روش تهیه محلول متیل رد برای آزمون MR طبق فرمول FDA شامل حل‌کردن ۰٫۱۰ گرم متیل رد در ۳۰۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵ درصد و رساندن حجم نهایی به ۵۰۰ میلی‌لیتر با آب مقطر است. غلظت این معرف ۰٫۰۲ درصد وزنی‌ـ‌حجمی است و نباید با محلول ۰٫۱ درصد اشتباه شود؛ مصرف آن به تأیید کنترل کیفیت نیاز دارد.

مقدمه؛ روش تهیه محلول متیل رد برای چه کاربردی است؟

محلول متیل رد یکی از شناساگرهای پرکاربرد اسید و باز است که در شیمی تجزیه و آزمون‌های بیوشیمیایی میکروبیولوژی استفاده می‌شود.روش تهیه محلول متیل رد، تنها به حل‌کردن پودر در حلال محدود نیست؛ انتخاب غلظت مناسب، رعایت حجم نهایی، کنترل عملکرد و ثبت شرایط نگهداری نیز بر اعتبار نتیجه اثر می‌گذارند.

متیل رد چیست و چگونه تغییر رنگ می‌دهد؟

متیل رد (Methyl Red) یک شناساگر اسید و باز است. شکل اسیدی و بازی این ترکیب رنگ‌های متفاوتی دارند؛ به همین دلیل، تغییر pH محیط می‌تواند باعث تغییر رنگ آن شود.

رفتار شناساگر را می‌توان به‌صورت ساده چنین نمایش داد:

HIn ⇌ H⁺ + In⁻

با افزایش اسیدیته، سهم شکل اسیدی بیشتر می‌شود و با کاهش اسیدیته، شکل بازی غلبه می‌کند. در مشخصات محلول ۰٫۱ درصد اتانولی Thermo Fisher، محدوده تغییر رنگ از حدود pH برابر ۴٫۲ با رنگ صورتی تا ۶٫۲ با رنگ زرد گزارش شده است. محدوده دقیق اعلام‌شده باید از مشخصات همان فرآورده یا روش مرجع خوانده شود.

منبع: Thermo Fisher؛ مشخصات محلول متیل رد ۰٫۱ درصد

تغییر رنگ متیل رد، اندازه‌گیری دقیق pH محسوب نمی‌شود. هرجا مقدار عددی pH برای تصمیم‌گیری اهمیت دارد، باید از روش اندازه‌گیری مناسب، مانند pH‌متر کالیبره، استفاده شود.

تفاوت محلول متیل رد ۰٫۰۲ درصد و ۰٫۱ درصد چیست؟

پیش از تهیه، کاربرد محلول را مشخص کنید. دو فرمول زیر را نباید به‌جای یکدیگر به کار برد:

فرمول اول در دستور تهیه معرف متیل رد FDA آمده است. فرمول دوم در راهنمای Merck برای شناساگر متیل رد درج شده است. انتخاب بین آن‌ها باید براساس روش آزمون باشد.

منبع: FDA؛ دستور تهیه معرف متیل رد، BAM R44

منبع: Merck؛ راهنمای شناساگرها و فرمول تهیه متیل رد

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای تهیه معرف متیل رد

برای تهیه فرمول FDA، مواد اصلی شامل پودر متیل رد، اتانول ۹۵ درصد و آب مقطر است. تجهیزات پیشنهادی برای اجرای دقیق و قابل ردیابی عبارت‌اند از:

• ترازوی مناسب برای مقدار توزین مورد نظر؛
• ظرف توزین، اسپاتول و بشر تمیز؛
• وسیله مناسب اندازه‌گیری حجم اتانول؛
• بالن ژوژه متناسب با حجم نهایی؛
• همزن یا میله شیشه‌ای؛
• بطری سازگار با محلول، ترجیحاً تیره و دارای درپوش محکم؛
• برچسب و فرم ثبت ساخت معرف؛
• روپوش، عینک ایمنی و دستکش متناسب با ارزیابی خطر.

پیش از شروع، نام ماده، شکل شیمیایی و مشخصات حلال را بررسی کنید. استفاده از متیل رد، نمک سدیم متیل رد یا الکل با ترکیب نامشخص، بدون تطبیق با روش مرجع، می‌تواند فرمول را تغییر دهد.

روش تهیه محلول متیل رد برای آزمون MR؛ مرحله‌به‌مرحله

فرمول مرجع محلول متیل رد برای ۵۰۰ میلی‌لیتر

مراحل ساخت معرف متیل رد

۱. مقدار ۰٫۱۰ گرم متیل رد را توزین کنید.

