آزمایش بیوره؛ روش انجام تست بیوره برای اندازهگیری پروتئین تام
آزمایش بیوره یکی از روشهای رنگسنجی برای اندازهگیری پروتئین تام در نمونه سرم یا محلولهای پروتئینی است. در این روش، یون مس در محیط قلیایی با پیوندهای پپتیدی پروتئین واکنش میدهد و رنگ بنفش ایجاد میکند. شدت رنگ ایجادشده با مقدار پروتئین نمونه رابطه مستقیم دارد و با دستگاه فتومتر یا اسپکتروفتومتر اندازهگیری میشود.
جهت عضویت در کانال آموزشی هموستیکا در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/Heamostica
فهرست مطالب مقاله آزمایش بیوره
مقدمهای بر آزمایش بیوره و کاربرد آن در آزمایشگاه
آزمایش بیوره یا تست بیوره (Biuret Test) یکی از روشهای کلاسیک و پرکاربرد برای شناسایی و اندازهگیری پروتئینها است. این آزمایش در آموزش بیوشیمی، آزمایشگاههای دانشجویی و همچنین در برخی روشهای اندازهگیری پروتئین تام (Total Protein) کاربرد دارد.
در آزمایش بیوره، اگر نمونه حاوی پروتئین یا پلیپپتید باشد، پس از افزودن معرف بیوره در محیط قلیایی، رنگ بنفش یا ارغوانی ایجاد میشود. شدت این رنگ به مقدار پروتئین موجود در نمونه بستگی دارد. به همین دلیل، آزمایش بیوره هم برای بررسی کیفی وجود پروتئین و هم برای اندازهگیری تقریبی یا کمی پروتئین قابل استفاده است.
نکته مهم: آزمایش بیوره بیشتر با پیوندهای پپتیدی واکنش میدهد، نه با اسیدآمینههای آزاد. بنابراین مثبت شدن تست معمولاً نشاندهنده وجود پروتئین یا پلیپپتید در نمونه است.
اگر میخواهید با مسیرهای بیوشیمیایی مرتبط با ترکیبات نیتروژنی بیشتر آشنا شوید، مقاله زیر میتواند مکمل خوبی باشد:
اصل آزمایش بیوره چیست؟
اصل آزمایش بیوره بر پایه واکنش یون مس دوظرفیتی (Cu²⁺) با پیوندهای پپتیدی پروتئینها در محیط قلیایی است. در این شرایط، بین یون مس و پیوندهای پپتیدی کمپلکس رنگی بنفش تشکیل میشود.
هرچه تعداد پیوندهای پپتیدی و غلظت پروتئین بیشتر باشد، رنگ بنفش ایجادشده شدیدتر خواهد بود. در روش کمی، شدت رنگ با استفاده از فتومتر یا اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) اندازهگیری میشود.
طول موج خوانش در بسیاری از روشها در محدوده حدود 540 تا 560 نانومتر است؛ اما در کار عملی، طول موج دقیق باید مطابق دستورالعمل آموزشی آزمایشگاه یا بروشور کیت انتخاب شود.
خلاصه آزمایش بیوره
نمونه مناسب برای آزمایش بیوره
در آزمایشگاه دانشجویی، آزمایش بیوره ممکن است روی محلولهای پروتئینی آموزشی مانند آلبومین، سفیده تخممرغ رقیقشده یا نمونههای مجهول انجام شود. در آزمایشگاه تشخیص طبی، نمونه رایج برای اندازهگیری پروتئین تام معمولاً سرم است.
اگر هدف آموزش اصل واکنش باشد، نمونه میتواند یک محلول پروتئینی ساده باشد. اما اگر هدف اندازهگیری پروتئین تام سرم باشد، باید نمونه سرم شفاف، بدون همولیز شدید، بدون لیپمی شدید و بدون آلودگی استفاده شود.
نمونههای قابل استفاده در آزمایش بیوره
- محلول آلبومین یا پروتئین استاندارد در آزمایشگاه دانشجویی
- سفیده تخممرغ رقیقشده برای نمایش کیفی واکنش
- نمونه مجهول آموزشی
- سرم، در صورت انجام روش اندازهگیری پروتئین تام
برای آشنایی با مراحل استاندارد تهیه سرم و خطاهای پیشتحلیلی، مقاله زیر را بخوانید:
معرف بیوره در آزمایش بیوره از چه موادی تشکیل شده است؟
معرف بیوره معمولاً شامل ترکیباتی است که محیط قلیایی ایجاد میکنند و یون مس را در وضعیت مناسب برای واکنش با پیوندهای پپتیدی نگه میدارند. ترکیب دقیق معرف ممکن است بسته به دستورالعمل آموزشی یا کیت مورد استفاده متفاوت باشد.
