رقت سازی در آزمایشگاه فرایند کاهش کنترل‌شده غلظت نمونه یا محلول با افزودن رقیق‌کننده مناسب است. محاسبه ضریب رقت، استفاده از فرمول C₁V₁ = C₂V₂، انتخاب پیپت و رقیق‌کننده صحیح و بررسی محدوده خطی روش، چهار اصل اساسی برای دستیابی به نتیجه معتبر هستند. در این راهنما، تهیه رقت‌های یک دهم و یک بیستم، رقت سازی سریالی، رقیق سازی سرم خون و خطاهای رایج با مثال‌های عملی توضیح داده شده‌اند.

رقت سازی در آزمایشگاه چیست؟

رقت سازی یا رقیق سازی (Dilution) فرایندی است که طی آن با افزودن مقدار مشخصی از یک رقیق‌کننده به محلول یا نمونه، غلظت ماده موردنظر کاهش پیدا می‌کند.

توجه داشته باشید که رقت سازی یکی از پرکاربردترین عملیات در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، شیمی، میکروب‌شناسی، سرولوژی، هماتولوژی و تحقیقاتی است. تهیه محلول‌های استاندارد، رقیق‌کردن نمونه‌های دارای غلظت بالا، انجام آزمایش‌های تیتر، شمارش سلولی و ساخت منحنی کالیبراسیون همگی به درک صحیح مفهوم رقت وابسته‌اند.

یک اشتباه کوچک در انتخاب حجم نمونه، نوع رقیق‌کننده، پیپتاژ یا محاسبه ضریب رقت می‌تواند نتیجه نهایی آزمایش را چند برابر بیشتر یا کمتر از مقدار واقعی نشان دهد. در این مقاله، اصول رقت سازی در آزمایشگاه، فرمول رقیق سازی محلول‌ها، ضریب رقت، تهیه رقت یک‌دهم و یک‌بیستم، رقت سازی سریالی و رقیق سازی سرم خون را همراه با مثال‌های کاربردی بررسی می‌کنیم.

در یک رقت سازی ساده، مقدار ماده حل‌شونده تغییر نمی‌کند؛ اما چون حجم نهایی افزایش می‌یابد، غلظت آن کاهش پیدا می‌کند. به همین دلیل رابطه زیر برقرار است:

رقیق‌کننده (Diluent) ممکن است آب مقطر، بافر، نرمال سالین، محیط کشت، سرم فاقد آنالیت، محلول اختصاصی کیت یا یک ماتریکس زیستی مشخص باشد. انتخاب آن به نوع آزمایش و ویژگی‌های آنالیت بستگی دارد.

اجزای اصلی یک رقت

هر رقت از سه جزء تشکیل می‌شود:

• نمونه یا محلول اولیه: محلولی که قرار است رقیق شود.
• رقیق‌کننده یا Diluent: مایعی که برای کاهش غلظت استفاده می‌شود.
• محلول نهایی: مخلوط نمونه و رقیق‌کننده پس از رسیدن به حجم تعیین‌شده.

برای مثال، اگر ۱۰۰ میکرولیتر سرم را با ۹۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده مخلوط کنیم، حجم نهایی ۱۰۰۰ میکرولیتر خواهد بود و رقت حاصل، در تعریف رایج آزمایشگاهی، ۱ به ۱۰ است.

ضریب رقت چیست؟

ضریب رقت (Dilution Factor; DF) عددی است که نشان می‌دهد نمونه اولیه چند برابر رقیق شده است. ضریب رقت از تقسیم حجم نهایی بر حجم نمونه اولیه به دست می‌آید:

که در آن:

• DF: ضریب رقت
• V₁: حجم نمونه یا محلول اولیه
• V₂: حجم نهایی پس از رقیق سازی

همچنین می‌توان ضریب رقت را از نسبت غلظت اولیه به غلظت نهایی محاسبه کرد:

مثال محاسبه ضریب رقت

اگر ۲۰۰ میکرولیتر نمونه را با ۸۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده مخلوط کنیم:

• حجم نمونه: ۲۰۰ میکرولیتر
• حجم رقیق‌کننده: ۸۰۰ میکرولیتر
• حجم نهایی: ۱۰۰۰ میکرولیتر

این نمونه ۵ برابر رقیق شده و رقت آن ۱:۵ است.