۲. پودر را در ۳۰۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵ درصد حل کنید.

۳. محلول را به ظرف حجم‌سنج مناسب منتقل کنید.

۴. با آب مقطر، حجم نهایی را به ۵۰۰ میلی‌لیتر برسانید.

۵. محلول را به‌خوبی مخلوط کنید.

این ترکیب و ترتیب حل‌کردن، مطابق دستور FDA BAM R44 است. «رساندن به حجم نهایی» با افزودن یک حجم ثابت آب تفاوت دارد؛ ملاک، حجم نهایی محلول است.

منبع: FDA؛ دستور تهیه معرف متیل رد، BAM R44

پس از تهیه، محلول را در بطری مناسب بریزید، برچسب بزنید و تا تأیید کنترل کیفیت، آن را برای مصرف روتین آزاد نکنید.

محاسبه غلظت متیل رد و تغییر مقیاس ساخت

درصد وزنی‌ـ‌حجمی نشان می‌دهد چند گرم ماده در هر ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول نهایی وجود دارد:

درصد وزنی‌ـ‌حجمی = ۱۰۰ × جرم ماده برحسب گرم ÷ حجم نهایی برحسب میلی‌لیتر

بنابراین:

۱۰۰ × ۰٫۱۰ ÷ ۵۰۰ = ۰٫۰۲ درصد

برای تغییر مقیاس، همه مقادیر را در نسبت حجم جدید به حجم مرجع ضرب کنید. برای نمونه، ضریب تبدیل از ۵۰۰ به ۲۵۰ میلی‌لیتر، برابر ۰٫۵ است.

این جدول، محاسبه مقیاس از فرمول مرجع است. پیش از ساخت حجم‌های کم، حداقل وزن قابل قبول ترازوی آزمایشگاه را بررسی کنید؛ خوانایی نمایشگر به‌تنهایی تضمین نمی‌کند که توزین ۲۰ میلی‌گرم با عدم قطعیت مناسب انجام می‌شود.

روش تهیه محلول متیل رد ۰٫۱ درصد اتانولی

در راهنمای Merck، برای تهیه این شناساگر، ۰٫۱ گرم متیل رد در ۱۰۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۶ درصد ذکر شده است. همچنین همان منبع، برای نمک سدیم متیل رد، فرمول آبی جداگانه ارائه می‌کند. بنابراین، نوع ماده و حلال باید دقیقاً با دستور مورد استفاده تطبیق داشته باشد.

منبع: Merck؛ راهنمای شناساگرها و فرمول تهیه متیل رد

کنترل کیفیت محلول متیل رد چگونه انجام می‌شود؟

کنترل کیفیت باید دو پرسش را پاسخ دهد: آیا محلول درست ساخته شده است و آیا در کاربرد مورد نظر عملکرد قابل قبول دارد؟

۱. بررسی سوابق ساخت و ظاهر محلول

به‌عنوان کنترل‌های پیشنهادی هنگام پذیرش بچ، موارد زیر را بررسی کنید:

• تطابق جرم‌ها، حجم‌ها و مواد مصرفی با دستور ساخت؛
• ثبت شماره بچ مواد اولیه؛
• حل‌شدن ماده و نبود ذرات یا رسوب غیرمنتظره؛
• سلامت بطری، درپوش و برچسب؛
• نبود نشانه‌های آلودگی یا تبخیر قابل توجه.

مشاهده ظاهر قابل قبول، جایگزین آزمون عملکرد نیست.

۲. بررسی پاسخ رنگی شناساگر

برای ارزیابی آموزشی یا کنترل داخلی، می‌توان پاسخ معرف را در محلول‌های مرجع با pH معلوم، در دو سوی محدوده تغییر رنگ بررسی کرد. حجم نمونه، مقدار معرف، شرایط مشاهده و معیار پذیرش باید در دستور کار داخلی تعریف شوند.

این بررسی، یک پیشنهاد برای طراحی کنترل داخلی است و نباید بدون تطبیق، به‌عنوان آزمون رسمی پذیرش یک استاندارد معرفی شود.

۳. کنترل عملکرد متیل رد در آزمون میکروبیولوژی

در دستور مصرف Remel، Escherichia coli ATCC 25922 به‌عنوان کنترل مثبت و Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 به‌عنوان کنترل منفی معرفی شده‌اند. اگر کنترل کیفیت نتیجه غیرمنتظره داشته باشد، نتایج نمونه‌ها نباید گزارش شوند. انتخاب سویه‌ها و تناوب کنترل باید با روش مصوب آزمایشگاه هماهنگ باشد.