اجزای رایج معرف بیوره
- سولفات مس (Copper Sulfate) بهعنوان منبع یون مس
- سدیم هیدروکسید یا پتاسیم هیدروکسید برای ایجاد محیط قلیایی
- سدیم پتاسیم تارتارات (Sodium Potassium Tartrate) برای پایدارسازی یون مس
- گاهی پتاسیم یدید یا ترکیبات پایدارکننده مشابه
نکته مهم: معرف بیوره باید شفاف و بدون رسوب باشد. کدورت، رسوب یا تغییر رنگ غیرعادی میتواند روی نتیجه آزمایش اثر بگذارد.
نقش بلانک و استاندارد در آزمایش بیوره
در روش رنگسنجی آزمایش بیوره، فقط نمونه مهم نیست. برای اینکه نتیجه درست به دست آید، باید بلانک و استاندارد نیز بهدرستی آماده شوند.
بلانک در آزمایش بیوره چیست؟
بلانک (Blank) برای صفر کردن دستگاه و حذف جذب زمینهای معرف استفاده میشود. چون خود معرف بیوره ممکن است مقدار کمی جذب نوری داشته باشد، باید این جذب زمینهای از خوانش نمونه حذف شود.
بلانک معمولاً شامل معرف بیوره + آب مقطر است. در بلانک نباید نمونه یا استاندارد پروتئین وجود داشته باشد.
استاندارد در آزمایش بیوره چیست؟
استاندارد محلولی است که غلظت پروتئین آن مشخص است. در روش کمی، جذب نوری نمونه با جذب نوری استاندارد مقایسه میشود و غلظت پروتئین نمونه با فرمول محاسبه میگردد.
روش انجام آزمایش بیوره در آزمایشگاه دانشجویی
در این بخش، روش انجام آزمایش بیوره بهصورت آموزشی توضیح داده میشود. حجمها ممکن است در دستورالعمل هر آزمایشگاه کمی متفاوت باشند، بنابراین در زمان انجام عملی تست، دستور استاد یا کارشناس آزمایشگاه مرجع اصلی است.
وسایل و مواد لازم برای آزمایش بیوره
- معرف بیوره
- محلول استاندارد پروتئین یا آلبومین
- نمونه مجهول یا نمونه آموزشی
- آب مقطر
- لوله آزمایش یا کووت
- سمپلر یا پیپت
- رک لوله
- فتومتر یا اسپکتروفتومتر
- تایمر
- دستکش و روپوش آزمایشگاه
جدول نمونهگذاری آزمایش بیوره
مراحل انجام آزمایش بیوره
- سه لوله با عنوانهای بلانک، استاندارد و نمونه مجهول آماده کنید.
- به هر سه لوله مقدار مشخصی معرف بیوره اضافه کنید.
- به لوله بلانک، آب مقطر اضافه کنید.
- به لوله استاندارد، محلول استاندارد پروتئین اضافه کنید.
- به لوله نمونه، نمونه مجهول یا محلول پروتئینی مورد آزمایش اضافه کنید.
- لولهها را بهآرامی مخلوط کنید تا محلول یکنواخت شود.
- لولهها را طبق دستور آزمایشگاه در دمای اتاق یا دمای مشخصشده انکوبه کنید.
- پس از پایان زمان واکنش، دستگاه را با بلانک صفر کنید.
- جذب نوری استاندارد و نمونه مجهول را در طول موج تعیینشده بخوانید.
- نتیجه را با استفاده از فرمول محاسبه کنید و در گزارش کار ثبت نمایید.
نکته مهم: هنگام مخلوط کردن لولهها از ایجاد کف و حباب جلوگیری کنید. وجود حباب در کووت میتواند مسیر نوری را مختل کند و جذب نوری را تغییر دهد.
فرمول محاسبه در آزمایش بیوره
اگر آزمایش بیوره بهصورت کمی انجام شود، غلظت پروتئین نمونه با مقایسه جذب نمونه و جذب استاندارد محاسبه میشود.
