روش انجام آزمایش فیبرینوژن؛ راهنمای روش دستی، نیمه‌اتوماتیک، اتوماتیک و کنترل کیفی

روش کار و اطلاعات فنی اختصاصی ارائه‌شده در این مقاله بر اساس کیت فیبرینوژن هموستیکا (Heamostica Fibrinogen Kit) تنظیم شده است.

آزمایش فیبرینوژن چیست و چه اهمیتی دارد؟

فیبرینوژن پروتئینی محلول در پلاسما است که در مرحله نهایی انعقاد، تحت اثر ترومبین به فیبرین تبدیل می‌شود. رشته‌های فیبرین شبکه اصلی لخته را تشکیل می‌دهند و در استحکام و پایداری لخته خون نقش اساسی دارند.

اندازه‌گیری فیبرینوژن در بررسی اختلالات خون‌ریزی‌دهنده، انعقاد داخل عروقی منتشر (DIC)، بیماری‌های کبدی، فیبرینولیز، التهاب و پایش بعضی شرایط بالینی کاربرد دارد. کاهش فیبرینوژن ممکن است ناشی از کاهش تولید، افزایش مصرف یا افزایش تجزیه آن باشد. در مقابل، فیبرینوژن به‌عنوان یک پروتئین فاز حاد در التهاب، عفونت و بعضی شرایط دیگر افزایش می‌یابد.

اندازه‌گیری فیبرینوژن به روش Clauss یک آزمایش عملکردی است؛ یعنی توانایی فیبرینوژن موجود در پلاسما برای تبدیل‌شدن به فیبرین را ارزیابی می‌کند.

اساس آزمایش فیبرینوژن به روش Clauss

در روش Clauss، مقدار بالایی ترومبین به پلاسمای سیتراته و رقیق‌شده اضافه می‌شود. ترومبین، فیبرینوژن موجود در نمونه را به فیبرین تبدیل می‌کند و زمان لازم برای تشکیل لخته اندازه‌گیری می‌شود.

میان زمان تشکیل لخته و غلظت فیبرینوژن رابطه معکوس وجود دارد:

• هرچه غلظت فیبرینوژن بیشتر باشد، زمان تشکیل لخته کوتاه‌تر است.
• هرچه غلظت فیبرینوژن کمتر باشد، زمان تشکیل لخته طولانی‌تر می‌شود.

غلظت فیبرینوژن نمونه با مقایسه زمان تشکیل لخته با منحنی کالیبراسیون تهیه‌شده از رقت‌های مختلف پلاسمای مرجع محاسبه می‌شود.

شرایط نمونه برای انجام آزمایش فیبرینوژن

نوع نمونه و ضدانعقاد مناسب

نمونه مناسب، پلاسمای فقیر از پلاکت (Platelet-Poor Plasma یا PPP) تهیه‌شده از خون وریدی حاوی سیترات سدیم ۳٫۲ درصد است.

نسبت خون به ضدانعقاد باید ۹ به ۱ باشد؛ یعنی ۹ حجم خون با ۱ حجم سیترات سدیم مخلوط شود.

از نمونه‌های حاوی ضدانعقادهای زیر نباید استفاده شود:

• EDTA
• هپارین
• اگزالات

بلافاصله پس از خون‌گیری، لوله باید به‌آرامی وارونه شود تا خون و سیترات کاملاً مخلوط شوند. تأخیر در مخلوط‌کردن نمونه ممکن است باعث تشکیل میکروکلات یا فعال‌شدن انعقاد شود.

سانتریفیوژ و تهیه پلاسمای کم‌پلاکت

برای تهیه پلاسمای فقیر از پلاکت:

• نمونه به مدت ۱۵ دقیقه در نیروی نسبی سانتریفیوژ ۲۰۰۰ تا ۲۵۰۰ g سانتریفیوژ شود.
• تعداد پلاکت‌های باقی‌مانده در پلاسما باید کمتر از ۱۰٬۰۰۰ در میکرولیتر باشد.
• هنگام برداشت پلاسما از نزدیک‌شدن نوک سمپلر به بافی‌کوت و لایه سلولی خودداری شود.
• برای انتقال و نگهداری پلاسما از ظروف پلاستیکی یا شیشه‌ای سیلیکونیزه استفاده شود.

انجماد پلاسمای حاوی سلول‌ها یا پلاکت‌های باقیمانده ممکن است پس از ذوب باعث آزادشدن اجزای غشایی و ایجاد اختلال در نتیجه آزمایش شود.

زمان انجام و شرایط نگهداری نمونه

نمونه منجمد باید پیش از آزمایش به‌طور کامل ذوب و سپس به‌آرامی مخلوط شود. از انجماد و ذوب مکرر نمونه خودداری شود.

