شمارش دستی گلبول سفید؛ آموزش کار با لام نئوبار، فرمول محاسبه و کنترل کیفی

شمارش دستی گلبول سفید یا Manual WBC Count روشی برای تعیین تعداد لکوسیت‌های خون بدون استفاده از سل کانتر اتوماتیک است. در این روش، نمونه خون با یک محلول رقیق‌کننده مناسب مخلوط می‌شود تا گلبول‌های قرمز لیز شوند و لکوسیت‌ها برای شمارش باقی بمانند. سپس تعداد مشخصی از گلبول‌های سفید در یک حجم دقیق و از پیش تعیین‌شده شمارش می‌شود و با در نظر گرفتن ضریب رقت و حجم شمارش‌شده، تعداد WBC در هر میکرولیتر خون محاسبه می‌شود.

امروزه شمارش روتین WBC تقریباً در تمام آزمایشگاه‌ها توسط آنالایزرهای هماتولوژی انجام می‌شود؛ با این حال آشنایی با شمارش دستی برای کارشناس آزمایشگاه همچنان ضروری است. این روش در مواردی مانند بررسی برخی نتایج غیرمنتظره دستگاه، لکوپنی شدید، نبود یا خرابی سل کانتر و همچنین شمارش سلول‌ها در برخی مایعات بدن کاربرد دارد.

ابزار اصلی انجام این روش لام نئوبار (Neubauer Chamber) یا به‌طور کلی هموسایتومتر (Hemocytometer) است.

لام نئوبار یا هموسایتومتر چیست؟

هموسایتومتر یک محفظه شمارش شیشه‌ای با ابعاد دقیق و شبکه مدرج است که برای شمارش سلول‌های موجود در حجم مشخصی از مایع طراحی شده است.

یکی از رایج‌ترین انواع آن Improved Neubauer Chamber است که در آزمایشگاه‌های هماتولوژی برای شمارش دستی سلول‌های خونی و در برخی کاربردها برای شمارش سلول‌های سایر مایعات استفاده می‌شود.

آنچه شمارش سلولی با نئوبار را امکان‌پذیر می‌کند این است که:

• مساحت هر قسمت از شبکه دقیقاً مشخص است.
• عمق محفظه مشخص است.
• در نتیجه حجم مایعی که روی هر قسمت شبکه قرار دارد قابل محاسبه است.

بنابراین اگر تعداد سلول‌های موجود در آن حجم را بدانیم، می‌توان غلظت سلول‌ها را در واحد حجم محاسبه کرد.

ساختمان لام نئوبار چگونه است؟

شبکه اصلی لام نئوبار (Improved Neubauer Chamber) یک مربع 3 × 3 میلی‌متری است که به 9 مربع بزرگ تقسیم می‌شود. هر مربع بزرگ مساحتی برابر 1 mm² دارد و چهار مربع بزرگ گوشه برای شمارش دستی گلبول‌های سفید در نظر گرفته می‌شوند.

ساختار لام نئوبار

عمق لام نئوبار و حجم هر مربع بزرگ چقدر است؟

با قرار گرفتن صحیح Cover Glass مخصوص، عمق محفظه برابر 0.1 mm است.

بنابراین فاکتور تبدیل حجم برای رساندن شمارش از 0.1 mm³ به 1 mm³ برابر 10 است.

چرا برای شمارش WBC چهار مربع گوشه لام نئوبار شمارش می‌شود؟

در شمارش دستی لکوسیت‌ها، چهار مربع بزرگ گوشه شبکه شمارش می‌شوند. تعداد سلول‌های شمارش‌شده در این چهار مربع برای به‌دست آوردن میانگین تعداد سلول در یک مربع بزرگ استفاده می‌شود و سپس میانگین به کمک ضریب رقت و فاکتور حجمی 10 به تعداد لکوسیت در میلی‌متر مکعب تبدیل می‌شود.

اساس شمارش WBC با لام نئوبار چیست؟

خون کامل حاوی تعداد بسیار زیادی گلبول قرمز است. اگر خون بدون آماده‌سازی مستقیماً داخل Chamber قرار داده شود، RBCها میدان را پر کرده و تشخیص و شمارش WBC تقریباً غیرممکن خواهد شد.