برای مثال، اگر جذب نمونه 0.450، جذب استاندارد 0.500 و غلظت استاندارد 6 g/dL باشد:
بنابراین غلظت پروتئین نمونه برابر با 5.4 گرم در دسیلیتر خواهد بود.
گزارش کار آزمایش بیوره برای دانشجویان علوم آزمایشگاهی
گزارش کار آزمایش بیوره باید نشان دهد که دانشجو اصل آزمایش، نقش معرف، بلانک و استاندارد، مراحل انجام تست و روش محاسبه نتیجه را درک کرده است. این گزارش کار با گزارش بیمارستانی تفاوت دارد؛ چون هدف اصلی آن آموزش، ثبت مشاهدات و تحلیل نتیجه آزمایش دانشجویی است، نه گزارش نتیجه بیمار.
ساختار پیشنهادی گزارش کار آزمایش بیوره
- عنوان آزمایش: آزمایش بیوره برای شناسایی یا اندازهگیری پروتئین
- هدف آزمایش: بررسی وجود پروتئین در نمونه و آشنایی با واکنش بیوره
- اصل آزمایش: واکنش یون مس با پیوندهای پپتیدی در محیط قلیایی و تشکیل رنگ بنفش
- مواد و وسایل: معرف بیوره، استاندارد پروتئین، نمونه مجهول، آب مقطر، لوله آزمایش، سمپلر و اسپکتروفتومتر
- روش کار: ثبت دقیق حجم معرف، آب مقطر، استاندارد و نمونه در هر لوله
- مشاهدات: ثبت رنگ ایجادشده در بلانک، استاندارد و نمونه
- دادههای عددی: ثبت جذب نوری استاندارد و نمونه، در صورت استفاده از دستگاه
- محاسبات: استفاده از فرمول محاسبه غلظت پروتئین
- نتیجهگیری: بیان اینکه نمونه از نظر وجود پروتئین مثبت، منفی یا دارای غلظت مشخص است
- خطاهای احتمالی: توضیح خطاهایی مانند اشتباه در حجمبرداری، مخلوط نکردن مناسب، ایجاد حباب، زمان انکوباسیون نامناسب یا صفر نکردن صحیح دستگاه
نمونه متن نتیجهگیری در گزارش کار
پس از افزودن معرف بیوره به نمونه، ایجاد رنگ بنفش مشاهده شد. این تغییر رنگ نشاندهنده وجود پروتئین یا ترکیبات دارای پیوند پپتیدی در نمونه است. در صورت انجام خوانش نوری، جذب نمونه با جذب استاندارد مقایسه شد و غلظت پروتئین با استفاده از فرمول مربوطه محاسبه گردید.
نکته مهم برای دانشجویان: در گزارش کار، فقط نوشتن نتیجه کافی نیست. باید توضیح دهید چرا رنگ بنفش ایجاد شده، بلانک چه نقشی داشته و چه عواملی میتوانند نتیجه را اشتباه کنند.
تفسیر نتیجه آزمایش بیوره
در آزمایش بیوره، ایجاد رنگ بنفش نشاندهنده وجود پروتئین یا پلیپپتید در نمونه است. اگر رنگ ایجادشده بسیار کمرنگ باشد، ممکن است غلظت پروتئین پایین باشد. اگر رنگ بنفش شدیدتر ایجاد شود، معمولاً مقدار پروتئین نمونه بیشتر است.
در روش کمی، عدد نهایی باید با واحد مناسب مانند g/dL یا g/L گزارش شود. اگر نمونه سرم باشد، نتیجه پروتئین تام معمولاً در کنار آلبومین، گلوبولین و نسبت A/G ارزش تفسیر بالینی بیشتری پیدا میکند.
افزایش پروتئین تام در روش بیوره
افزایش پروتئین تام میتواند در کمآبی بدن، التهاب مزمن، عفونت مزمن یا افزایش برخی گلوبولینها دیده شود. البته در محیط دانشجویی، هدف معمولاً تشخیص بیماری نیست، بلکه درک رابطه شدت رنگ و مقدار پروتئین است.
کاهش پروتئین تام در روش بیوره
کاهش پروتئین تام میتواند با کاهش تولید پروتئین، سوءتغذیه، دفع پروتئین یا رقیق بودن نمونه ارتباط داشته باشد. اما تفسیر بالینی همیشه باید با سایر آزمایشها و شرایط بیمار انجام شود.
اگر هدف بررسی انواع پروتئینها و الگوی آلبومین و گلوبولینها باشد، آزمایش الکتروفورز پروتئین کاربرد بیشتری دارد:
خطاهای رایج در انجام آزمایش بیوره
برای اینکه نتیجه آزمایش بیوره قابل اعتماد باشد، باید مراحل کار با دقت انجام شود. برخی خطاها میتوانند باعث تغییر رنگ، جذب نوری اشتباه یا محاسبه نادرست شوند.
- اشتباه در حجمبرداری معرف، استاندارد یا نمونه
- آماده نکردن صحیح بلانک
- صفر نکردن دستگاه با بلانک
- ایجاد حباب در کووت
- مخلوط نکردن یکنواخت محلولها
- زمان انکوباسیون کمتر یا بیشتر از مقدار تعیینشده
- استفاده از معرف رسوبدار یا آلوده
- خواندن جذب در طول موج نامناسب
نکته مهم: اگر بلانک اشتباه آماده شود، تمام خوانشهای بعدی تحت تأثیر قرار میگیرند. در آزمایش بیوره، بلانک باید فاقد پروتئین باشد.
برای آشنایی با آزمایشهای مرتبط با پروتئین ادرار و پروتئینهای غیرطبیعی، این دو مقاله مفید هستند:
جمعبندی آزمایش بیوره
آزمایش بیوره یک روش ساده، آموزشی و کاربردی برای بررسی وجود پروتئین و اندازهگیری پروتئین تام است. در این آزمایش، یون مس در محیط قلیایی با پیوندهای پپتیدی واکنش میدهد و رنگ بنفش ایجاد میکند. برای انجام صحیح این آزمایش، آمادهسازی درست بلانک، استاندارد و نمونه، رعایت زمان واکنش، خوانش صحیح جذب نوری و محاسبه دقیق نتیجه اهمیت زیادی دارد.
مطالب بیوشیمی و آزمایشگاهی مرتبط که میتوانند مکمل مطالعه این مقاله باشند:
سوالات رایج درباره آزمایش بیوره
آزمایش بیوره چیست؟
آزمایش بیوره روشی برای شناسایی یا اندازهگیری پروتئین است که بر اساس واکنش یون مس با پیوندهای پپتیدی در محیط قلیایی انجام میشود.
آزمایش بیوره برای چه استفاده میشود؟
این آزمایش برای بررسی وجود پروتئین در نمونههای آموزشی و همچنین برای اندازهگیری پروتئین تام در برخی روشهای آزمایشگاهی استفاده میشود.
در آزمایش بیوره چه رنگی ایجاد میشود؟
در صورت وجود پروتئین، پس از افزودن معرف بیوره معمولاً رنگ بنفش یا ارغوانی ایجاد میشود.
بلانک در آزمایش بیوره چه نقشی دارد؟
بلانک برای صفر کردن دستگاه و حذف جذب زمینهای معرف استفاده میشود. بلانک معمولاً شامل معرف بیوره و آب مقطر است.
استاندارد در آزمایش بیوره چیست؟
استاندارد محلولی با غلظت مشخص پروتئین است که برای محاسبه غلظت پروتئین نمونه استفاده میشود.
آیا اسیدآمینهها در آزمایش بیوره مثبت میشوند؟
اسیدآمینههای آزاد معمولاً واکنش قابل توجهی در آزمایش بیوره ایجاد نمیکنند، چون این تست به وجود پیوندهای پپتیدی وابسته است.
طول موج آزمایش بیوره چقدر است؟
در بسیاری از روشها جذب نوری در محدوده حدود 540 تا 560 نانومتر خوانده میشود، اما طول موج دقیق باید طبق دستورالعمل آزمایشگاه تعیین شود.
چرا در آزمایش بیوره رنگ بنفش ایجاد میشود؟
رنگ بنفش بهدلیل تشکیل کمپلکس بین یون مس و پیوندهای پپتیدی پروتئین در محیط قلیایی ایجاد میشود.
فرمول محاسبه آزمایش بیوره چیست؟
غلظت پروتئین نمونه از رابطه جذب نمونه تقسیم بر جذب استاندارد ضربدر غلظت استاندارد محاسبه میشود.
گزارش کار آزمایش بیوره شامل چه بخشهایی است؟
گزارش کار آزمایش بیوره شامل عنوان، هدف، اصل آزمایش، مواد و وسایل، روش کار، مشاهدات، محاسبات، نتیجهگیری و خطاهای احتمالی است.
منابع معتبر برای مطالعه بیشتر