معیارهای رد نمونه

نمونه در شرایط زیر باید رد یا با احتیاط ویژه بررسی شود:

• لوله کمتر از ۹۰ درصد حجم مورد انتظار پر شده باشد.
• در نمونه لخته یا رشته‌های فیبرین مشاهده شود.
• ضدانعقاد نامناسب استفاده شده باشد.
• نسبت خون به سیترات صحیح نباشد.
• خون و سیترات بلافاصله پس از نمونه‌گیری مخلوط نشده باشند.
• زمان یا شرایط نگهداری نمونه قابل قبول نباشد.
• پلاسما به مقدار زیاد با پلاکت یا سلول‌های خونی آلوده شده باشد.
• نمونه از مسیر وریدی حاوی هپارین گرفته شده باشد.
• همولیز، لیپمی، ایکتری یا کدورت شدید وجود داشته باشد.

نمونه‌های همولیز، لیپمیک، ایکتریک یا کدر ممکن است در تشخیص نقطه تشکیل لخته، به‌خصوص در کواگولومترهای اپتیکال، اختلال ایجاد کنند. شدت تداخل باید بر اساس فلگ‌های دستگاه و محدودیت‌های روش ارزیابی شود.

اصلاح حجم سیترات در هماتوکریت بالاتر از ۵۵ درصد

توصیه عمومی آزمایشگاهی: در هماتوکریت بالاتر از ۵۵ درصد، حجم پلاسما کاهش می‌یابد و مقدار معمول سیترات موجود در لوله نسبت به حجم پلاسما بیش از حد خواهد بود. سیترات اضافی می‌تواند باعث طولانی‌شدن کاذب زمان تشکیل لخته شود.

حجم سیترات مورد نیاز را می‌توان با فرمول زیر محاسبه کرد:

C = 1.85 × 10⁻³ × (100−Hct) × V

که در آن:

• C: حجم سیترات مورد نیاز بر حسب میلی‌لیتر
• Hct: هماتوکریت بر حسب درصد
• V: حجم خون مورد نظر بر حسب میلی‌لیتر

در صورت هماتوکریت بالاتر از ۵۵ درصد، نمونه‌گیری باید با لوله‌ای انجام شود که حجم سیترات آن متناسب با هماتوکریت بیمار اصلاح شده باشد.

معرف‌ها و تجهیزات مورد نیاز

محتویات کیت

کیت فیبرینوژن هموستیکا حاوی معرف ترومبین در بافر ایمیدازول است. معرف پیش از مصرف با آب مقطر بازسازی می‌شود.

مواد و تجهیزات مورد نیاز خارج از کیت

• دستگاه کواگولومتر برای روش نیمه‌اتوماتیک و اتوماتیک
• بن‌ماری برای روش دستی
• سمپلرهای کالیبره
• نوک سمپلر مناسب
• دستکش
• کرنومتر برای روش دستی
• آب مقطر
• بافر ایمیدازول
• لوله شیشه‌ای کاملاً تمیز برای روش دستی
• کووت سازگار با دستگاه
• ساچمه یا همزن مخصوص، در صورت نیاز دستگاه
• پلاسمای مرجع یا کالیبراتور دارای مقدار تعیین‌شده
• کنترل نرمال فیبرینوژن
• کنترل غیرطبیعی فیبرینوژن
• دماسنج کالیبره برای کنترل دمای بن‌ماری یا بلوک حرارتی

آماده‌سازی معرف فیبرینوژن

برای بازسازی معرف مراحل زیر را انجام دهید:

1. به هر ویال معرف، ۱ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
2. آب مقطر را به‌آرامی به دیواره داخلی ویال اضافه کنید تا از ایجاد کف جلوگیری شود.
3. ویال را به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق، معادل ۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد، قرار دهید.
4. پس از پایان زمان بازسازی، ویال را به‌آرامی بچرخانید تا محتویات آن کاملاً یکنواخت شود.
5. از تکان‌دادن شدید، استفاده از ورتکس یا ایجاد کف خودداری کنید.
6. درپوش پلاستیکی را روی ویال قرار دهید.
7. معرف بازسازی‌شده را در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.
8. معرف فقط هنگام انجام آزمایش از یخچال خارج و باز شود.
9. از آلوده‌کردن معرف با نوک سمپلر استفاده‌شده یا تماس مستقیم با نمونه جلوگیری شود.
10. معرف‌های دارای لات متفاوت با یکدیگر مخلوط نشوند.