بنابراین نمونه خون ابتدا با یک WBC Diluting Fluid مخلوط می‌شود.

این محلول دو عملکرد اصلی دارد:

• رقیق کردن نمونه
• لیز کردن گلبول‌های قرمز

پس از لیز RBCها، سلول‌های هسته‌دار باقی‌مانده در محفظه قابل مشاهده و شمارش می‌شوند.

تعداد سلول‌های شمارش‌شده سپس بر اساس:

به تعداد WBC در هر میکرولیتر خون تبدیل می‌شود.

محلول تورک برای شمارش WBC چیست؟

برای شمارش دستی گلبول‌های سفید از محلول رقیق‌کننده تورک (Türk’s solution)  استفاده می‌شود. این محلول‌ حاوی اسید استیک گلاسیال است و با لیز کردن گلبول‌های قرمز، زمینه را برای مشاهده و شمارش لکوسیت‌ها فراهم می‌کند.

در محاسبات این مقاله، نقش محلول رقیق‌کننده ایجاد رقت مشخص خون و لیز گلبول‌های قرمز است.

نمونه مناسب برای شمارش دستی گلبول سفید چیست؟

برای شمارش دستی WBC معمولاً از خون کامل حاوی EDTA استفاده می‌شود.

نمونه باید:

• فاقد لخته باشد.
• به مقدار مناسب داخل لوله EDTA جمع‌آوری شده باشد.
• قبل از برداشت برای رقیق‌سازی کاملاً مخلوط شود.
• از نظر کیفیت برای انجام CBC قابل قبول باشد.

وجود Microclot حتی اگر با چشم به‌سادگی قابل مشاهده نباشد می‌تواند سبب به دام افتادن لکوسیت‌ها و ایجاد شمارش کاذب پایین شود.

چرا مخلوط کردن نمونه قبل از شمارش WBC مهم است؟

سلول‌های خون در حالت سکون به‌تدریج ته‌نشین می‌شوند.

اگر نمونه قبل از برداشت خون برای تهیه رقت کاملاً مخلوط نشود، مقدار سلولی که وارد پیپت می‌شود ممکن است نماینده واقعی غلظت سلول‌ها در نمونه نباشد.

برای مثال، برداشت از قسمت بالایی یک نمونه ته‌نشین‌شده می‌تواند موجب کاهش کاذب تعداد سلول‌ها شود.

به همین دلیل نمونه باید بلافاصله پیش از تهیه رقت به‌آرامی اما به‌طور کامل مخلوط شود.

لام نئوبار شمارش گلبول سفید چگونه استفاده می‌شود؟

در روش شمارش دستی گلبول سفید، نمونه خون کامل حاوی EDTA ابتدا به‌خوبی مخلوط می‌شود، سپس با محلول تورک یا مارکانو رقیق شده و پس از لیز شدن گلبول‌های قرمز، نمونه در لام نئوبار بارگذاری می‌شود. در نهایت چهار مربع بزرگ گوشه برای شمارش لکوسیت‌ها بررسی می‌شوند.

1. نمونه خون EDTA را به‌خوبی مخلوط کنید.
2. خون را با محلول رقیق‌کننده تورک یا مارکانو به نسبت مناسب رقیق کنید.
3. پس از مخلوط شدن نمونه و لیز شدن RBCها، لام نئوبار را با نمونه رقیق‌شده پر کنید.
4. چهار مربع بزرگ گوشه مربوط به شمارش WBC را با بزرگ‌نمایی مناسب شمارش کنید.
5. میانگین تعداد لکوسیت‌های چهار مربع را محاسبه کنید.
6. نتیجه را با استفاده از ضریب رقت و فاکتور تبدیل حجم 10 محاسبه کنید.

رقت خون برای شمارش WBC چقدر است؟

در شمارش معمول، خون به نسبت:

رقیق می‌شود؛ بنابراین ضریب رقت برابر 20 است.

