نباید همیشه به معنی بی‌اثر بودن دارو تلقی شود. در برخی شرایط، Intermediate می‌تواند نشان‌دهنده احتمال موفقیت درمان در محل‌هایی باشد که دارو به غلظت بالاتری می‌رسد یا با دوز/روش تجویز مناسب‌تر مواجهه دارویی افزایش می‌یابد.

در سیستم EUCAST، دسته I به‌صراحت به معنی Susceptible, Increased Exposure است؛ یعنی با افزایش مواجهه دارویی، احتمال موفقیت درمان بالا وجود دارد. افزایش مواجهه می‌تواند با افزایش دوز، کوتاه‌کردن فاصله دوز، افزایش زمان انفوزیون، انتخاب مسیر مناسب تجویز یا رسیدن دارو به غلظت بالاتر در محل عفونت حاصل شود. EUCAST Breakpoint Tables v16.1

EUCAST در جدول‌های خود معمولاً مقدار I را به‌صورت جداگانه نشان نمی‌دهد و آن را بین S و R تعریف می‌کند. برای مثال، اگر در یک نمونه فرضی MIC به صورت S ≤ 1 mg/L و R > 8 mg/L تعریف شده باشد، محدوده I برابر ۲ تا ۸ mg/L است. اگر قطر هاله به‌صورت S ≥ 22 mm و R < 18 mm تعریف شده باشد، محدوده I برابر ۱۸ تا ۲۱ mm است. این مثال برای فهم منطق جدول است و نباید به‌عنوان Breakpoint عمومی برای همه ارگانیسم‌ها یا داروها استفاده شود. EUCAST Breakpoint Tables v16.1

کنترل کیفی تست آنتی بیوگرام؛ سویه کنترل، دیسک، محیط و اپراتور

کنترل کیفی آنتی بیوگرام باید بخش جدایی‌ناپذیر کار روزانه آزمایشگاه باشد. بدون QC معتبر، حتی اگر ظاهر تست درست باشد، نتیجه قابل اعتماد نیست. QC باید محیط، دیسک‌ها، سوسپانسیون، مک‌فارلند، انکوباتور، اپراتور، خوانش، سیستم اتوماتیک و نرم‌افزار گزارش‌دهی را پوشش دهد.

سویه‌های کنترل کیفی رایج شامل Escherichia coli ATCC 25922، Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853، Staphylococcus aureus ATCC 29213، Enterococcus faecalis ATCC 29212، Streptococcus pneumoniae ATCC 49619، Haemophilus influenzae ATCC 49766 و Campylobacter jejuni ATCC 33560 هستند. EUCAST این سویه‌ها را برای کنترل روتین معرفی می‌کند و برای برخی مکانیسم‌های مقاومتی، سویه‌های Extended QC نیز توصیه می‌شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

در EUCAST، کنترل‌ها باید روزانه یا حداقل چهار بار در هفته برای آنتی‌بیوتیک‌های پنل روتین انجام شوند و نتایج QC باید قبل از گزارش نتایج بیماران بررسی شود. همچنین هر روز که تست انجام می‌شود، نتایج ۲۰ تست QC متوالی اخیر باید از نظر Trend و انحراف مداوم از Target بررسی شود. اگر دو تست متوالی خارج از محدوده باشند یا چند دیسک در یک روز خارج از محدوده قرار گیرند، باید قبل از گزارش نتایج بیماران بررسی و در صورت لزوم تست تکرار شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

QC Range نباید از حافظه، پوستر قدیمی یا فایل‌های غیررسمی برداشته شود. برای EUCAST، باید از QC Tables نسخه معتبر جاری استفاده شود؛ نسخه 16.0 از ۱ ژانویه ۲۰۲۶ معتبر شده است و تغییرات نسبت به نسخه قبل را مشخص می‌کند. برای CLSI نیز باید از جداول QC آخرین نسخه M100 استفاده شود. EUCAST QC Tables v16.0

خطاهای رایج در تست آنتی بیوگرام و اثر آن‌ها بر نتیجه

گزارش‌دهی نتیجه آنتی بیوگرام؛ از عدد آزمایشگاهی تا تصمیم بالینی

گزارش نهایی آنتی بیوگرام باید قابل استفاده بالینی باشد، نه صرفاً فهرستی طولانی از آنتی‌بیوتیک‌ها. گزارش باید شامل نام صحیح ارگانیسم، منبع نمونه، روش انجام تست در صورت نیاز، نتیجه S/I/R یا MIC، توضیحات ضروری و هشدارهای مربوط به مقاومت باشد.

گزارش انتخابی یا Selective Reporting یکی از اصول مهم است. همه آنتی‌بیوتیک‌های تست‌شده نباید لزوماً گزارش شوند. برخی داروها فقط برای غربالگری مقاومت، تأیید فنوتیپ یا کنترل کلاس دارویی استفاده می‌شوند و ممکن است برای پزشک گزارش نشوند. همچنین داروهای غیرضروری، داروهای نامناسب برای محل عفونت، داروهای با سمیت بالا یا داروهای رزرو باید طبق سیاست مرکز محدود گزارش شوند.