منبع: Remel؛ دستور مصرف، تفسیر و کنترل کیفیت متیل رد

کاربرد محلول متیل رد در آزمون MR و تفسیر رنگ‌ها

آزمون MR برای بررسی الگوی تولید اسید حاصل از مصرف گلوکز در باکتری‌ها استفاده می‌شود. در این آزمون، معرف به محیط کشت مربوط اضافه می‌شود و رنگ حاصل، بخشی از شواهد شناسایی بیوشیمیایی را فراهم می‌کند.

منبع: Sigma-Aldrich؛ اطلاعات فنی معرف متیل رد 08714

برای نمونه، دستور Remel افزودن ۱ تا ۲ قطره معرف به ۱ میلی‌لیتر از کشت انکوبه‌شده در MR-VP broth و مشاهده فوری رنگ را بیان می‌کند:

حجم محیط، تعداد قطره و زمان انکوباسیون را از یک دستور واحد بردارید. Remel همچنین گزارش می‌کند که حجم بیش از حد محیط می‌تواند با واکنش نارنجی همراه باشد.

منبع: Remel؛ دستور مصرف، تفسیر و کنترل کیفیت متیل رد

خطاهای رایج در تهیه محلول متیل رد و راه بررسی آن‌ها

جدول زیر مسیر بررسی مشکلات معرف و آزمون را نشان می‌دهد؛ هر علامت به‌تنهایی علت خرابی را ثابت نمی‌کند.

این جدول یک مسیر بررسی است؛ هر علامت به‌تنهایی علت خرابی را ثابت نمی‌کند.

نگهداری محلول متیل رد و تعیین تاریخ مصرف

برای مثال، Remel برای محصول آماده خود نگهداری در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و محافظت از نور را توصیه می‌کند. این دستور، مربوط به همان محصول است و نباید خودکار به همه فرمول‌های دست‌ساز تعمیم داده شود.

منبع: Remel؛ دستور مصرف، تفسیر و کنترل کیفیت متیل رد

برچسب پیشنهادی معرف شامل این اطلاعات است:

• نام محلول، غلظت و حلال؛
• کد فرمول یا روش مرجع؛
• شماره بچ داخلی؛
• تاریخ تهیه و تاریخ بازآزمایی یا انقضای مصوب؛
• شرایط نگهداری؛
• نام تهیه‌کننده و تأییدکننده؛
• هشدارهای متناسب با ترکیب محلول.

نکات ایمنی هنگام تهیه معرف متیل رد

وجود اتانول، توجه به خطر آتش‌گیری را ضروری می‌کند. برگه ایمنی محلول متیل رد Reagecon، خطر اشتعال زیاد مایع و بخار و تحریک جدی چشم را ذکر می‌کند. طبقه‌بندی دقیق باید از برگه ایمنی همان مواد و فرآورده مصرفی بررسی شود.

منبع: Reagecon؛ برگه اطلاعات ایمنی محلول متیل رد

هنگام کار:

• منابع شعله، جرقه و گرما را از محل آماده‌سازی دور نگه دارید.
• از عینک ایمنی، روپوش و دستکش مناسب استفاده کنید.
• در محیط دارای تهویه مناسب کار کنید و درپوش ظروف را بسته نگه دارید.
• برای تسریع حل‌شدن، از گرم‌کردن خودسرانه محلول الکلی پرهیز کنید.
• پسماند را مطابق دستور مدیریت پسماند شیمیایی آزمایشگاه جمع‌آوری کنید.

نکات پیشرفته تدوین دستور کار تهیه محلول متیل رد

یک دستور کار استاندارد (Standard Operating Procedure; SOP) مناسب باید فراتر از فهرست مواد باشد. در تدوین آن، این موارد را مشخص کنید:

هویت دقیق ماده: نام، گرید و شکل شیمیایی متیل رد باید روشن باشد.

کنترل اندازه‌گیری: تناسب ترازو با جرم مورد نیاز و تناسب وسیله حجم‌سنج با دقت روش بررسی شود.

مدیریت تغییرات: تغییر تأمین‌کننده، درصد اتانول، مقیاس ساخت یا بسته‌بندی باید از نظر اثر احتمالی بر عملکرد ارزیابی شود.

معیار پذیرش: پیش از ساخت، مشخص شود چه نتیجه‌ای برای ظاهر و عملکرد قابل قبول است.

ردیابی: سوابق باید امکان پیگیری هر بطری تا مواد اولیه، تهیه‌کننده و نتایج کنترل کیفیت را فراهم کنند.

اقدام در عدم انطباق: نحوه قرنطینه، بررسی علت و تعیین تکلیف معرف نامناسب از پیش تعریف شود.

این موارد، پیشنهادهای اجرایی برای تقویت کنترل داخلی‌اند؛ الزامات اختصاصی هر آزمایشگاه باید از نظام کیفیت و روش‌های مصوب همان مرکز استخراج شوند.

الگوریتم عملی پذیرش معرف و گزارش نتیجه آزمون MR

مسیر زیر یک پیشنهاد اجرایی برای تنظیم دستور کار داخلی است؛ معیارهای پذیرش و شرایط تکرار باید از روش مصوب آزمایشگاه گرفته شوند.

تعیین کاربرد و فرمول مرجع ← کنترل هویت مواد و محاسبات ← تهیه و ثبت بچ ← بررسی ظاهر ← کنترل عملکرد متناسب با کاربرد ← پذیرش یا قرنطینه معرف

چه زمانی نتیجه آزمون MR را گزارش کنیم؟

انطباق شرایط آزمون با روش مصوب + پذیرش کنترل کیفیت + رنگ قابل تفسیر ← ثبت نتیجه MR در مجموعه شناسایی بیوشیمیایی

کنترل کیفیت نامعتبر یا رنگ بینابینی ← توقف گزارش قطعی ← بررسی معرف، محیط، انکوباسیون و نسبت حجم‌ها ← رفع علت و تکرار طبق روش مصوب

نمونه یادداشت داخلی برای نتیجه نامعتبر

در صورت شکست کنترل کیفیت، عبارت زیر برای ثبت داخلی مناسب است و جایگزین نتیجه قابل گزارش به بیمار نیست:

فارسی: «نتیجه آزمون MR به دلیل عدم پذیرش کنترل کیفیت قابل گزارش نیست؛ آزمون پس از رفع علت تکرار می‌شود.»

English: “MR test result is not reportable because quality control failed. Repeat testing is required after corrective action.”

نمونه یادداشت داخلی برای واکنش بینابینی

در صورت رنگ نارنجی و پیش از تعیین تکلیف طبق روش مصوب:

فارسی: «واکنش رنگی بینابینی در آزمون MR مشاهده شد؛ تفسیر قطعی تا بررسی شرایط آزمون و تکرار طبق دستور کار به تعویق افتاد.»

English: “An equivocal color reaction was observed in the MR test. Final interpretation is pending review and repeat testing according to the laboratory procedure.”

تفاوت متیل رد با متیل اورانژ و سایر شناساگرها

متیل رد، متیل اورانژ و فنل فتالئین نام‌های قابل جایگزینی برای یک ماده نیستند. انتخاب شناساگر باید با محدوده تغییر رنگ مورد نیاز، حلال و روش مرجع هماهنگ باشد؛ دستور تهیه یک شناساگر را برای شناساگر دیگر استفاده نکنید.

چک‌لیست کارشناس پیش از مصرف محلول متیل رد

• کاربرد و غلظت روی برچسب با روش آزمون یکسان است.
• بچ مواد اولیه، مقادیر و حجم نهایی ثبت شده‌اند.
• وضعیت ظاهری و شرایط نگهداری بررسی شده‌اند.
• تاریخ مصرف یا بازآزمایی مصوب معتبر است.
• کنترل کیفیت متناسب با کاربرد پذیرفته شده است.
• حجم محیط، مقدار معرف و زمان خواندن از یک دستور واحد انتخاب شده‌اند.
• برای رنگ بینابینی یا کنترل نامعتبر، مسیر بررسی و تکرار مشخص است.

تهیه قابل اعتماد محلول متیل رد از انتخاب فرمول متناسب با کاربرد آغاز می‌شود و با کنترل عملکرد، برچسب‌گذاری و نگهداری مستند کامل می‌شود. برای آزمون میکروبیولوژی، فرمول مرجع و دستور اجرای آزمون را به‌صورت یک مجموعه هماهنگ به کار ببرید.

۱۵ سؤال رایج درباره روش تهیه محلول متیل رد

منبع: FDA؛ دستور تهیه معرف متیل رد، BAM R44

منبع: Remel؛ دستور مصرف، تفسیر و کنترل کیفیت متیل رد

منبع: Merck؛ راهنمای شناساگرها و فرمول تهیه متیل رد

مطالعه تکمیلی در آزمایشگاه شیمی

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

برای انتخاب فرمول، اجرای آزمون و بررسی ایمنی به سند مربوط به همان کاربرد مراجعه کنید. دستورهای محصولی، شرایط اختصاصی همان محصول را بیان می‌کنند.