رقت شمارش دستی WBC در لکوپنی و لکوسیتوز چگونه تغییر می‌کند؟

در تمام این حالت‌ها باید ضریب رقت واقعی همان نمونه در فرمول محاسبه وارد شود.

آماده‌سازی و بارگذاری لام نئوبار

لام نئوبار و Cover Glass باید تمیز و سالم باشند. نمونه رقیق‌شده پس از مخلوط شدن در محفظه قرار می‌گیرد و چهار مربع بزرگ گوشه برای شمارش WBC بررسی می‌شوند.

بزرگ‌نمایی شمارش گلبول سفید

شمارش گلبول‌های سفید با بزرگ‌نمایی مورد استفاده در روش دستی، یعنی عدسی شیئی 10× انجام می‌شود. در همین بزرگ‌نمایی، NRBCها از لکوسیت‌ها قابل افتراق مطمئن نیستند و در صورت وجود تعداد قابل توجه NRBC باید شمارش WBC تصحیح شود.

WBC در کدام خانه‌های لام نئوبار شمارش می‌شود؟

برای شمارش دستی گلبول سفید، چهار مربع بزرگ گوشه لام نئوبار شمارش می‌شوند. هر مربع بزرگ حجمی برابر 0.1 mm³ دارد.

در پایان، تعداد کل لکوسیت‌های مشاهده‌شده در چهار مربع بر 4 تقسیم می‌شود تا میانگین تعداد سلول در یک مربع بزرگ به دست آید.

قانون شمارش سلول‌های روی خطوط لام نئوبار چیست؟

برای جلوگیری از شمارش دوباره سلول‌های واقع روی خطوط مرزی، یک قانون ثابت برای خطوط ورودی و خروجی انتخاب و در تمام چهار مربع به‌طور یکسان اجرا می‌شود.

فرمول شمارش سلول با لام نئوبار چیست؟

در روش مورد استفاده برای شمارش دستی گلبول سفید، ابتدا میانگین تعداد لکوسیت‌های شمارش‌شده در چهار مربع بزرگ محاسبه می‌شود و سپس از فرمول زیر استفاده می‌شود:

فاکتور 10 به این دلیل وارد محاسبه می‌شود که حجم هر مربع بزرگ 0.1 mm³ است:

فرمول شمارش گلبول سفید با رقت 1:20

اگر خون به نسبت 1:20 رقیق شود و چهار مربع بزرگ گوشه شمارش شوند:

مثال محاسبه شمارش WBC با لام نئوبار

فرض کنید خون به نسبت 1:20 رقیق شده و در مجموع چهار مربع مربوط به گلبول‌های سفید، 400 گلبول سفید شمارش شده است.

ابتدا میانگین تعداد سلول در یک مربع بزرگ:

سپس:

بنابراین تعداد گلبول‌های سفید بیمار برابر است با 20,000 WBC/mm³ یا 20 × 10⁹/L.

فرمول شمارش WBC در لکوپنی

در لکوپنی با WBC کمتر از 2500/µL، رقت 1:10 استفاده می‌شود. بنابراین:

فرمول شمارش WBC در لکوسیتوز

در لکوسیتوز، در صورت استفاده از رقت 1:100 یا 1:200، همان ضریب رقت واقعی در فرمول جایگزین می‌شود:

چرا شمارش تعداد بیشتر سلول‌ها بهتر است؟

یکی از محدودیت‌های مهم Hemocytometer این است که فقط حجم بسیار کوچکی از نمونه بررسی می‌شود.

هرچه تعداد سلول‌های شمارش‌شده کمتر باشد، اثر تغییرات تصادفی بیشتر خواهد بود.

به زبان ساده، اگر فقط 20 یا 30 سلول شمارش کنیم، اضافه یا کم شدن چند سلول می‌تواند درصد بزرگی از نتیجه را تغییر دهد.

اما اگر چند صد سلول شمارش شوند، اثر همین اختلاف کوچک بسیار کمتر خواهد بود.

این موضوع خصوصاً در لکوپنی شدید اهمیت دارد.