نتیجه آنتی بیوگرام باید در کنار شرایط بیمار تفسیر شود. برای مثال، حساس بودن یک ایزوله در شرایط آزمایشگاهی الزاماً به معنی موفقیت قطعی درمان نیست. محل عفونت، نفوذ دارو، وضعیت ایمنی بیمار، وجود Biofilm، منبع عفونت، تخلیه آبسه، دوز دارو، عملکرد کلیه و کبد و نظر پزشک همگی در تصمیم درمانی نقش دارند.

موارد خاص و هشدارهای مهم در تفسیر تست آنتی بیوگرام

MRSA

تشخیص مقاومت به متی‌سیلین در Staphylococcus aureus اهمیت بالینی زیادی دارد. در دیسک دیفیوژن، Cefoxitin معمولاً برای غربالگری مقاومت متی‌سیلینی استفاده می‌شود. در EUCAST هنگام استفاده از Cefoxitin برای تشخیص مقاومت متی‌سیلین در استافیلوکوک‌ها، باید هاله به‌دقت در نور مناسب بررسی شود تا کلنی‌های داخل هاله که ممکن است ناشی از آلودگی یا بیان مقاومت هتروژن باشند تشخیص داده شوند. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

ESBL

تولید بتالاکتامازهای وسیع‌الطیف (Extended-Spectrum β-Lactamases / ESBL) در Enterobacterales می‌تواند باعث مقاومت به بسیاری از سفالوسپورین‌ها شود. گزارش ESBL باید طبق الگوریتم رسمی آزمایشگاه، دستورالعمل CLSI/EUCAST و سیاست درمانی مرکز انجام شود. در موارد شک، استفاده از تست تأییدی یا روش‌های مکمل ضروری است.

AmpC

AmpC β-lactamase می‌تواند ذاتی یا اکتسابی باشد و در برخی گونه‌ها باعث پیچیدگی تفسیر سفالوسپورین‌ها شود. گزارش‌دهی بدون شناخت مقاومت ذاتی و القایی ممکن است منجر به انتخاب درمان نامناسب شود.

Carbapenemase

کارباپنم‌ازها مانند KPC، NDM، OXA-48-like و سایر مکانیسم‌ها اهمیت کنترل عفونت و درمانی بالایی دارند. مشاهده کاهش حساسیت به کارباپنم‌ها، به‌ویژه در Enterobacterales، باید بر اساس الگوریتم آزمایشگاه بررسی و در صورت نیاز به تست‌های تأییدی، مولکولی یا ارجاع به آزمایشگاه مرجع منتهی شود.

VRE

در انتروکوک‌ها، مقاومت به وانکومایسین باید با دقت بررسی شود. EUCAST تأکید می‌کند که برای E. faecalis و E. faecium با وانکومایسین، لبه فازی یا کلنی داخل هاله باید بیشتر بررسی شود و ایزوله نباید پیش از ۲۴ ساعت به‌عنوان حساس گزارش شود. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

D-test

برای تشخیص مقاومت القایی کلیندامایسین، قرارگیری صحیح دیسک اریترومایسین و کلیندامایسین مهم است. فاصله نادرست می‌تواند D-test را منفی یا مثبت کاذب کند. طبق روش EUCAST، فاصله لبه تا لبه دیسک‌ها برای استافیلوکوک‌ها ۱۲ تا ۲۰ میلی‌متر و برای استرپتوکوک‌ها ۱۲ تا ۱۶ میلی‌متر ذکر شده است. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0

مقاومت ذاتی و مقاومت غیرمعمول

برخی باکتری‌ها به‌طور ذاتی به بعضی آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم‌اند. گزارش حساسیت برای دارویی که ارگانیسم نسبت به آن مقاومت ذاتی دارد خطای جدی محسوب می‌شود. همچنین مشاهده الگوهای غیرمعمول، مانند حساسیت غیرمنتظره یا مقاومت نادر، باید قبل از گزارش نهایی بررسی شود.

تفاوت CLSI و EUCAST در آنتی بیوگرام

CLSI و EUCAST هر دو سیستم معتبر برای استانداردسازی AST هستند، اما در Breakpointها، دسته‌بندی‌ها، دوزهای مبنا، برخی روش‌های خوانش، مفهوم I، نحوه گزارش و برخی الگوریتم‌های مقاومت تفاوت دارند. CLSI M100 منبع اصلی جداول تفسیر، انتخاب دارو و QC در سیستم CLSI است و EUCAST نیز Clinical Breakpoint Tables، روش دیسک دیفیوژن و QC Tables را به شکل رایگان منتشر می‌کند. CLSI M100

آزمایشگاه باید یکی از این دو سیستم را به‌صورت رسمی انتخاب کند و در SOP، آموزش پرسنل، فرم‌ها، LIS و گزارش‌دهی به آن پایبند باشد. ترکیب غیرمنطقی Breakpointهای CLSI و EUCAST در یک گزارش می‌تواند باعث تناقض جدی شود. برای مثال، ممکن است یک ایزوله با یک سیستم I و با سیستم دیگر S یا R تفسیر شود. بنابراین استفاده ترکیبی فقط در شرایط کنترل‌شده، با تأیید مسئول فنی و مستندات روشن قابل قبول است، نه به شکل روتین و بدون سیاست مشخص.

نکات ایمنی زیستی در روش انجام تست آنتی بیوگرام

کار با ایزوله‌های بالینی باید بر اساس اصول ایمنی زیستی (Biosafety) انجام شود. استفاده از روپوش، دستکش، محافظ چشم در موارد خطر پاشش، رعایت بهداشت دست، ضدعفونی سطح کار، جلوگیری از تولید آئروسل، استفاده از کابینت ایمنی زیستی در شرایط لازم و دفع صحیح پلیت‌ها و سوآب‌ها ضروری است.

WHO Laboratory Biosafety Manual ویرایش چهارم، رویکرد ایمنی زیستی مبتنی بر ارزیابی ریسک را مطرح می‌کند و شامل موضوعاتی مانند PPE، کابینت ایمنی زیستی، ضدعفونی، مدیریت پسماند و برنامه مدیریت ایمنی زیستی است. بنابراین سطح اقدامات ایمنی باید بر اساس ارگانیسم، نوع نمونه، احتمال آئروسل، حجم کار و ریسک آزمایشگاه تعیین شود. WHO Laboratory Biosafety Manual

جمع‌بندی؛ آنتی بیوگرام یک فرآیند استاندارد است نه فقط قرار دادن دیسک روی محیط

روش انجام تست آنتی بیوگرام یک فرآیند استاندارد، چندمرحله‌ای و وابسته به کنترل کیفی است. کیفیت نتیجه از لحظه انتخاب کلنی شروع می‌شود و تا گزارش‌دهی نهایی ادامه دارد. خطا در هر مرحله، از تنظیم نادرست 0.5 McFarland تا استفاده از محیط نامناسب، دیسک تاریخ‌گذشته، انکوباسیون غلط یا Breakpoint قدیمی، می‌تواند نتیجه را تغییر دهد.

آنتی بیوگرام فقط یک آزمون فنی نیست؛ یک ابزار تصمیم‌سازی درمانی است. بنابراین آزمایشگاه باید روش اجرایی خود را بر اساس CLSI یا EUCAST معتبر تدوین کند، جداول را به‌روز نگه دارد، QC را مستند انجام دهد، مقاومت‌های غیرمعمول را تأیید کند و گزارش نهایی را با نگاه بالینی ارائه دهد. نتیجه آنتی بیوگرام باید همیشه در کنار نوع نمونه، محل عفونت، شرایط بیمار، PK/PD دارو و نظر پزشک تفسیر شود.

سوالات رایج درباره روش انجام تست آنتی بیوگرام

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

1. CLSI M100، Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing، نسخه ۳۶، منتشرشده در ژانویه ۲۰۲۶؛ مرجع اصلی Breakpointها، انتخاب دارو و QC در سیستم CLSI. مشاهده منبع
2. CLSI M02، Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests، نسخه ۱۴، منتشرشده در مارس ۲۰۲۴؛ مرجع اجرای استاندارد روش دیسک دیفیوژن. مشاهده منبع
3. CLSI M07، Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically، نسخه ۱۲، منتشرشده در مارس ۲۰۲۴؛ مرجع روش‌های MIC شامل Broth Microdilution و Agar Dilution. مشاهده منبع
4. EUCAST Clinical Breakpoint Tables v16.1، معتبر از ۲۴ ژوئن ۲۰۲۶ تا ۳۱ دسامبر ۲۰۲۶؛ مرجع تفسیر MIC و قطر هاله در سیستم EUCAST. مشاهده منبع
5. EUCAST Disk Diffusion Method v13.0، ژانویه ۲۰۲۵؛ راهنمای اجرای استاندارد دیسک دیفیوژن برای باکتری‌های هوازی و برخی ارگانیسم‌های سخت‌پسند. مشاهده منبع
6. EUCAST Media Preparation v8.0، ژانویه ۲۰۲۶؛ راهنمای آماده‌سازی MH، MH-F و محیط‌های مورد استفاده برای دیسک دیفیوژن و MIC. مشاهده منبع
7. EUCAST QC Tables v16.0، معتبر از ۱ ژانویه ۲۰۲۶؛ مرجع دامنه‌های کنترل کیفی برای MIC و Disk Diffusion. مشاهده منبع
8. Manual of Clinical Microbiology، ویرایش ۱۳، ASM/Wiley؛ منبع مرجع میکروب‌شناسی بالینی و روش‌های تشخیص و AST. مشاهده منبع
9. CDC Antimicrobial Resistance Laboratory Resources؛ منابع آموزشی و شبکه آزمایشگاهی مرتبط با مقاومت ضد میکروبی. مشاهده منبع
10. WHO Laboratory Biosafety Manual، ویرایش چهارم؛ مرجع ایمنی زیستی، PPE، ضدعفونی، مدیریت پسماند و ارزیابی ریسک در آزمایشگاه. مشاهده منبع