تفاوت رقت و ضریب رقت

این دو مفهوم با یکدیگر مرتبط‌اند، اما نباید اشتباه گرفته شوند:

در رقت ۱:۱۰، نمونه یک‌دهم حجم نهایی را تشکیل می‌دهد و ضریب رقت برابر ۱۰ است.

ابهام مهم در نوشتن نسبت رقت

عبارت‌هایی مانند ۱:۱۰ گاهی در منابع مختلف به دو شکل تفسیر می‌شوند:

1. یک قسمت نمونه در مجموع ۱۰ قسمت محلول نهایی؛ یعنی ۱ قسمت نمونه + ۹ قسمت رقیق‌کننده
2. یک قسمت نمونه به‌اضافه ۱۰ قسمت رقیق‌کننده؛ یعنی حجم نهایی ۱۱ قسمت

در بیشتر روش‌های آزمایشگاهی، رقت ۱:۱۰ به معنای یک قسمت نمونه در حجم نهایی ۱۰ قسمتی است. بااین‌حال، برای جلوگیری از خطا بهتر است روش تهیه به‌صورت شفاف نوشته شود:

همچنین می‌توان از شیوه نگارش ۱+۹ استفاده کرد که در آن عدد اول حجم نمونه و عدد دوم حجم رقیق‌کننده است.

فرمول رقیق سازی محلول ها

پرکاربردترین فرمول رقیق سازی محلول‌ها رابطه زیر است:

که در آن:

• C₁: غلظت محلول اولیه یا استوک (Stock Solution)
• V₁: حجم موردنیاز از محلول اولیه
• C₂: غلظت موردنظر در محلول نهایی
• V₂: حجم نهایی محلول رقیق‌شده

از این فرمول زمانی استفاده می‌شود که بخواهیم محلولی با غلظت مشخص را از یک محلول غلیظ‌تر تهیه کنیم.

مثال فرمول رقیق سازی محلول ها

فرض کنید می‌خواهیم ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول ۰٫۲ مولار را از یک محلول استوک ۲ مولار تهیه کنیم:

• C₁ = ۲ مولار
• C₂ = ۰٫۲ مولار
• V₂ = ۱۰۰ میلی‌لیتر

برای تهیه این محلول باید ۱۰ میلی‌لیتر از محلول ۲ مولار برداشته، وارد بالن ژوژه ۱۰۰ میلی‌لیتری کنیم و با حلال مناسب حجم را دقیقاً به ۱۰۰ میلی‌لیتر برسانیم.

محاسبه حجم رقیق‌کننده

پس از محاسبه حجم نمونه یا محلول استوک، حجم تقریبی رقیق‌کننده از رابطه زیر به دست می‌آید:

برای مثال، برای تهیه یک میلی‌لیتر رقت ۱:۵، حجم نمونه برابر ۱۰۰۰ ÷ ۵ = ۲۰۰ میکرولیتر و حجم رقیق‌کننده برابر ۱۰۰۰ − ۲۰۰ = ۸۰۰ میکرولیتر است.

جدول آماده رقیق سازی محلول ها

جدول زیر حجم موردنیاز برای تهیه تعدادی از رقت‌های متداول را نشان می‌دهد:

تهیه رقت یک دهم

رقت یک‌دهم یا ۱:۱۰ یعنی نمونه یک‌دهم حجم نهایی را تشکیل می‌دهد و ضریب رقت برابر ۱۰ است.

روش تهیه یک میلی‌لیتر رقت یک‌دهم

• ۱۰۰ میکرولیتر نمونه
• ۹۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده
• حجم نهایی: ۱۰۰۰ میکرولیتر

پس از افزودن نمونه و رقیق‌کننده، محلول باید بدون ایجاد کف یا حباب به‌خوبی مخلوط شود.

روش تهیه ۱۰ میلی‌لیتر رقت یک‌دهم

• ۱ میلی‌لیتر نمونه
• ۹ میلی‌لیتر رقیق‌کننده
• حجم نهایی: ۱۰ میلی‌لیتر

مثال کاربردی رقت یک‌دهم

اگر غلظت محلول اولیه ۵۰۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر باشد، غلظت پس از رقت ۱:۱۰ برابر است با:

اگر دستگاه روی نمونه رقیق‌شده عدد ۴۸ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر را نشان دهد و دستگاه ضریب رقت را به‌صورت خودکار اعمال نکرده باشد:

تهیه رقت یک بیستم

رقت یک‌بیستم یا ۱:۲۰ یعنی یک قسمت نمونه در حجم نهایی ۲۰ قسمتی وجود دارد. ضریب رقت این محلول برابر ۲۰ است.

روش تهیه یک میلی‌لیتر رقت یک‌بیستم

• ۵۰ میکرولیتر نمونه
• ۹۵۰ میکرولیتر رقیق‌کننده
• حجم نهایی: ۱۰۰۰ میکرولیتر

روش تهیه دو میلی‌لیتر رقت یک‌بیستم

حجم نمونه از تقسیم حجم نهایی بر ضریب رقت به دست می‌آید:

بنابراین:

• ۱۰۰ میکرولیتر نمونه
• ۱۹۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده
• حجم نهایی: ۲۰۰۰ میکرولیتر

تهیه رقت ۱:۲۰ به روش سریالی

رقت ۱:۲۰ را می‌توان در دو مرحله نیز تهیه کرد:

1. ابتدا یک رقت ۱:۲ تهیه شود.
2. سپس از محلول ۱:۲ یک رقت ۱:۱۰ تهیه شود.

بنابراین رقت نهایی برابر ۱:۲۰ خواهد بود. این روش زمانی مفید است که حجم لازم از نمونه در رقت مستقیم، کمتر از محدوده مطمئن پیپت باشد.

رقیق سازی محلول ها شیمی دهم

مفهوم رقیق سازی در شیمی بر پایه ثابت‌ماندن مقدار ماده حل‌شونده است. وقتی به یک محلول آب یا حلال اضافه می‌کنیم، تعداد مول‌های ماده حل‌شونده تغییر نمی‌کند؛ اما حجم افزایش یافته و غلظت کاهش پیدا می‌کند.

به همین علت از رابطه زیر استفاده می‌شود:

در این رابطه M نشان‌دهنده غلظت مولار (Molar Concentration) است.

مثال ساده

برای تهیه ۲۵۰ میلی‌لیتر محلول ۰٫۱ مولار از محلول ۱ مولار:

بنابراین ۲۵ میلی‌لیتر از محلول ۱ مولار برداشته می‌شود و پس از انتقال به بالن ژوژه، با آب مقطر یا حلال مناسب حجم آن به ۲۵۰ میلی‌لیتر می‌رسد.

تفاوت تهیه محلول و رقیق سازی

اگر ماده اولیه جامد باشد و آن را وزن کرده و در حلال حل کنیم، در واقع در حال تهیه محلول (Solution Preparation) هستیم، نه رقیق سازی یک محلول قبلی.

برای تهیه محلول مولار از یک ماده جامد از رابطه زیر استفاده می‌شود:

برای مثال، جهت تهیه یک لیتر محلول ۰٫۱ مولار از ماده‌ای با جرم مولکولی ۵۸٫۵ گرم بر مول:

محاسبه محلول‌های درصدی

نوع درصد باید حتماً مشخص باشد؛ زیرا درصد وزنی‌ـ‌حجمی، حجمی‌ـ‌حجمی و وزنی‌ـ‌وزنی یکسان نیستند.

درصد وزنی ـ حجمی

محلول ۱ درصد وزنی‌ـ‌حجمی یا 1% w/v حاوی یک گرم ماده در حجم نهایی ۱۰۰ میلی‌لیتر است.

برای تهیه ۵۰۰ میلی‌لیتر محلول ۲ درصد وزنی‌ـ‌حجمی:

بنابراین ۱۰ گرم ماده حل شده و حجم نهایی به ۵۰۰ میلی‌لیتر رسانده می‌شود.

درصد حجمی ـ حجمی

محلول ۱۰ درصد حجمی‌ـ‌حجمی یا 10% v/v حاوی ۱۰ میلی‌لیتر مایع اولیه در حجم نهایی ۱۰۰ میلی‌لیتر است.

برای تهیه ۲۵۰ میلی‌لیتر محلول ۱۰ درصد:

سپس حلال تا حجم نهایی ۲۵۰ میلی‌لیتر اضافه می‌شود.

درصد وزنی ـ وزنی

محلول ۵ درصد وزنی‌ـ‌وزنی یا 5% w/w حاوی ۵ گرم ماده در ۱۰۰ گرم محلول نهایی است. در این حالت محاسبه بر اساس جرم انجام می‌شود، نه حجم.

رقت سازی سریالی چیست و چگونه انجام می‌شود؟

رقت سازی سریالی (Serial Dilution) یعنی تهیه مجموعه‌ای از رقت‌ها به‌صورت مرحله‌به‌مرحله. در هر مرحله، مقدار مشخصی از محلول قبلی به لوله بعدی منتقل می‌شود.

این روش در موارد زیر کاربرد دارد:

• آزمایش‌های سرولوژی و تعیین تیتر آنتی‌بادی
• شمارش میکروبی
• تهیه منحنی استاندارد
• سنجش حساسیت روش
• آزمایش‌های ELISA
• بررسی خطی‌بودن روش‌های کمی
• کاهش خطای ناشی از پیپتاژ حجم‌های بسیار کم

اصول عملی پیش از شروع رقت سازی سریالی

پیش از شروع، تعداد لوله‌ها، ضریب هر مرحله، حجم انتقالی، حجم رقیق‌کننده و حجم نهایی هر لوله باید مشخص شوند. تمام لوله‌ها باید پیشاپیش برچسب‌گذاری شوند و هر لوله قبل از انتقال به لوله بعدی کاملاً مخلوط شود.

1. رقت نهایی موردنیاز و تعداد مراحل را تعیین کنید.
2. حجمی را انتخاب کنید که در محدوده مطمئن پیپت باشد.
3. در تمام لوله‌ها حجم مساوی رقیق‌کننده بریزید.
4. نمونه را فقط به لوله اول اضافه و کامل مخلوط کنید.
5. حجم انتقالی تعیین‌شده را از لوله قبلی به لوله بعدی منتقل کنید.
6. برای هر انتقال از سرسمپلر جدید استفاده کنید.
7. پس از آخرین مرحله، ضریب رقت تجمعی را کنترل و ثبت کنید.

رقت سازی سریالی دوبرابری

برای تهیه رقت‌های ۱:۲، ۱:۴، ۱:۸، ۱:۱۶ و ۱:۳۲:

1. در پنج لوله، ۵۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده بریزید.
2. به لوله اول ۵۰۰ میکرولیتر نمونه اضافه و کاملاً مخلوط کنید. رقت لوله اول ۱:۲ است.
3. مقدار ۵۰۰ میکرولیتر از لوله اول به لوله دوم منتقل و مخلوط کنید. رقت کلی لوله دوم ۱:۴ است.
4. همین کار را برای لوله‌های بعدی تکرار کنید.
5. پس از مخلوط‌کردن لوله آخر، در صورت نیاز ۵۰۰ میکرولیتر از آن خارج کنید تا حجم همه لوله‌ها برابر بماند.

رقت سازی سریالی ده‌برابری

برای تهیه رقت‌های ۱۰⁻¹ تا ۱۰⁻⁵:

1. در هر لوله ۹۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده بریزید.
2. ۱۰۰ میکرولیتر نمونه به لوله اول اضافه و مخلوط کنید؛ رقت این لوله ۱۰⁻¹ یا ۱:۱۰ است.
3. مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از لوله اول به لوله دوم منتقل کنید؛ رقت لوله دوم ۱۰⁻² یا ۱:۱۰۰ خواهد بود.
4. انتقال را به همین روش ادامه دهید.

فرمول ضریب رقت در رقت سازی سریالی

در رقت سازی چندمرحله‌ای، ضریب رقت کلی برابر حاصل‌ضرب ضریب رقت تمام مراحل است:

برای مثال، اگر نمونه ابتدا ۱:۵ و سپس ۱:۱۰ رقیق شود:

بنابراین رقت نهایی ۱:۵۰ است.

تفاوت رقت مستقیم و رقت سریالی

رقت مستقیم در یک مرحله به غلظت هدف می‌رسد، اما رقت سریالی همان کاهش غلظت را طی چند مرحله انجام می‌دهد. رقت مستقیم مراحل کمتری دارد، ولی در رقت‌های بالا ممکن است به برداشت حجمی بسیار کوچک و پرخطا نیاز داشته باشد.

رقیق سازی سرم خون

رقیق سازی سرم خون (Serum Dilution) معمولاً زمانی انجام می‌شود که غلظت آنالیت از محدوده اندازه‌گیری روش یا محدوده اندازه‌گیری تحلیلی (Analytical Measuring Interval; AMI) بالاتر باشد. در چنین شرایطی، نمونه با یک رقیق‌کننده مناسب رقیق، مجدداً آزمایش و نتیجه نهایی با توجه به ضریب رقت محاسبه می‌شود.

CLSI EP34 تأکید می‌کند که نوع رقیق‌کننده، نسبت رقت و عملکرد روش پس از رقیق سازی باید برای ایجاد محدوده اندازه‌گیری توسعه‌یافته (Extended Measuring Interval; EMI) بررسی و تأیید شده باشند. بنابراین صرفاً ضرب‌کردن نتیجه در ضریب رقت، بدون اطمینان از صحت رفتار روش، کافی نیست.

چه زمانی سرم رقیق می‌شود؟

• نتیجه بالاتر از محدوده اندازه‌گیری دستگاه است.
• دستگاه پیام‌هایی مانند High، Above Range یا Out of Linearity نمایش می‌دهد.
• روش انجام آزمایش از ابتدا به رقت مشخصی نیاز دارد.
• احتمال اثر Hook یا Prozone مطرح است.
• آزمایش به‌صورت تیتر یا رقت‌های متوالی انجام می‌شود.
• حجم یا غلظت نمونه برای یک روش اختصاصی باید تنظیم شود.

انتخاب رقیق‌کننده سرم

رقیق‌کننده مناسب ممکن است یکی از موارد زیر باشد:

• رقیق‌کننده اختصاصی معرفی‌شده توسط سازنده کیت
• محلول Diluent دستگاه
• سرم فاقد آنالیت یا ماتریکس مشابه
• بافر اختصاصی آزمایش
• نرمال سالین، فقط در صورت تأیید دستورالعمل روش
• آب دیونیزه، فقط در روش‌هایی که سازنده به‌صراحت مجاز دانسته باشد

فرمول رقیق سازی سرم

برای محاسبه نتیجه نهایی سرم رقیق‌شده از رابطه زیر استفاده می‌شود:

مثال اول

یک نمونه سرم با رقت ۱:۵ آزمایش شده و دستگاه عدد ۸۰ میلی‌گرم بر دسی‌لیتر را نشان داده است:

مثال دوم

نمونه‌ای با رقت ۱:۲۰ آزمایش شده و نتیجه آن ۱۲ واحد بر میلی‌لیتر است:

نکته مهم درباره دستگاه‌های اتوماتیک

برخی دستگاه‌ها پس از ثبت ضریب رقت، نتیجه را به‌صورت خودکار اصلاح می‌کنند. در این شرایط، نباید نتیجه خروجی دستگاه دوباره در ضریب رقت ضرب شود.

قبل از گزارش نتیجه باید مشخص شود:

• ضریب رقت در دستگاه ثبت شده است یا خیر؟
• نتیجه چاپ‌شده مربوط به نمونه رقیق‌شده است یا نمونه اصلی؟
• دستگاه از رقت خودکار استفاده کرده یا رقت دستی انجام شده است؟
• نتیجه نهایی داخل محدوده توسعه‌یافته و تأییدشده روش قرار دارد یا خیر؟

ثبت این اطلاعات در برگه کاری یا سیستم اطلاعات آزمایشگاه (Laboratory Information System; LIS) از خطاهای چندبرابری جلوگیری می‌کند.

محدودیت‌های رقیق سازی سرم

رابطه خطی میان رقت و نتیجه برای تمام آزمایش‌ها تضمین‌شده نیست. مهم‌ترین محدودیت‌ها عبارت‌اند از:

اثر ماتریکس

سرم فقط محلولی از یک آنالیت نیست؛ بلکه حاوی پروتئین‌ها، الکترولیت‌ها، لیپیدها و ترکیبات مختلف است. رقیق سازی می‌تواند ترکیب ماتریکس نمونه را تغییر داده و بر واکنش آزمایش اثر بگذارد.

رفتار غیرخطی روش

در بعضی روش‌ها کاهش غلظت نمونه الزاماً باعث کاهش متناسب سیگنال نمی‌شود. محدوده خطی روش باید مطابق ادعای سازنده یا مطالعه اعتبارسنجی آزمایشگاه مشخص باشد. CLSI EP06 برای ارزیابی و تأیید خطی‌بودن روش‌های کمی راهنما ارائه می‌کند.

اثر هوک یا پروزون

در برخی آزمون‌های ایمونولوژیک، غلظت بسیار بالای آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی ممکن است نتیجه‌ای کاذباً پایین ایجاد کند. رقیق سازی مرحله‌ای نمونه می‌تواند این پدیده را آشکار کند، اما رقت‌های مورد استفاده باید مطابق دستورالعمل کیت باشند.

جذب آنالیت به سطح لوله

در غلظت‌های بسیار پایین، بعضی پروتئین‌ها، هورمون‌ها یا ترکیبات ممکن است به دیواره لوله یا سرسمپلر متصل شوند. نوع لوله و ترکیب رقیق‌کننده در این شرایط اهمیت دارد.

ناپایداری آنالیت

برخی آنالیت‌ها پس از رقیق سازی پایداری کمتری دارند و باید بلافاصله آزمایش شوند. شرایط دما، نور و زمان نگهداری باید مطابق روش اجرایی باشد.

رقیق سازی در آزمایش‌های مختلف

رقت در آزمایش‌های سرولوژی

در آزمون‌های نیمه‌کمی سرولوژی، نمونه در رقت‌های متوالی آزمایش می‌شود. تیتر (Titer) برابر معکوس بالاترین رقتی است که هنوز واکنش مثبت ایجاد می‌کند.

برای مثال، اگر واکنش تا رقت ۱:۱۶۰ مثبت و در رقت ۱:۳۲۰ منفی باشد:

تیتر یک نتیجه نیمه‌کمی است و نباید مانند غلظت عددی، بدون توجه به دستورالعمل آزمایش در ضریب رقت ضرب شود.

رقت در آزمایش‌های انعقادی

در آزمایش‌های انعقادی نمی‌توان زمان PT یا aPTT نمونه رقیق‌شده را به‌سادگی در ضریب رقت ضرب کرد. رقیق سازی بر نسبت فاکتورهای انعقادی، مهارکننده‌ها و فسفولیپیدها اثر می‌گذارد.

رقت‌های مورد استفاده در سنجش فعالیت فاکتورهای انعقادی، آزمون Bethesda یا سایر آزمایش‌های اختصاصی باید دقیقاً بر اساس روش معتبر انجام شوند. همچنین Mixing Study با رقیق سازی معمول نمونه برای کاهش غلظت یک آنالیت یکسان نیست.

رقت در شمارش سلولی

در شمارش دستی سلول‌ها با لام نئوبار، نمونه معمولاً با نسبت مشخصی رقیق می‌شود. فرمول کلی شمارش عبارت است از:

ضریب حجم به نوع لام، عمق محفظه و مربع‌های شمارش‌شده بستگی دارد و باید برای هر روش جداگانه محاسبه شود.

رقت در میکروب‌شناسی

در شمارش کلنی از رابطه کلی زیر استفاده می‌شود:

برای مثال، اگر از رقت ۱۰⁻⁴ مقدار ۰٫۱ میلی‌لیتر کشت داده شود و ۵۰ کلنی رشد کند:

انتخاب پلیت مناسب و محدوده قابل‌شمارش باید مطابق روش استاندارد همان آزمون باشد.

محاسبه درصد بازیابی پس از رقت

برای بررسی عملکرد رقیق سازی می‌توان درصد بازیابی یا بازیابی رقت (Dilution Recovery) را محاسبه کرد:

نتیجه اصلاح‌شده نمونه رقیق‌شده برابر است با:

برای مثال:

• نتیجه مرجع: ۲۰۰ واحد
• نتیجه نمونه پس از رقت ۱:۵: برابر ۳۹ واحد
• نتیجه اصلاح‌شده: ۳۹ × ۵ = ۱۹۵ واحد

حد پذیرش بازیابی یک عدد ثابت و جهانی نیست و باید بر اساس نوع آنالیت، ادعای سازنده، عدم‌قطعیت روش و معیارهای اعتبارسنجی آزمایشگاه تعیین شود.

مراحل صحیح رقت سازی در آزمایشگاه

برای انجام یک رقت دقیق، مراحل زیر پیشنهاد می‌شود:

1. هدف رقیق سازی و رقت نهایی موردنیاز را مشخص کنید.
2. دستورالعمل کیت، دستگاه یا روش اجرایی استاندارد را بررسی کنید.
3. رقیق‌کننده مناسب و تأییدشده را انتخاب کنید.
4. ضریب رقت و حجم‌های نمونه و رقیق‌کننده را پیش از شروع محاسبه کنید.
5. پیپتی متناسب با حجم موردنظر انتخاب کنید.
6. لوله‌ها را پیش از شروع با مشخصات نمونه و رقت برچسب‌گذاری کنید.
7. رقیق‌کننده و نمونه را با تکنیک صحیح پیپتاژ کنید.
8. محلول را بدون ایجاد کف یا حباب کاملاً مخلوط کنید.
9. در رقت سریالی، پیش از هر انتقال لوله قبلی را مخلوط و برای هر مرحله از سرسمپلر جدید استفاده کنید.
10. نمونه رقیق‌شده را در زمان و شرایط تعیین‌شده آزمایش کنید.
11. ضریب رقت را در دستگاه، برگه کاری یا LIS ثبت کنید.
12. پیش از گزارش، بررسی کنید که دستگاه ضریب رقت را اعمال کرده است یا خیر.
13. نتیجه را از نظر محدوده اندازه‌گیری، خطی‌بودن، کنترل کیفیت و سازگاری بالینی ارزیابی کنید.

الگوریتم تصمیم‌گیری برای نمونه بالاتر از محدوده اندازه‌گیری

انتخاب پیپت مناسب برای رقت سازی

دقت رقت به عملکرد پیپت وابستگی مستقیم دارد. استاندارد ISO 8655-2:2022 الزامات مترولوژیک و حداکثر خطاهای مجاز پیپت‌های جابه‌جایی هوا و جابه‌جایی مثبت را پوشش می‌دهد.

برای کاهش خطا:

• از پیپتی استفاده کنید که حجم موردنظر در بخش میانی محدوده کاری آن قرار گیرد.
• برای برداشت ۱۰ میکرولیتر، استفاده از پیپت ۲ تا ۲۰ میکرولیتر مناسب‌تر از پیپت ۱۰ تا ۱۰۰ میکرولیتر است.
• از سرسمپلر سازگار و درست نصب‌شده استفاده کنید.
• پیپت را هنگام برداشت مایع تقریباً عمودی نگه دارید.
• سرسمپلر را بیش‌ازحد در مایع فرو نبرید.
• از تشکیل حباب جلوگیری کنید.
• برای مایعات ویسکوز یا کف‌کننده، تکنیک Reverse Pipetting ممکن است مناسب‌تر باشد.
• در صورت نیاز سرسمپلر را با همان محلول پیش‌مرطوب کنید.
• کالیبراسیون، کنترل عملکرد و نگهداری پیپت‌ها را طبق برنامه انجام دهید.

مهم‌ترین خطاهای رقت سازی در آزمایشگاه

اشتباه در مفهوم ۱:۱۰

تهیه یک قسمت نمونه به‌اضافه ۱۰ قسمت رقیق‌کننده، رقت ۱:۱۱ ایجاد می‌کند؛ نه ۱:۱۰، مگر اینکه روش موردنظر نسبت را به‌صورت نمونه به رقیق‌کننده تعریف کرده باشد.

استفاده از رقیق‌کننده نامناسب

نرمال سالین، آب مقطر یا بافر عمومی ممکن است باعث تغییر پاسخ آزمایش شود. رقیق‌کننده باید با روش سازگار باشد.

استفاده از پیپت نامتناسب

برداشت حجم‌های نزدیک به حداقل ظرفیت پیپت، خطای نسبی را افزایش می‌دهد.

مخلوط‌نکردن کامل

در رقت‌های سریالی، مخلوط‌نشدن یک لوله باعث انتقال خطا به تمام لوله‌های بعدی می‌شود.

ایجاد حباب

حباب هوا می‌تواند حجم واقعی برداشت یا تخلیه‌شده را کاهش دهد.

تعویض‌نکردن سرسمپلر

این کار موجب انتقال نمونه، آلودگی متقاطع و تغییر غلظت رقت‌ها می‌شود.

ضرب‌کردن دوباره در ضریب رقت

اگر دستگاه نتیجه را قبلاً با توجه به ضریب رقت اصلاح کرده باشد، ضرب مجدد نتیجه را به‌طور کاذب چند برابر می‌کند.

گردکردن زودهنگام اعداد

محاسبات باید با تعداد رقم کافی انجام شوند و گردکردن فقط در مرحله گزارش نهایی صورت گیرد.

نادیده‌گرفتن محدوده اندازه‌گیری

اگر نتیجه نمونه رقیق‌شده همچنان خارج از محدوده روش باشد، عدد به‌دست‌آمده قابل گزارش نیست و باید رقت مناسب‌تری انتخاب شود.

کنترل کیفیت رقت سازی

برای اطمینان از صحت رقت سازی باید موارد زیر کنترل شوند:

• استفاده از پیپت‌های کالیبره و دارای وضعیت مشخص
• ثبت شماره یا شناسه پیپت در مطالعات مهم
• استفاده از رقیق‌کننده معتبر و کنترل تاریخ انقضا
• بررسی دمای مواد در صورت حساس‌بودن روش
• تهیه رقت‌ها در تکرار، به‌ویژه در مطالعات اعتبارسنجی
• استفاده از کنترل مناسب همراه نمونه‌های رقیق‌شده
• ارزیابی درصد بازیابی و خطی‌بودن رقت
• ثبت نام اپراتور، زمان تهیه و ضریب رقت
• بررسی مستقل محاسبات در تهیه استانداردها و کالیبراتورها
• تعریف معیار پذیرش اختصاصی برای هر روش

در تهیه محلول‌های کالیبراسیون، علاوه بر ظروف حجمی و پیپت‌ها، خلوص ماده مرجع، ویژگی‌های ماتریکس، روش توزین و عدم‌قطعیت اندازه‌گیری نیز اهمیت دارند.

یک مثال کامل از محاسبه رقت

فرض کنید نتیجه یک آزمایش بالاتر از محدوده اندازه‌گیری دستگاه است و طبق دستورالعمل می‌توان نمونه را با رقیق‌کننده اختصاصی کیت به نسبت ۱:۵ رقیق کرد.

مرحله اول: تعیین حجم‌ها

برای تهیه یک میلی‌لیتر رقت ۱:۵:

مرحله دوم: تهیه رقت

• ۸۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده در لوله ریخته می‌شود.
• ۲۰۰ میکرولیتر نمونه اضافه می‌شود.
• محتویات لوله به‌آرامی و به‌طور کامل مخلوط می‌شود.

مرحله سوم: اندازه‌گیری

دستگاه برای نمونه رقیق‌شده نتیجه ۷۵ واحد بر میلی‌لیتر گزارش می‌کند و مشخص شده است که دستگاه ضریب رقت را خودکار اعمال نکرده است.

مرحله چهارم: محاسبه نتیجه اصلی

مرحله پنجم: بررسی اعتبار نتیجه

پیش از گزارش باید اطمینان حاصل شود که:

• عدد ۷۵ داخل محدوده اندازه‌گیری روش قرار دارد.
• رقت ۱:۵ و رقیق‌کننده استفاده‌شده مورد تأیید سازنده هستند.
• نتیجه ۳۷۵ داخل محدوده اندازه‌گیری توسعه‌یافته روش قرار دارد.
• کنترل‌های آزمایش قابل‌قبول‌اند.
• اثر ماتریکس یا عدم خطی‌بودن روش مطرح نیست.

جمع‌بندی

رقت سازی در آزمایشگاه فقط مخلوط‌کردن نمونه و رقیق‌کننده نیست. یک رقت قابل‌اعتماد به تعریف درست نسبت رقت، محاسبه صحیح حجم‌ها، انتخاب رقیق‌کننده مناسب، پیپتاژ دقیق، مخلوط‌کردن کامل و بررسی محدوده خطی روش وابسته است.

فرمول C₁V₁ = C₂V₂ برای تهیه محلول از یک استوک غلیظ‌تر استفاده می‌شود و ضریب رقت از تقسیم حجم نهایی بر حجم نمونه به دست می‌آید. در نمونه‌های بیماران، نتیجه اندازه‌گیری‌شده فقط زمانی در ضریب رقت ضرب می‌شود که روش پس از رقیق سازی معتبر باشد و دستگاه ضریب را به‌صورت خودکار اعمال نکرده باشد.

تدوین روش اجرایی مشخص برای رقت سازی، آموزش کارکنان، کنترل پیپت‌ها و ثبت کامل محاسبات از مهم‌ترین اقدامات برای پیشگیری از خطاهای آزمایشگاهی است.

سوالات رایج درباره رقت سازی در آزمایشگاه

مقالات مرتبط هموستیکا

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

1. Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI EP34: Establishing and Verifying an Extended Measuring Interval Through Specimen Dilution and Spiking. First Edition; reaffirmed 2023. صفحه رسمی CLSI EP34
2. Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI EP06: Evaluation of Linearity of Quantitative Measurement Procedures. Second Edition; 2020. صفحه رسمی CLSI EP06
3. International Organization for Standardization. ISO 8655-2:2022—Piston-operated volumetric apparatus, Part 2: Pipettes. صفحه رسمی ISO 8655-2:2022
4. World Health Organization. Laboratory Quality Management System: Handbook. 2011. صفحه رسمی WHO
5. Sander LC, Schantz MM. Preparation of Calibration Solutions. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 2017;122:9. مشاهده مقاله در NIST