به همین دلیل در شمارش‌های بسیار پایین ممکن است لازم باشد:

• رقت کاهش یابد.
• تعداد خانه‌های بیشتری بررسی شود.
• Chamber دیگری نیز شمارش شود.
• شمارش تکرار شود.

منابع خطا در شمارش دستی WBC چیست؟

شمارش دستی نسبت به روش اتوماتیک وابستگی بیشتری به تکنیک اپراتور دارد و مراحل متعددی می‌توانند باعث ایجاد خطا شوند.

خطاها را می‌توان به چند گروه تقسیم کرد.

خطاهای مربوط به نمونه

وجود لخته یا Microclot

لخته می‌تواند بخشی از لکوسیت‌ها را به دام بیندازد و باعث کاهش کاذب WBC شود.

مخلوط نشدن نمونه

اگر سلول‌ها ته‌نشین شده باشند و نمونه قبل از برداشت مخلوط نشود، غلظت سلولی قسمت برداشت‌شده نماینده کل نمونه نیست.

نمونه نامناسب

نگهداری طولانی، شرایط نامناسب دمایی یا حجم نامناسب خون نسبت به EDTA می‌تواند کیفیت نمونه را تحت تأثیر قرار دهد.

خطا در تهیه رقت

اگر حجم خون یا Diluent دقیق نباشد، ضریب رقت واقعی با ضریبی که در محاسبه استفاده می‌شود متفاوت خواهد بود.

این خطا مستقیماً نتیجه نهایی را تغییر می‌دهد.

خطای پیپت

پیپت باید:

• دقیق باشد.
• کالیبراسیون مناسب داشته باشد.
• برای حجم مورد استفاده مناسب باشد.

حتی اگر شمارش سلول کاملاً صحیح انجام شود، رقت اشتباه می‌تواند کل نتیجه را بی‌اعتبار کند.

خطای پر کردن Chamber

موارد زیر می‌توانند حجم واقعی نمونه را تغییر دهند:

• Overfilling
• Underfilling
• حباب هوا
• قرارگیری نامناسب Cover Glass
• حرکت لامل
• ورود نمونه به شیارهای اطراف

Chamber نامناسب باید رد و مجدداً بارگذاری شود.

خطای توزیع سلولی

سلول‌ها باید در شبکه تقریباً یکنواخت توزیع شده باشند.

تجمع واضح سلول‌ها در یک سمت یا اختلاف غیرمنطقی بین بخش‌های مختلف Chamber می‌تواند نشان‌دهنده:

• مخلوط نکردن مناسب
• بارگذاری نادرست
• حرکت Chamber
• یا ته‌نشینی نامناسب

باشد.

خطای شمارش

خطاهای شمارش شامل:

• فراموش کردن سلول
• شمارش دوباره یک سلول
• رعایت نکردن Border Rule
• شمارش خانه اشتباه
• اشتباه گرفتن Debris با WBC
• گم کردن مسیر شمارش

است.

بهتر است خانه‌ها همیشه با یک الگوی ثابت شمارش شوند.

ضریب تغییرات شمارش دستی WBC چقدر است؟

شمارش لکوسیت با هموسایتومتر در مقادیر طبیعی یا افزایش‌یافته دارای ضریب تغییرات (Coefficient of Variation; CV) حدود 6.5% است. در نمونه‌های لکوپنیک، CV می‌تواند به حدود 15% برسد.

در مقابل، هنگام استفاده از سل‌کانترها CV معمولاً حدود 1 تا 3% است؛ بنابراین روش اتوماتیک از نظر Precision برتری دارد.

NRBC چه اثری بر شمارش WBC دارد؟

در زمان شمارش دستی گلبول‌های سفید، گلبول‌های قرمز هسته‌دار (Nucleated Red Blood Cells; NRBC) نیز همراه لکوسیت‌ها شمارش می‌شوند. در بزرگ‌نمایی 10× مورد استفاده برای شمارش WBC، NRBCها از لکوسیت‌ها قابل افتراق نیستند؛ بنابراین وجود تعداد زیاد NRBC در اسمیر خون محیطی می‌تواند باعث افزایش کاذب شمارش لکوسیت شود.

