لام نئوبار چیست؟ آموزش بارگذاری، شمارش سلول و رفع خطاهای هموسایتومتر
لام نئوبار چیست؟ آموزش بارگذاری، شمارش سلول و رفع خطاهای هموسایتومتر
خلاصه مقاله
لام نئوبار چیست؟ لام نئوبار یک محفظه شمارش شیشهای با شبکه و عمق مشخص است که برای تعیین تعداد سلولها در حجم معینی از نمونه به کار میرود. نتیجه صحیح زمانی به دست میآید که نمونه یکنواخت، رقت دقیق، لامل مخصوص، بارگذاری کامل و فرمول متناسب با مساحت و عمق ناحیه شمارش استفاده شود.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/Heamostica
فهرست مطالب
لام نئوبار چیست و چگونه سلولها را میشمارد؟
لام نئوبار یک محفظه شمارش شیشهای با شبکه مدرج و حجم معلوم است. کارشناس با شمارش سلولهای موجود در بخش مشخصی از شبکه و اعمال ضریب رقت، غلظت سلول را در هر میکرولیتر یا میلیلیتر محاسبه میکند.
این وسیله معمولاً با نام هموسایتومتر (Hemocytometer) نیز شناخته میشود. از نظر فنی، هموسایتومتر نام محفظه شمارش است و نئوبار یا نئوبار اصلاحشده (Improved Neubauer) به الگوی شبکه حکشده روی آن اشاره دارد؛ بااینحال در محیط آزمایشگاه معمولاً کل وسیله «لام نئوبار» نامیده میشود.
لام نئوبار ابتدا برای شمارش سلولهای خونی طراحی شد، اما امروزه برای شمارش سلولهای کشتشده، سلولهای هستهدار، مخمرها، اسپرم و برخی ذرات زیستی نیز کاربرد دارد. نوع نمونه تعیین میکند کدام خانهها، چه رقتی و چه فرمولی استفاده شود.
لام نئوبار یک روش اندازهگیری است، نه یک آزمایش با محدوده مرجع واحد. محدوده طبیعی و تصمیم بالینی به نوع سلول، نوع نمونه، واحد گزارش و روش معتبر همان آزمایش وابسته است.
ساختمان لام نئوبار اصلاحشده چگونه است؟
هر شبکه اصلی نئوبار اصلاحشده یک مربع ۳ × ۳ میلیمتری است که به ۹ مربع بزرگ تقسیم میشود. مساحت هر مربع بزرگ یک میلیمتر مربع و عمق محفظه پس از قرارگیری صحیح لامل مخصوص ۰٫۱ میلیمتر است.
لام نئوبار چیست
حجم بالای یک مربع بزرگ برابر ۰٫۱ میلیمتر مکعب یا ۰٫۱ میکرولیتر است:
برای جزئیات ناحیه مرکزی شبکه، رقت ۱:۲۰۰ و محاسبه اختصاصی گلبول قرمز، راهنمای زیر را مطالعه کنید.
چهار مربع بزرگ گوشه برای شمارش دستی لکوسیتها استفاده میشوند؛ رقت و فرمول کامل در مقاله زیر آمده است.
شمارش پلاکت به دلیل اندازه کوچک و خطای نمونهگیری به کنترل بیشتری نیاز دارد. روش آمونیوم اگزالات را در راهنمای تخصصی ببینید.
تفاوت لامل مخصوص نئوبار با لامل معمولی چیست؟
لامل مخصوص هموسایتومتر ضخامت، صافی و استحکام تعریفشدهای دارد و فاصله استاندارد ۰٫۱ میلیمتری را ایجاد میکند. لامل معمولی میتواند خم شود یا در ارتفاع نامناسب قرار گیرد و حجم محفظه را تغییر دهد.
در بسیاری از مدلهای شیشهای، مشاهده حلقههای نیوتن (Newton’s Rings) پس از قراردادن لامل، نشانه تماس مناسب آن با پایههای محفظه است. لامل شکسته، خراشیده یا لق باید تعویض شود.
استفاده از لامل معمولی میتواند حتی با شمارش صحیح سلولها، نتیجه نهایی را به دلیل تغییر عمق محفظه غیرقابل اعتماد کند.