مدت پایداری عددی معرف پس از بازسازی مشخص نشده است. بنابراین زمان مصرف معرف باید بر اساس اطلاعات درج‌شده روی بسته‌بندی، اطلاعات تکمیلی سازنده یا مطالعه پایداری داخلی آزمایشگاه تعیین شود.

آماده‌سازی و رقیق‌سازی نمونه

تهیه رقت معمول ۱:۱۰

پلاسمای بیمار باید با بافر ایمیدازول به نسبت ۱ به ۱۰ رقیق شود.

برای تهیه رقت استاندارد:

• ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای بیمار
• ۹۰۰ میکرولیتر بافر ایمیدازول

را در یک لوله تمیز مخلوط کنید. محلول حاصل، پلاسمای رقیق‌شده ۱:۱۰ است.

حجم‌های فوق مربوط به مرحله تهیه رقت هستند. حجم واکنش آزمایش در تمام روش‌ها فقط به‌صورت زیر است:

۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده + ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن

رقیق‌سازی نمونه‌های دارای فیبرینوژن بسیار بالا

اگر زمان تشکیل لخته نمونه با رقت ۱:۱۰ از زمان مربوط به رقت ۱:۵ پلاسمای مرجع کوتاه‌تر باشد:

1. نمونه را با بافر ایمیدازول به نسبت ۱:۳۰ رقیق کنید.
2. آزمایش را مجدداً انجام دهید.
3. نتیجه خوانده‌شده از منحنی کالیبراسیون را در ۳ ضرب کنید.

مثال:

اگر نتیجه خوانده‌شده از منحنی برای نمونه با رقت ۱:۳۰ برابر ۱۸۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر باشد:

180 × 3 = 540 mg/dL

نتیجه نهایی برابر ۵۴۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر یا ۵٫۴ گرم بر لیتر است.

رقیق‌سازی نمونه‌های دارای فیبرینوژن بسیار پایین

اگر زمان تشکیل لخته نمونه با رقت ۱:۱۰ از زمان مربوط به رقت ۱:۳۰ پلاسمای مرجع طولانی‌تر باشد:

1. نمونه را با بافر ایمیدازول به نسبت ۱:۳ رقیق کنید.
2. آزمایش را مجدداً انجام دهید.
3. نتیجه خوانده‌شده از منحنی کالیبراسیون را در ۰٫۳ ضرب کنید.

مثال:

اگر نتیجه خوانده‌شده از منحنی برای نمونه با رقت ۱:۳ برابر ۲۴۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر باشد:

240 × 0.3 = 72 mg/dL

نتیجه نهایی برابر ۷۲ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر یا ۰٫۷۲ گرم بر لیتر است.

از رقت‌های کمتر از ۱:۳ استفاده نشود؛ زیرا در رقت‌های کمتر، مهارکننده‌های موجود در نمونه ممکن است اثر بیشتری بر واکنش داشته باشند و باعث ایجاد نتیجه غیرقابل‌اعتماد شوند.

اگر زمان تشکیل لخته نمونه با رقت ۱:۳ نیز از طولانی‌ترین زمان منحنی کالیبراسیون بیشتر باشد، نتیجه باید به‌صورت «کمتر از پایین‌ترین غلظت قابل گزارش» اعلام شود. در چنین شرایطی نباید با ادامه منحنی یا برون‌یابی، یک نتیجه عددی ساخته شود.

روش انجام دستی آزمایش فیبرینوژن

1. پلاسمای بیمار را با بافر ایمیدازول به نسبت ۱:۱۰ رقیق کنید.
2. آزمایش را در لوله شیشه‌ای کاملاً تمیز انجام دهید. وجود مواد شوینده، رطوبت یا آلودگی در لوله ممکن است بر تشکیل لخته اثر بگذارد.
3. دمای بن‌ماری را در محدوده ۳۶ تا ۳۸ درجه سانتی‌گراد تنظیم کنید.
4. مقدار ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده را داخل لوله بریزید.
5. پلاسمای رقیق‌شده را به مدت ۲ تا ۳ دقیقه در بن‌ماری انکوبه کنید.
6. مقدار ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن را به نمونه اضافه کنید.
7. هم‌زمان با افزودن معرف، کرنومتر را شروع کنید.
8. محتویات لوله را سریع و یکنواخت مخلوط کنید.
9. لوله را به‌صورت متوالی کج کنید و حرکت مایع را زیر نظر داشته باشید.
10. به‌محض تشکیل لخته و متوقف‌شدن حرکت آزاد مایع، کرنومتر را متوقف کنید.
11. زمان تشکیل لخته را با دقت ۰٫۱ ثانیه ثبت کنید.
12. غلظت فیبرینوژن را از روی منحنی کالیبراسیون معتبر بخوانید.
13. اگر نمونه با رقت ۱:۱۰ آزمایش شده است، نتیجه مستقیماً از منحنی خوانده می‌شود.
14. اگر نمونه با رقت ۱:۳۰ آزمایش شده است، نتیجه خوانده‌شده در ۳ ضرب شود.
15. اگر نمونه با رقت ۱:۳ آزمایش شده است، نتیجه خوانده‌شده در ۰٫۳ ضرب شود.

روش دستی به مهارت کاربر، زمان شروع کرنومتر و نحوه تشخیص چشمی لخته وابسته است. نمونه‌های غیرطبیعی، مرزی یا دارای اختلاف با وضعیت بیمار بهتر است در تکرار آزمایش شوند.

روش انجام آزمایش فیبرینوژن با دستگاه نیمه‌اتوماتیک

1. دستگاه را روشن کنید و از آماده‌بودن سیستم اندازه‌گیری و دمای بلوک حرارتی اطمینان حاصل کنید.
2. برنامه Fibrinogen یا Clauss Fibrinogen را انتخاب کنید.
3. اطمینان حاصل کنید که منحنی کالیبراسیون معتبر است.
4. کنترل‌های نرمال و غیرطبیعی را اجرا کنید و فقط در صورت پذیرش کنترل‌ها آزمایش بیماران را ادامه دهید.
5. کووت سازگار با دستگاه را در محل انکوباسیون قرار دهید.
6. در صورت نیاز دستگاه، ساچمه یا همزن مخصوص را داخل کووت قرار دهید.
7. پلاسمای بیمار را با بافر ایمیدازول به نسبت ۱:۱۰ رقیق کنید.
8. مقدار ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده را داخل کووت بریزید.
9. نمونه را به مدت ۲ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
10. مقدار ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن را به کووت اضافه کنید.
11. معرف را سریع و بدون ایجاد حباب اضافه کنید.
12. در دستگاه‌هایی که زمان‌گیری با افزودن معرف آغاز می‌شود، اجازه دهید دستگاه به‌طور خودکار زمان تشکیل لخته را ثبت کند.
13. در دستگاه‌هایی که شروع واکنش نیازمند فرمان دستی است، افزودن معرف و شروع برنامه باید هم‌زمان انجام شود.
14. نتیجه را از نظر فلگ، خطای تشخیص لخته، کمبود حجم، حباب، زمان خارج از منحنی و خطای اپتیکال بررسی کنید.
15. در صورت خارج‌بودن زمان از منحنی، نمونه را با رقت مناسب ۱:۳۰ یا ۱:۳ تکرار و ضریب مربوط را اعمال کنید.

نوع کووت، استفاده از ساچمه، حساسیت تشخیص لخته، زمان تأخیر و سایر تنظیمات ممکن است میان دستگاه‌های مختلف متفاوت باشد. این پارامترها باید برای مدل دستگاه مورد استفاده بررسی و اعتبارسنجی شوند.

روش انجام آزمایش فیبرینوژن با دستگاه اتوماتیک

برنامه اختصاصی آزمایش باید برای مدل دستگاه مورد استفاده تعریف و اعتبارسنجی شود. مراحل کلی عبارت‌اند از:

1. آزمون را به‌عنوان Clauss Fibrinogen و با روش تشخیص لخته تعریف کنید.
2. نوع نمونه را «پلاسمای سیتراته» انتخاب کنید.
3. نام معرف، شماره لات، تاریخ انقضا و تاریخ بازسازی را در نرم‌افزار وارد کنید.
4. رقت معمول نمونه را ۱:۱۰ با بافر ایمیدازول تعریف کنید.
5. رقیق‌سازی می‌تواند خارج از دستگاه یا با سیستم رقیق‌کننده دستگاه انجام شود.
6. حجم برداشت مرحله واکنش را روی ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده تنظیم کنید.
7. حجم معرف را روی ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن تنظیم کنید.
8. دمای واکنش را روی ۳۷ درجه سانتی‌گراد تنظیم کنید.
9. زمان انکوباسیون اولیه را ۲ دقیقه در نظر بگیرید و این زمان را برای دستگاه مورد استفاده اعتبارسنجی کنید.
10. منحنی کالیبراسیون پنج‌نقطه‌ای را در نرم‌افزار تعریف کنید.
11. حداقل دو سطح کنترل، شامل کنترل نرمال و غیرطبیعی، تعریف شود.
12. محدوده قابل گزارش بر اساس منحنی کالیبراسیون جاری تعیین شود.
13. نتیجه هر نمونه از نظر فلگ عدم تشکیل لخته، زمان خارج از محدوده، خطای پیپتینگ، حباب، کمبود حجم، کدورت و خطای اپتیکال بررسی شود.
14. نمونه‌های خارج از محدوده با رقت مناسب تکرار شوند.
15. برنامه دستگاه پس از تغییر لات معرف، تغییر کالیبراتور یا تغییر مهم در تنظیمات مجدداً بررسی شود.

اگر رقیق‌سازی داخل دستگاه انجام می‌شود، مقدار پلاسمای اولیه و بافر مصرفی ممکن است به مدل دستگاه وابسته باشد؛ اما حجم واردشده به واکنش نهایی باید معادل ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده + ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن باشد.

محاسبه و گزارش نتیجه آزمایش فیبرینوژن

تهیه نقاط منحنی کالیبراسیون

پلاسمای مرجع دارای مقدار تعیین‌شده در پنج رقت زیر آماده می‌شود:

رقت ۱:۱۰ پلاسمای مرجع نشان‌دهنده ۱۰۰ درصد غلظت تعیین‌شده کالیبراتور است.

اگر مقدار تعیین‌شده پلاسمای مرجع ۳۰۴ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر باشد، غلظت نقاط منحنی به‌صورت زیر محاسبه می‌شود:

در یک نمونه منحنی، زمان‌های متناظر با این نقاط می‌توانند به‌ترتیب ۱۰، ۱۸، ۲۵، ۳۲ و ۴۴٫۸ ثانیه باشند. این زمان‌ها صرفاً یک مثال هستند و نباید به‌عنوان زمان ثابت برای تمام لات‌ها استفاده شوند.

منحنی کالیبراسیون به‌صورت لگاریتمی رسم می‌شود:

• محور X: غلظت فیبرینوژن بر حسب mg/dL
• محور Y: زمان تشکیل لخته بر حسب ثانیه

زمان هر نقطه باید با دقت ۰٫۱ ثانیه اندازه‌گیری شود. نتیجه بیمار فقط زمانی قابل محاسبه است که زمان تشکیل لخته آن داخل محدوده منحنی کالیبراسیون جاری قرار داشته باشد.

در زیر یک نمونه از منحنی کالیبراسیون فیبرینوژن را مشاهده می کنید:

روش انجام آزمایش فیبرینوژن

مثال محاسبه نتیجه بیمار

اگر نمونه بیمار با رقت ۱:۱۰ دارای زمان تشکیل لخته ۲۵ ثانیه باشد و این زمان روی منحنی جاری معادل ۲۰۴ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر باشد، نتیجه به‌صورت زیر گزارش می‌شود:

Fibrinogen = 204 mg/dL

برای تبدیل میلی‌گرم بر دسی‌لیتر به گرم بر لیتر:

204 ÷ 100 = 2.04 g/L

زیرا:

1 g/L = 100 mg/dL

اعمال ضریب رقت

• رقت ۱:۱۰: نتیجه مستقیماً از منحنی خوانده می‌شود.
• رقت ۱:۳۰: نتیجه خوانده‌شده در ۳ ضرب می‌شود.
• رقت ۱:۳: نتیجه خوانده‌شده در ۰٫۳ ضرب می‌شود.

رقت انجام‌شده، ضریب اعمال‌شده و نتیجه نهایی باید در برگه کار یا نرم‌افزار آزمایشگاه ثبت شوند.

از گزارش عددی نتایج خارج از منحنی خودداری شود. این نتایج باید پس از رقیق‌سازی مناسب تکرار یا به‌صورت «کمتر از» یا «بیشتر از» حد قابل گزارش اعلام شوند.

نمونه کامنت برای گزارش آزمایش فیبرینوژن

کامنت گزارش باید فقط در صورت انجام واقعی رقت یا قرارگرفتن نتیجه خارج از محدوده قابل گزارش استفاده شود و جایگزین نتیجه عددی معتبر نیست.

محدوده مرجع و محدوده اندازه‌گیری

محدوده مرجع بزرگسالان

محدوده مرجع فیبرینوژن برای این روش عبارت است از:

۱۵۰ تا ۳۵۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر

معادل:

۱٫۵ تا ۳٫۵ گرم بر لیتر

محدوده مرجع ممکن است تحت تأثیر جمعیت مراجعه‌کننده، روش تشخیص لخته، دستگاه، لات معرف و شرایط آزمایشگاه قرار گیرد. بنابراین هر آزمایشگاه باید این محدوده را برای جمعیت و سیستم اندازه‌گیری خود بررسی یا تأیید کند.

زمان معمول تشکیل لخته برای پلاسمای نرمال در کواگولومتر حدود ۸ تا ۱۰ ثانیه است. این زمان، محدوده مرجع غلظت فیبرینوژن نیست و نباید به‌جای mg/dL یا g/L گزارش شود.

محدوده اندازه‌گیری

محدوده عملی اندازه‌گیری به پایین‌ترین و بالاترین غلظت موجود در منحنی کالیبراسیون جاری وابسته است.

در مثال پلاسمای مرجع ۳۰۴ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر، نقاط منحنی از ۱۰۰ تا ۶۰۸ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر قرار می‌گیرند. این محدوده فقط مربوط به کالیبراتور مثال است و نباید به‌عنوان محدوده ثابت تمام لات‌ها در نظر گرفته شود.

استفاده از رقت‌های ۱:۳ و ۱:۳۰ می‌تواند محدوده قابل گزارش را گسترش دهد، اما محدوده نهایی باید بر اساس موارد زیر تعیین شود:

• مقدار تعیین‌شده کالیبراتور
• منحنی کالیبراسیون جاری
• عملکرد دستگاه
• صحت رقیق‌سازی
• مطالعه اعتبارسنجی آزمایشگاه

محدوده مرجع با محدوده اندازه‌گیری تفاوت دارد. محدوده مرجع وضعیت مورد انتظار در افراد سالم را نشان می‌دهد، در حالی که محدوده اندازه‌گیری توانایی تحلیلی روش برای اندازه‌گیری نتایج را مشخص می‌کند.

کنترل کیفی آزمایش فیبرینوژن

برای اطمینان از صحت و تکرارپذیری نتایج باید حداقل دو سطح کنترل استفاده شود:

• کنترل نرمال
• کنترل غیرطبیعی، ترجیحاً در محدوده پایین فیبرینوژن

کنترل‌ها باید مطابق دستورالعمل اختصاصی همان محصول آماده شوند. کنترل‌های مورد استفاده در این روش به‌صورت رقیق‌نشده آزمایش می‌شوند؛ با این حال، نحوه بازسازی و آماده‌سازی نهایی باید با دستورالعمل کنترل و برنامه دستگاه تطبیق داده شود.

زمان اجرای کنترل‌ها

کنترل‌ها در شرایط زیر اجرا شوند:

• در ابتدای سری کاری یا شیفت
• پس از بازسازی معرف
• پس از بازکردن ویال جدید
• پس از تغییر لات معرف
• پس از تغییر لات کالیبراتور
• پس از تهیه منحنی کالیبراسیون جدید
• پس از تعمیر یا سرویس دستگاه
• پس از تعویض قطعات مؤثر بر سیستم اندازه‌گیری
• پس از مشاهده نتایج غیرمنتظره بیماران
• پس از مشاهده روند یا شیفت در نتایج کنترل
• پس از بروز خطای دما، پیپتینگ یا آلودگی احتمالی

فراوانی نهایی کنترل باید بر اساس حجم کار، پایداری سیستم، ارزیابی ریسک و برنامه کنترل کیفی آزمایشگاه تعیین شود.

نمودار Levey–Jennings

نتایج هر سطح کنترل باید روی نمودار Levey–Jennings ثبت شود. برای هر کنترل، میانگین، انحراف معیار و ضریب تغییرات محاسبه شود:

$$
CV\% = \frac{SD}{Mean} \times 100
$$

نمودار باید از نظر موارد زیر بررسی شود:

• خروج یک نتیجه از حدود کنترل
• ایجاد روند افزایشی یا کاهشی
• ایجاد شیفت ناگهانی
• افزایش پراکندگی نتایج
• اختلاف غیرعادی میان دو سطح کنترل

قوانین Westgard

قوانین Westgard باید متناسب با تعداد کنترل‌ها و فراوانی اجرای آن‌ها انتخاب شوند. قوانین متداول شامل موارد زیر هستند:

• 1_2s: هشدار
• 1_3s: رد سری
• 2_2s: احتمال خطای سیستماتیک
• R_4s: احتمال خطای تصادفی
• 4_1s: وجود شیفت یا خطای سیستماتیک
• 10_x: قرارگرفتن متوالی نتایج در یک سمت میانگین

قانون 1_2s بهتر است به‌عنوان هشدار استفاده شود و به‌تنهایی باعث رد سری نشود. انتخاب قوانین باید با عملکرد واقعی روش و هدف کیفی آزمایشگاه متناسب باشد.

برخورد با کنترل خارج از محدوده

در صورت خارج‌بودن کنترل از محدوده:

1. گزارش نتایج بیماران را متوقف کنید.
2. شماره لات، تاریخ انقضا، مقدار هدف و اطلاعات واردشده در دستگاه را بررسی کنید.
3. وضعیت بازسازی و نگهداری معرف و کنترل را بررسی کنید.
4. کنترل را از نظر آلودگی، لخته، تبخیر یا یکنواخت‌نبودن بررسی کنید.
5. دمای انکوباسیون را کنترل کنید.
6. عملکرد سمپلر، کووت، ساچمه و سیستم تشخیص لخته را بررسی کنید.
7. وجود حباب یا کمبود حجم را بررسی کنید.
8. پس از شناسایی و رفع علت احتمالی، کنترل را تکرار کنید.
9. در صورت باقی‌ماندن خطا، از کنترل تازه یا ویال معرف جدید استفاده کنید.
10. در صورت لزوم، منحنی کالیبراسیون جدید تهیه کنید.
11. پس از پذیرش کنترل، نتایج بیماران از آخرین کنترل پذیرفته‌شده بازبینی شوند.
12. علت خطا، اقدام اصلاحی، نتیجه بررسی و اقدام پیشگیرانه مستند شود.

تکرار مداوم کنترل بدون بررسی علت و انتخاب یک نتیجه قابل‌قبول از میان تکرارها مجاز نیست. تا زمان شناسایی و رفع علت عدم پذیرش کنترل، نتایج بیماران نباید گزارش شوند.

داده‌های دقت روش

CV درون‌سری برای سه سطح نمونه در محدوده ۰٫۶۹ تا ۰٫۸۳ درصد و CV بین‌سری در محدوده ۰٫۸۹ تا ۱٫۳۶ درصد گزارش شده است.

این مقادیر نشان‌دهنده عملکرد ارزیابی‌شده روش هستند و نباید مستقیماً به‌عنوان حدود پذیرش روزانه کنترل استفاده شوند. حدود پذیرش روزانه باید بر اساس مقدار هدف کنترل، داده‌های تجمعی آزمایشگاه و هدف کیفی روش تعیین شوند.

کالیبراسیون آزمایش فیبرینوژن

منحنی کالیبراسیون با پنج رقت پلاسمای مرجع تهیه می‌شود:

• ۱:۵
• ۱:۱۰
• ۱:۱۵
• ۱:۲۰
• ۱:۳۰

غلظت هر نقطه با ضرب مقدار تعیین‌شده پلاسمای مرجع در ضریب مربوط محاسبه می‌شود. زمان هر رقت با دقت ۰٫۱ ثانیه اندازه‌گیری و منحنی لگاریتمی غلظت در برابر زمان رسم می‌شود.

بررسی منحنی کالیبراسیون

منحنی باید از نظر موارد زیر بررسی شود:

• کاهش زمان با افزایش غلظت فیبرینوژن
• ترتیب منطقی نقاط
• نبود نقطه پرت
• نبود خطای آشکار پیپتینگ
• پوشش محدوده مورد نیاز
• پذیرش کنترل‌های نرمال و غیرطبیعی
• تطابق منحنی با محدودیت‌های نرم‌افزار دستگاه

موارد نیازمند کالیبراسیون جدید

• تغییر لات معرف
• تغییر لات کالیبراتور
• تغییر عمده در برنامه دستگاه
• تعمیر یا سرویس مؤثر بر سیستم اندازه‌گیری
• عدم پذیرش مداوم کنترل‌ها
• مشاهده شیفت پایدار در نتایج کنترل
• پایان اعتبار منحنی در نرم‌افزار دستگاه
• تغییر مهم در کووت، سیستم تشخیص یا شرایط واکنش

کالیبراتور برای ایجاد رابطه میان زمان تشکیل لخته و غلظت فیبرینوژن استفاده می‌شود. کنترل برای پایش مستقل صحت این رابطه است. بنابراین کنترل کیفی جایگزین کالیبراسیون نیست و کالیبراتور نیز نباید به‌جای کنترل روزانه استفاده شود.

علل خطا و نتایج غیرقابل‌اعتماد

الگوریتم عملی بررسی نتیجه آزمایش فیبرینوژن

مسیر تصمیم‌گیری کارشناس باید از پذیرش نمونه آغاز شود و پس از تأیید کنترل کیفی، بررسی قرارگرفتن زمان نمونه در منحنی و اعمال ضریب رقت به گزارش نهایی برسد.

1. بررسی نوع نمونه، حجم لوله، وجود لخته و هماتوکریت
2. بررسی آماده‌سازی معرف، رقت ۱:۱۰ و دمای واکنش
3. تأیید اعتبار منحنی کالیبراسیون و پذیرش دو سطح کنترل
4. اجرای آزمایش با حجم ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده + ۱۰۰ میکرولیتر معرف
5. بررسی فلگ‌ها و قرارگرفتن زمان تشکیل لخته داخل منحنی
6. تکرار با رقت ۱:۳۰ برای نتیجه بسیار بالا یا رقت ۱:۳ برای نتیجه بسیار پایین
7. اعمال ضریب رقت، تأیید واحد و گزارش نتیجه یا گزارش حدی

چک‌لیست اجرای صحیح آزمایش فیبرینوژن

• نمونه در سیترات سدیم ۳٫۲ درصد جمع‌آوری شده است.
• نسبت خون به سیترات ۹ به ۱ است.
• حجم لوله حداقل ۹۰ درصد حجم مورد انتظار است.
• نمونه فاقد لخته و رشته‌های فیبرین است.
• در هماتوکریت بالاتر از ۵۵ درصد، حجم سیترات اصلاح شده است.
• پلاسمای فقیر از پلاکت با سانتریفیوژ ۱۵ دقیقه در ۲۰۰۰ تا ۲۵۰۰ g تهیه شده است.
• زمان و شرایط نگهداری نمونه قابل قبول است.
• معرف با ۱ میلی‌لیتر آب مقطر بازسازی شده است.
• معرف ۳۰ دقیقه در دمای ۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد قرار گرفته است.
• معرف به‌آرامی مخلوط شده و فاقد کف یا آلودگی است.
• رقت معمول پلاسما ۱:۱۰ با بافر ایمیدازول تهیه شده است.
• دمای واکنش صحیح است.
• حجم واکنش فقط ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده + ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن است.
• منحنی کالیبراسیون معتبر است.
• کنترل نرمال پذیرفته شده است.
• کنترل غیرطبیعی پذیرفته شده است.
• زمان نمونه داخل منحنی کالیبراسیون قرار دارد.
• ضریب رقت غیرمعمول به‌درستی اعمال شده است.
• فلگ‌ها و اختلاف تکرارها بررسی شده‌اند.
• واحد گزارش mg/dL یا g/L به‌درستی ثبت شده است.
• نتیجه پیش از گزارش نهایی تأیید شده است.

نکات کلیدی روش انجام آزمایش فیبرینوژن

• روش Clauss بر اندازه‌گیری زمان تشکیل لخته پس از افزودن ترومبین با غلظت بالا به پلاسمای رقیق‌شده استوار است.
• میان زمان تشکیل لخته و غلظت فیبرینوژن رابطه معکوس وجود دارد.
• نمونه مناسب، پلاسمای کم‌پلاکت تهیه‌شده از خون سیتراته ۳٫۲ درصد است.
• نسبت خون به سیترات باید ۹ به ۱ باشد.
• رقت معمول نمونه ۱:۱۰ با بافر ایمیدازول است.
• حجم واکنش در روش دستی، نیمه‌اتوماتیک و اتوماتیک فقط ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمای رقیق‌شده + ۱۰۰ میکرولیتر معرف فیبرینوژن است.
• نمونه‌های دارای فیبرینوژن بسیار بالا با رقت ۱:۳۰ آزمایش و نتیجه آن‌ها در ۳ ضرب می‌شود.
• نمونه‌های دارای فیبرینوژن بسیار پایین با رقت ۱:۳ آزمایش و نتیجه آن‌ها در ۰٫۳ ضرب می‌شود.
• نتیجه خارج از منحنی کالیبراسیون نباید با برون‌یابی عددی گزارش شود.
• محدوده مرجع روش ۱۵۰ تا ۳۵۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر است و باید در هر آزمایشگاه تأیید شود.
• محدوده اندازه‌گیری به منحنی کالیبراسیون جاری وابسته است.
• تا زمان پذیرش کنترل‌های کیفی، نتایج بیماران نباید گزارش شوند.
• برنامه روش اتوماتیک باید برای مدل دستگاه، معرف و حجم واکنش تعیین‌شده اعتبارسنجی شود.

مطالب تکمیلی آزمایشگاهی در هموستیکا

مقالات زیر موضوعات تکمیلی هماتولوژی، مورفولوژی، شمارش سلولی، ایمونوهماتولوژی و کنترل کیفی را پوشش می‌دهند و برای مطالعه بیشتر کارشناسان آزمایشگاه در دسترس هستند.

سؤالات رایج درباره روش انجام آزمایش فیبرینوژن

پاسخ‌های زیر مستقیماً به پرسش‌های عملی کارشناسان درباره نمونه، رقت، حجم واکنش، محاسبه، کنترل کیفی و خطاهای آزمایش فیبرینوژن پاسخ می‌دهند.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

برای مطالعه دقیق‌تر روش Clauss، الزامات پیش‌تحلیلی آزمایش‌های انعقادی، کنترل کیفی آماری و بررسی محدوده مرجع می‌توانید از منابع زیر استفاده کنید.