فرمول اصلاح WBC در حضور NRBC چیست؟

در این فرمول، تعداد NRBC برابر تعداد گلبول‌های قرمز هسته‌داری است که هنگام شمارش افتراقی به ازای 100 لکوسیت شمارش شده‌اند.

کنترل کیفی شمارش دستی WBC چگونه انجام می‌شود؟

کنترل کیفیت در Manual WBC Count باید کل فرایند را پوشش دهد، نه فقط محاسبه نهایی.

قبل از انجام شمارش

بررسی شود:

• نمونه صحیح بیمار انتخاب شده است.
• نمونه لخته ندارد.
• نمونه کاملاً مخلوط شده است.
• Diluent شفاف و قابل استفاده است.
• پیپت مناسب است.
• Chamber سالم و تمیز است.
• Cover Glass مناسب استفاده شده است.
• رقت صحیح انتخاب شده است.

هنگام بارگذاری

بررسی شود:

• Chamber به‌طور کامل و یکنواخت پر شده است.
• حباب وجود ندارد.
• سرریز اتفاق نیفتاده است.
• Cover Glass جابه‌جا نشده است.

هنگام شمارش

بررسی شود:

• خانه‌های صحیح شمارش می‌شوند.
• Border Rule ثابت است.
• توزیع سلولی یکنواخت است.
• تعداد سلول کافی شمارش شده است.
• Debris با لکوسیت اشتباه نمی‌شود.

پس از شمارش

بررسی شود:

• تعداد مربع‌های شمارش‌شده صحیح وارد محاسبه شده است.
• ضریب رقت صحیح است.
• فرمول محاسبه صحیح است.
• نتیجه با CBC اتوماتیک و اسمیر، در صورت وجود، تطبیق داده شده است.
• نتایج غیرمنتظره قبل از گزارش بررسی شده‌اند.

توزیع غیر یکنواخت سلول‌ها در چهار مربع چه معنایی دارد؟

در شمارش دستی WBC، توزیع سلول‌ها در چهار مربع بزرگ باید قابل قبول باشد. اختلاف غیرعادی بین مربع‌ها می‌تواند ناشی از مخلوط نشدن مناسب نمونه، بارگذاری نامناسب لام یا خطای شمارش باشد.

در صورت مشاهده توزیع واضحاً نامناسب، نتیجه نباید صرفاً با محاسبه میانگین پذیرفته شود و علت خطا باید بررسی شود.

چه زمانی شمارش دستی WBC را تکرار کنیم؟

تکرار شمارش در شرایط زیر منطقی است:

• بارگذاری نامناسب لام یا وجود حباب
• توزیع غیر یکنواخت سلول‌ها در چهار مربع شمارش
• تعداد بسیار کم سلول‌ها در نمونه لکوپنیک
• وجود لخته یا Microclot در نمونه
• احتمال خطا در رقت 1:20، 1:10، 1:100 یا 1:200
• نتیجه ناسازگار با CBC یا اسمیر خون محیطی
• وجود NRBC قابل توجه و نیاز به اصلاح شمارش

نحوه تمیز کردن لام نئوبار

پس از پایان کار، Chamber باید به‌دقت تمیز شود.

به‌طور کلی:

• نمونه از سطح لام پاک شود.
• Chamber با آب مناسب شسته شود.
• با ماده‌ای که به خطوط شبکه آسیب بزند ساییده نشود.
• از ایجاد خراش روی سطح شبکه جلوگیری شود.
• Chamber و Cover Glass کاملاً خشک شوند.

خطوط شبکه بخش اصلی سیستم اندازه‌گیری هستند و آسیب به آنها می‌تواند شمارش را دشوار یا غیرقابل اعتماد کند.

مقادیر مرجع لکوسیت‌ها در بزرگسالان چقدر است؟

مقادیر مرجع لکوسیت‌ها در بزرگسالان:

محدوده مرجع نهایی هر آزمایشگاه باید بر اساس روش و محدوده مرجع تأییدشده همان آزمایشگاه گزارش شود.