کاربردهای لام نئوبار و وسایل موردنیاز چیست؟
لام نئوبار برای شمارش گلبول قرمز، گلبول سفید، پلاکت، سلولهای کشتشده، سلولهای بنیادی، مخمر و اسپرم قابل استفاده است؛ اما برای هر کاربرد باید روش آمادهسازی و الگوی شمارش اختصاصی اجرا شود.
- هموسایتومتر تمیز و سالم و لامل مخصوص
- میکروسکوپ نوری یا فازکنتراست متناسب با نمونه
- میکروپیپت کالیبره و سرسمپلر مناسب
- رقیقکننده معتبر متناسب با نوع سلول
- تریپان بلو برای ارزیابی یکپارچگی غشای سلولهای کشتشده
- اتانول ۷۰ درصد، دستمال بدون پرز و تجهیزات حفاظت فردی
- فرم ثبت خانهها، شمارش خام، ضریب رقت و محاسبه نهایی
شمارش سلولهای بنیادی خونساز نیز به تعریف دقیق جمعیت سلولی و روش معتبر نیاز دارد. مقاله زیر زمینه زیستی و کاربردهای این سلولها را توضیح میدهد.
نحوه بارگذاری لام نئوبار چگونه است؟
برای بارگذاری صحیح، ابتدا لامل مخصوص نصب میشود و سپس نمونه کاملاً مخلوطشده بدون فشار و فقط با نیروی موئینگی وارد اتاقک میشود. وجود حباب، سرریز یا پرشدگی ناقص به معنی رد بارگذاری و تکرار آن است.
۱. تمیزکردن لام و لامل
سطح محفظه و لامل را با روش توصیهشده سازنده، معمولاً اتانول ۷۰ درصد و دستمال بدون پرز، تمیز و کاملاً خشک کنید. چربی، پرز و رسوب باعث توزیع نامناسب و اختلال فوکوس میشوند.
۲. قراردادن لامل مخصوص
لامل را روی پایههای محفظه قرار دهید و از استقرار پایدار آن مطمئن شوید. پس از بارگذاری، لامل را حرکت ندهید.
۳. مخلوطکردن نمونه و تهیه رقت
نمونه را درست پیش از برداشت بهآرامی اما کامل مخلوط کنید. رقیقکننده، نسبت رقت و زمان تماس باید با نوع سلول و روش اجرایی استاندارد آزمایشگاه هماهنگ باشند.
۴. ورود نمونه با نیروی موئینگی
- حدود ۵ تا ۱۰ میکرولیتر نمونه بردارید؛ حجم دقیق به طراحی محفظه وابسته است.
- نوک سرسمپلر را به لبه محل ورود اتاقک نزدیک کنید.
- اجازه دهید نمونه بهآرامی زیر لامل کشیده شود.
- پس از پرشدن شبکه، پیپتاژ را متوقف کنید.
- برای تکمیل اتاقک ناقص، نمونه بیشتری اضافه نکنید؛ محفظه را تمیز و دوباره بارگذاری کنید.
۵. تهنشینی و فوکوس
لام را روی سطح افقی میکروسکوپ قرار دهید، با عدسی شیئی ۱۰ برابر شبکه را پیدا کنید و زمان استاندارد روش را برای تهنشینی سلولها در نظر بگیرید. تأخیر طولانی میتواند باعث تبخیر، حرکت سلولها یا تغییر نتیجه زندهمانی شود.
قانون شمارش سلولهای روی خطوط لام نئوبار چیست؟
برای جلوگیری از شمارش دوباره، سلولهای روی دو خط مجاور وارد و سلولهای روی دو خط مقابل حذف میشوند. برای مثال میتوان خطوط بالا و چپ را شمارش و خطوط پایین و راست را حذف کرد.
برخی روشها ترکیب دیگری را تعیین میکنند. اصل علمی، ثابتبودن قانون مرزی در تمام خانهها و هماهنگی آن با روش اجرایی آزمایشگاه است، نه انتخاب یک جهت خاص.
تصمیمگیری بر اساس «بیش از نصف سلول داخل خانه است» جایگزین قانون خطوط مرزی نیست. قانون ورود و خروج باید از ابتدا مشخص و بدون تغییر اجرا شود.
اگر تجمع سلولی ناشی از رولو یا آگلوتیناسیون باشد، اصلاح صرف بارگذاری کافی نیست و ابتدا باید نوع تجمع مشخص شود.
فرمول شمارش سلول با لام نئوبار چیست؟
فرمول عمومی شمارش، تعداد سلول مشاهدهشده را بر حجم واقعی بررسیشده تقسیم و سپس ضریب رقت را اعمال میکند. این فرمول برای هر الگوی شمارش قابل استفاده است، به شرط آنکه حجم ناحیه شمارش درست محاسبه شود.
اگر چند مربع بزرگ کامل شمارش شده باشد، فرمول سادهشده زیر کاربرد دارد:
اگر مجموع سلولهای چند مربع در دسترس باشد:
ضریب ۱۰۴ فقط وقتی مستقیماً استفاده میشود که مبنا، میانگین تعداد سلول در یک مربع بزرگ با مساحت ۱ میلیمتر مربع و عمق ۰٫۱ میلیمتر باشد. برای خانههای کوچکتر باید حجم واقعی محاسبه شود.
مثالهای محاسبه شمارش سلول با هموسایتومتر
مثال شمارش سلولهای کشتشده
اگر در چهار مربع بزرگ بهترتیب ۷۲، ۶۸، ۷۵ و ۶۵ سلول زنده شمارش شود، مجموع ۲۸۰ و میانگین ۷۰ سلول است. در صورت مخلوطکردن حجم مساوی نمونه با تریپان بلو، ضریب رقت ۲ خواهد بود.
اگر حجم سوسپانسیون ۵ میلیلیتر باشد، تعداد کل سلول زنده برابر ۷ × ۱۰۶ سلول خواهد بود.
محاسبه درصد زندهمانی با تریپان بلو
تریپان بلو (Trypan Blue) وارد سلولهای دارای غشای آسیبدیده میشود و آنها را آبی نشان میدهد. سلولهای بدون رنگ بهعنوان سلولهای زنده شمارش میشوند.
برای ۲۸۰ سلول زنده و ۲۰ سلول آبی، زندهمانی برابر ۹۳٫۳ درصد است. این نتیجه یکپارچگی غشای سلول را نشان میدهد و الزاماً معادل توان تکثیر یا عملکرد متابولیک نیست.
مثال شمارش گلبول سفید
در روش متداول شمارش گلبول سفید، چهار مربع بزرگ گوشه و رقت ۱:۲۰ استفاده میشود. اگر مجموع شمارش ۱۲۰ سلول باشد، حجم شمارششده ۰٫۴ میکرولیتر است.
مثال شمارش گلبول قرمز
در روش متداول شمارش گلبول قرمز، پنج مربع متوسط از ۲۵ مربع مرکزی شمارش میشود. مساحت کل ۰٫۲ میلیمتر مربع و حجم بررسیشده ۰٫۰۲ میکرولیتر است. اگر ۴۸۰ سلول با رقت ۱:۲۰۰ شمرده شود:
آیا لام نئوبار محدوده طبیعی یا آستانه تصمیمگیری دارد؟
خیر. لام نئوبار فقط غلظت سلول را اندازهگیری میکند و بهخودیخود محدوده طبیعی یا آستانه تصمیمگیری (Cut-off) ندارد. تفسیر نتیجه به نوع سلول، نمونه، سن و شرایط بیمار، واحد گزارش و مرجع معتبر همان آزمون وابسته است.
برای مثال، نتیجه RBC باید همراه با هموگلوبین، هماتوکریت، شاخصهای گلبول قرمز و در صورت نیاز رتیکولوسیت و اسمیر خون محیطی بررسی شود. یک شمارش غیرمنتظره ابتدا باید از نظر کیفیت نمونه، محاسبات و خطای روش بررسی شود و نباید مستقیماً به تشخیص بالینی تبدیل شود.
برای تفکیک معنای محتوای هموگلوبین هر سلول از غلظت هموگلوبین داخل گلبول، این راهنما مکمل تفسیر RBC است.
RDW-CV و RDW-SD شاخص پراکندگی اندازه گلبولهای قرمز هستند و جایگزین شمارش مستقیم RBC نیستند.
محدودههای MCV و MCH باید همراه با سن، شرایط بالینی و محدوده مرجع آزمایشگاه تفسیر شوند.
برای پیوند شمارش RBC با الگوهای کمخونی، طبقهبندی اتیولوژیک و مورفولوژیک را جداگانه بررسی کنید.
در اسفروسیتوز ارثی، تعداد RBC فقط بخشی از ارزیابی است و مورفولوژی، شاخصها و تستهای تکمیلی اهمیت دارند.
رتیکولوسیت شاخص پاسخ مغز استخوان است و تفسیر آن با شمارش RBC و هماتوکریت ارتباط مستقیم دارد.
برای مراحل اجرایی رنگآمیزی و شمارش رتیکولوسیت، از راهنمای روش آزمایش استفاده کنید.
در کمخونی، درصد خام رتیکولوسیت میتواند گمراهکننده باشد و شمارش اصلاحشده دید دقیقتری میدهد.
برای محاسبه سریع شاخص تولید رتیکولوسیت میتوانید از ابزار آنلاین سایت استفاده کنید.
اگر میخواهید منطق فرمول و تفسیر شاخص تولید رتیکولوسیت را بدانید، راهنمای عملی زیر را ببینید.
رفع خطاهای رایج لام نئوبار و هموسایتومتر
بیشتر خطاهای شمارش نئوبار از مرحله پیشتحلیلی و بارگذاری ناشی میشوند. اتاقک دارای حباب، سرریز، پرشدگی ناقص یا توزیع نامتقارن باید رد و دوباره آماده شود؛ اصلاح ریاضی نمیتواند بارگذاری معیوب را جبران کند.
الگوریتم عملی تصمیمگیری در شمارش با لام نئوبار
مسیر تصمیمگیری باید پیش از گزارش، کیفیت نمونه، اعتبار بارگذاری و سازگاری دو شمارش را بررسی کند. مسیر پیشنهادی زیر باید با روش اجرایی معتبر هر آزمایشگاه تطبیق داده شود.
وجود حباب یا سرریز، پرشدگی ناقص، توزیع غیریکنواخت، تودههای قابل توجه، شمارش بسیار کم یا بسیار متراکم، اختلاف خارج از معیار داخلی دو اتاقک و ناسازگاری واضح با وضعیت نمونه یا نتیجه دستگاه از دلایل تکرار هستند.
چکلیست کنترل کیفیت و گزارش نتیجه لام نئوبار
گزارش قابل دفاع باید علاوه بر عدد نهایی، قابلیت ردیابی رقت، خانههای شمارششده و پذیرش تکرارها را داشته باشد. معیار اختلاف دو اتاقک باید در روش اجرایی داخلی تعریف و اعتبارسنجی شود؛ عدد ۱۰ درصد که در بعضی آزمایشگاهها استفاده میشود، قانون جهانی نیست.
- ثبت نوع نمونه، زمان دریافت و وضعیت لخته یا تجمع
- ثبت رقیقکننده، نسبت رقت و زمان رنگآمیزی
- ثبت خانههای شمارششده و قانون خطوط مرزی
- ثبت شمارش خام هر اتاقک، میانگین و محاسبه نهایی
- بررسی واحد گزارش؛ هر میکرولیتر، هر میلیمتر مکعب یا هر میلیلیتر
- ثبت علت تکرار یا تأیید با روش دیگر در صورت وجود مغایرت
نمونه کامنت گزارش
این کامنت فقط زمانی مناسب است که شمارش دستی واقعاً با روش معتبر انجام و نتیجه تأیید شده باشد. در صورت وجود تجمع، لخته یا محدودیت روش، محدودیت واقعی باید بهطور مشخص گزارش شود.
اگر نتیجه شمارش با مورفولوژی سازگار نیست، اسمیر خون محیطی مرحله تکمیلی مهمی است.
کیفیت رنگآمیزی بر شناسایی سلولها و بررسی مورفولوژی اثر مستقیم دارد.
شمارش افتراقی لکوسیتها با شمارش کل WBC متفاوت است و باید روی اسمیر مناسب انجام شود.
در حضور شک به همولیز میکروآنژیوپاتیک، شناسایی و گزارش شیستوسیت به روش استاندارد اهمیت دارد.
شمارش دستی با لام نئوبار بهتر است یا شمارنده خودکار؟
برای شمارش روتین پرتعداد، آنالایزر خودکار معمولاً تکرارپذیری و سرعت بیشتری دارد؛ لام نئوبار برای آموزش، کنترل بعضی نتایج مشکوک، نمونههای پژوهشی و موقعیتهایی که روش خودکار در دسترس یا مناسب نیست ارزشمند است.
اگر نتایج متوالی دستگاه بهطور غیرمنتظره تغییر میکنند، آلودگی انتقالی بین نمونهها یکی از منابع خطاست.
فلگ دستگاه نتیجه تشخیصی مستقل نیست و ممکن است به بازبینی اسمیر یا تأیید با روش دیگر نیاز داشته باشد.
هیستوگرامهای CBC اطلاعات توزیعی دستگاه را نشان میدهند و در تفسیر اختلاف با شمارش دستی مفید هستند.
سؤالات رایج درباره لام نئوبار و شمارش سلول
۱. لام نئوبار چیست؟
لام نئوبار یک محفظه شیشهای مدرج با مساحت و عمق مشخص است که برای شمارش سلولها در حجم معلوم نمونه استفاده میشود.
۲. آیا لام نئوبار همان هموسایتومتر است؟
در کاربرد روزمره بله؛ اما از نظر فنی هموسایتومتر نام وسیله و نئوبار نام یکی از الگوهای شبکه آن است.
۳. تفاوت نئوبار اصلاحشده با نئوبار معمولی چیست؟
نئوبار اصلاحشده خطوط مرزی واضحتر و تقسیمبندی دقیقتری در مربع مرکزی دارد؛ نوع شبکه باید پیش از انتخاب خانهها و فرمول مشخص شود.
۴. عمق لام نئوبار چقدر است؟
عمق محفظه استاندارد نئوبار با قرارگیری صحیح لامل مخصوص ۰٫۱ میلیمتر است.
۵. چرا در فرمول شمارش سلول از ضریب ۱۰⁴ استفاده میشود؟
حجم بالای یک مربع بزرگ ۱۰⁻⁴ میلیلیتر است؛ بنابراین میانگین شمارش آن مربع برای تبدیل به سلول در میلیلیتر در ۱۰⁴ ضرب میشود.
۶. آیا میتوان از لامل معمولی روی هموسایتومتر استفاده کرد؟
خیر؛ لامل معمولی ممکن است عمق استاندارد محفظه را ایجاد نکند و غلظت محاسبهشده را تغییر دهد.
۷. چه حجمی برای بارگذاری لام نئوبار لازم است؟
معمولاً ۵ تا ۱۰ میکرولیتر برای هر اتاقک کافی است، اما حجم دقیق باید از دستورالعمل سازنده همان محفظه پیروی کند.
۸. نمونه چگونه وارد اتاقک نئوبار میشود؟
نوک سرسمپلر کنار ورودی قرار میگیرد و نمونه بدون فشار با نیروی موئینگی به زیر لامل کشیده میشود.
۹. سلولهای روی خطوط مرزی چگونه شمارش میشوند؟
دو خط مجاور وارد و دو خط مقابل حذف میشوند؛ قانون انتخابشده باید در تمام خانهها ثابت اجرا شود.
۱۰. سلولهای کشتشده در کدام خانهها شمارش میشوند؟
برای بسیاری از سلولهای کشتشده چهار مربع بزرگ گوشه یا تعداد مشخصی مربع بزرگ شمارش میشود؛ الگوی نهایی باید در روش آزمایش ثابت باشد.
۱۱. گلبول سفید در کدام قسمت لام نئوبار شمارش میشود؟
در روش متداول شمارش دستی گلبول سفید، چهار مربع بزرگ گوشه شبکه شمارش میشوند.
۱۲. گلبول قرمز در کدام قسمت لام نئوبار شمارش میشود؟
در روش متداول شمارش دستی گلبول قرمز، پنج مربع متوسط شامل چهار مربع کناری و مربع مرکزی از ناحیه مرکزی شمارش میشوند.
۱۳. مخلوطکردن مساوی نمونه و تریپان بلو چه ضریب رقتی ایجاد میکند؟
مخلوطکردن یک حجم نمونه با یک حجم تریپان بلو، حجم را دو برابر و ضریب رقت ۲ ایجاد میکند.
۱۴. درصد زندهمانی سلول چگونه محاسبه میشود؟
درصد زندهمانی از تقسیم سلولهای زنده بر مجموع سلولهای زنده و مرده و ضرب نتیجه در ۱۰۰ به دست میآید.
۱۵. اگر تعداد سلولها بسیار زیاد یا بسیار کم باشد چه باید کرد؟
برای سلولهای بسیار زیاد رقت افزایش مییابد و برای شمارش بسیار کم خانههای بیشتری بررسی یا نمونه با روش معتبر تغلیظ میشود.
۱۶. اختلاف زیاد بین دو اتاقک چه معنایی دارد؟
اختلاف زیاد معمولاً نشاندهنده مخلوطکردن ناکافی، تهنشینی سلولها یا بارگذاری غیریکنواخت است و شمارش باید تکرار شود.
۱۷. آیا اتاقک دارای حباب یا سرریز قابل قبول است؟
خیر؛ حباب، سرریز و پرشدگی ناقص حجم مؤثر و توزیع سلول را تغییر میدهند و نیازمند بارگذاری مجدد هستند.
۱۸. تودههای سلولی چگونه شمارش میشوند؟
تودهها نباید بهصورت یک سلول شمرده شوند؛ علت تجمع باید بررسی و در صورت امکان سوسپانسیون یکنواخت تهیه شود.
۱۹. آیا شمارش هر دو سمت لام نئوبار ضروری است؟
برای افزایش اطمینان و ارزیابی یکنواختی بارگذاری، شمارش هر دو اتاقک توصیه میشود و معیار پذیرش باید در روش داخلی تعریف شود.
۲۰. چه زمانی نتیجه شمارش دستی باید تکرار یا با روش دیگری تأیید شود؟
نتیجه در بارگذاری معیوب، اختلاف خارج از معیار دو اتاقک، تجمع سلولی، تعداد آماری ناکافی یا ناسازگاری واضح با سایر یافتهها باید تکرار یا تأیید شود.
جمعبندی: برای شمارش دقیق با لام نئوبار چه نکاتی ضروری است؟
دقت شمارش با لام نئوبار به چهار عامل اصلی وابسته است: سوسپانسیون یکنواخت، رقت صحیح، بارگذاری استاندارد و استفاده از فرمول متناسب با حجم شمارششده. اصلاح محاسبات نمیتواند حباب، سرریز، لامل نامناسب یا توزیع غیریکنواخت سلولها را جبران کند.
در کاربرد تشخیصی، شمارش دستی باید مطابق روش اجرایی معتبر، کنترل کیفیت تعریفشده و توسط کارشناس آموزشدیده انجام شود. نتیجه نئوبار یک یافته آزمایشگاهی است و برای تبدیل آن به تفسیر یا تشخیص بالینی باید نوع نمونه، سایر نتایج و شرایط بیمار در نظر گرفته شوند.
منابع معتبر برای مطالعه بیشتر
اطلاعات فنی مقاله با استفاده از راهنماهای سازمانی، پروتکلهای آزمایشگاهی معتبر و مقاله پژوهشی نمایهشده تنظیم شده است.
پروتکل عمومی شمارش، حجم مربع نئوبار و مبنای ضریب ۱۰⁴.
راهنمای آمادهسازی، لامل، حلقههای نیوتن، تریپان بلو و منابع خطای شمارش.
پروتکل شمارش سلول هستهدار و زندهمانی با تریپان بلو و توصیه درباره تراکم مناسب شمارش.
STEMCELL Technologies: How to Count Cells with a Hemocytometer
مرجع سازمان جهانی بهداشت برای روش استاندارد بررسی و شمارش اسپرم با نئوبار اصلاحشده.
مطالعه پژوهشی مقایسه شش روش شمارش سلولی و تفاوت عملکرد آنها.
Camacho-Fernández et al.: Comparison of Cell Counting Methods