تغییرات روزانه ائوزینوفیل‌ها چگونه است؟

ائوزینوفیل‌ها دارای تغییرات روزانه چشم‌گیری هستند. شمارش ائوزینوفیل با میزان کورتیزول خون رابطه معکوس دارد؛ کمترین شمارش معمولاً در صبح و بیشترین شمارش در شب مشاهده می‌شود.

شمارش دستی WBC بهتر است یا سل کانتر؟

برای شمارش روتین، سل کانتر اتوماتیک برتری واضحی دارد.

آنالایزرهای مدرن:

• تعداد بسیار بیشتری سلول را بررسی می‌کنند.
• Precision بالاتری دارند.
• زمان آزمایش کوتاه‌تری دارند.
• خطای اپراتوری کمتری دارند.
• همراه با WBC اطلاعات دیگری مانند Differential، Histogram، Scattergram و Flags ارائه می‌کنند.

در مقابل مزیت شمارش دستی این است که:

• به تجهیزات پیچیده نیاز ندارد.
• روش پشتیبان مناسبی است.
• برای بررسی برخی نتایج خاص قابل استفاده است.
• اساس شمارش سلولی را به‌خوبی نشان می‌دهد.

بنابراین نقش Manual WBC Count بیشتر روش پشتیبان و حل مسئله است تا روش اصلی شمارش روتین.

الگوریتم عملی شمارش دستی گلبول سفید در آزمایشگاه

نکات کلیدی شمارش دستی گلبول سفید

• محلول رقیق‌کننده تورک یا مارکانو حاوی اسید استیک گلاسیال است و موجب لیز RBCها می‌شود.
• رقت معمول خون برای شمارش WBC برابر 1:20 است.
• چهار مربع بزرگ گوشه لام نئوبار شمارش می‌شوند.
• حجم هر مربع بزرگ 0.1 mm³ و فاکتور تبدیل حجم برابر 10 است.
• فرمول اصلی: میانگین سلول‌های چهار مربع × ضریب رقت × 10.
• در WBC کمتر از 2500/µL از رقت 1:10 استفاده می‌شود.
• در لکوسیتوز ممکن است رقت 1:100 یا 1:200 استفاده شود.
• CV هموسایتومتر حدود 6.5% در مقادیر طبیعی/بالا و حدود 15% در لکوپنی است؛ CV سل‌کانتر حدود 1 تا 3% است.
• NRBCها در شمارش دستی همراه WBC شمرده می‌شوند و در صورت افزایش باید شمارش تصحیح شود.
• EDTA قابل قبول است، اما هپارین ضدانعقاد مناسبی برای این شمارش نیست.
• محدوده مرجع بزرگسالان 4.5 تا 11 × 10⁹/L است.

جمع‌بندی

در شمارش دستی گلبول سفید، خون با محلول تورک یا مارکانو رقیق می‌شود تا گلبول‌های قرمز لیز شوند. در روش معمول، رقت خون 1:20 است و چهار مربع بزرگ گوشه لام نئوبار برای شمارش لکوسیت‌ها بررسی می‌شوند.

برای مثال، اگر در چهار مربع مجموعاً 400 لکوسیت در رقت 1:20 شمارش شود، میانگین برابر 100 است و WBC برابر 100 × 20 × 10 یعنی 20,000/mm³ خواهد بود.

در لکوپنی کمتر از 2500/µL از رقت 1:10 و در لکوسیتوز ممکن است از رقت 1:100 یا 1:200 استفاده شود. همچنین در حضور NRBC قابل توجه، شمارش WBC باید تصحیح شود.

سوالات رایج درباره شمارش دستی گلبول سفید

مطالب مرتبط دیگر در هموستیکا

این مطالب مستقیماً بخشی از روش شمارش دستی WBC نیستند، اما برای تکمیل مطالعه در حوزه هماتولوژی، انعقاد، ایمنوهِماتولوژی و کنترل کیفیت آزمایشگاه مفیدند.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

روش عملی مقاله بر پایه منابع استاندارد هماتولوژی و اصول پذیرفته‌شده شمارش سلولی تدوین شده است. برای مطالعه تکمیلی، منابع زیر قابل استفاده‌اند: