مقدمه: منابع خطا در بانک خون و اهمیت رفع اشکال

آزمایش‌های ایمونوهماتولوژی برخلاف بسیاری از آزمایش‌های روتین آزمایشگاهی، فقط مجموعه‌ای از مراحل فنی برای تولید یک نتیجه نیستند. نتیجه تعیین گروه خون، غربالگری آنتی‌بادی یا کراس‌مچ می‌تواند مستقیماً نوع فرآورده خونی انتخاب‌شده برای بیمار را تعیین کند. بنابراین یک واکنش ضعیف که نادیده گرفته شود، یک آگلوتیناسیون کاذب که مثبت واقعی تلقی شود یا یک نمونه که به بیمار اشتباه تعلق داشته باشد، ممکن است به انتخاب خون ناسازگار و آسیب جدی بیمار منجر شود.

هدف این مقاله آموزش مباحث مدیریتی کیفیت یا تشریح ساختارهای اداری بانک خون نیست. مخاطب اصلی آن کارشناسی است که نمونه بیمار را دریافت می‌کند، آزمایش را انجام می‌دهد، واکنش‌ها را می‌خواند و باید درباره معتبر بودن نتیجه تصمیم بگیرد. به همین دلیل، مطالب مقاله بر پرسش‌های عملی زیر متمرکز است:

چرا سل‌تایپ و بک‌تایپ با یکدیگر مطابقت ندارند؟ چرا غربالگری آنتی‌بادی مثبت شده است؟ چرا کراس‌مچ با واحدی که از نظر ABO سازگار است، ناسازگار گزارش می‌شود؟ آیا تجمع سلولی مشاهده‌شده آگلوتیناسیون واقعی است یا رولو؟ نتیجه Mixed-field چه معنایی دارد؟ چه زمانی باید آزمایش را تکرار کرد؟ چه زمانی باید نمونه جدید درخواست شود؟ و در چه شرایطی نباید نتیجه را گزارش کرد؟

در تمام این موقعیت‌ها، تکرار بدون هدف آزمایش راه‌حل مناسبی نیست. کارشناس باید ابتدا مشخص کند خطا ممکن است در کدام مرحله رخ داده باشد و سپس آزمایشی را انتخاب کند که بتواند یکی از علل احتمالی را تأیید یا رد کند. این رویکرد، رفع اشکال آزمایشگاهی را از یک فعالیت تجربی و پراکنده به یک فرآیند علمی و مرحله‌به‌مرحله تبدیل می‌کند.

ایمونوهماتولوژی چه چیزی را بررسی می‌کند؟

ایمونوهماتولوژی علم مطالعه آنتی‌ژن‌های موجود روی گلبول‌های قرمز، آنتی‌بادی‌های موجود در پلاسما یا سرم و واکنش میان آن‌هاست. تعیین گروه خون ABO و Rh، آزمایش آنتی‌گلوبولین مستقیم و غیرمستقیم، غربالگری و شناسایی آنتی‌بادی، کراس‌مچ و بررسی واکنش‌های انتقال خون، مهم‌ترین کاربردهای این علم در آزمایشگاه و بانک خون هستند.

واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی در بسیاری از این آزمایش‌ها به شکل آگلوتیناسیون یا همولیز مشاهده می‌شود. با این حال، هر تجمع گلبول قرمز الزاماً نشان‌دهنده یک واکنش اختصاصی نیست و هر نتیجه منفی نیز الزاماً به معنای نبود آنتی‌بادی نیست. شرایط نمونه، غلظت سوسپانسیون سلولی، نسبت سرم به سلول، دما، زمان انکوباسیون، شست‌وشو، سانتریفیوژ، کیفیت معرف و نحوه خواندن واکنش می‌توانند نتیجه نهایی را تغییر دهند.

بنابراین کارشناس ایمونوهماتولوژی نباید تنها به وجود یا عدم وجود آگلوتیناسیون توجه کند. الگوی واکنش، شدت آن، فاز ایجاد واکنش، سابقه بیمار، نتیجه اتوکنترل، نتیجه DAT و سازگاری یافته‌ها با یکدیگر همگی باید در تفسیر نهایی دخالت داده شوند.

خطای آزمایشگاه ایمونوهماتولوژی چیست؟

خطا در ایمونوهماتولوژی فقط به معنای انجام اشتباه یک مرحله آزمایش نیست. هر اتفاقی که سبب شود نتیجه گزارش‌شده با وضعیت واقعی بیمار تفاوت داشته باشد یا واحد خون نامناسبی انتخاب شود، یک خطای بالقوه محسوب می‌شود. این خطا ممکن است پیش از شروع آزمایش، هنگام انجام آن، در زمان تفسیر یا پس از تأیید نتیجه رخ دهد.

برای مثال، اگر آزمایش از نظر فنی کاملاً صحیح انجام شود اما نمونه متعلق به بیمار دیگری باشد، نتیجه آزمایش هرچند از نظر تکنیکی درست است، برای بیمار موردنظر کاملاً اشتباه خواهد بود. از سوی دیگر، ممکن است نمونه متعلق به بیمار صحیح باشد، اما سوسپانسیون گلبول قرمز بیش از حد غلیظ تهیه شده، شست‌وشوی مرحله AHG ناقص بوده یا واکنش Mixed-field به اشتباه منفی تفسیر شده باشد.

از دیدگاه عملی، خطاهای مهم ایمونوهماتولوژی را می‌توان در چهار گروه بررسی کرد:

خطاهای پیش از آزمایش شامل شناسایی نادرست بیمار، نمونه‌گیری اشتباه، برچسب‌گذاری ناقص، استفاده از نمونه نامناسب و نادیده گرفتن سابقه انتقال خون یا بارداری است.

خطاهای هنگام آزمایش شامل تهیه نادرست سوسپانسیون، نسبت نامناسب سرم و سلول، استفاده اشتباه از معرف‌ها، دما یا زمان نامناسب، شست‌وشوی ناکافی و سانتریفیوژ نامناسب است.

خطاهای تفسیر شامل اشتباه گرفتن رولو با آگلوتیناسیون، نادیده گرفتن واکنش ضعیف، تفسیر نادرست Mixed-field، بی‌توجهی به اثر دوزاژ و گزارش نتیجه بدون حل اختلاف‌هاست.

خطاهای پس از آزمایش شامل ثبت نتیجه برای بیمار اشتباه، انتقال دستی نادرست نتیجه، انتخاب واحد نامناسب و تحویل خون بدون تطبیق کامل اطلاعات است.

این طبقه‌بندی به کارشناس کمک می‌کند هنگام مشاهده یک نتیجه غیرمنتظره، فقط روی یک معرف یا یک مرحله خاص تمرکز نکند و تمام مسیر آزمایش را بررسی کند.

چرا خطاهای ایمونوهماتولوژی اهمیت ویژه دارند؟

بسیاری از خطاهای آزمایشگاهی ممکن است تنها باعث تکرار نمونه یا تأخیر کوتاه در گزارش شوند، اما در بانک خون برخی خطاها می‌توانند مستقیماً به تزریق فرآورده ناسازگار منجر شوند. ناسازگاری ABO، نادیده گرفتن یک آلوآنتی‌بادی مهم یا گزارش اشتباه RhD ممکن است باعث همولیز، کاهش بقای گلبول‌های انتقال‌یافته، واکنش همولیتیک حاد یا تأخیری و ایجاد مشکلات جدی در انتقال‌های بعدی شود.

با وجود این، هدف کارشناس نباید ترس از گزارش نتیجه باشد. هدف، ایجاد یک توقف منطقی در زمانی است که اجزای نتیجه با یکدیگر سازگار نیستند. در ایمونوهماتولوژی، نتیجه‌ای که قابل توضیح نیست نباید فقط به دلیل تکرار شدن، صحیح تلقی شود. تکرار یک روش با همان نمونه، همان معرف و همان شرایط ممکن است فقط همان خطا را دوباره تولید کند.

اصل کاربردی این است:

مسیر کامل آزمایش؛ خطا از کجا وارد می‌شود؟

نتیجه‌ای که در پایان روی برگه یا در سیستم اطلاعات آزمایشگاه ثبت می‌شود، محصول زنجیره‌ای از مراحل به‌هم‌پیوسته است. این مسیر از درخواست آزمایش و شناسایی بیمار آغاز می‌شود، با نمونه‌گیری، انتقال نمونه، پذیرش، انجام آزمایش، خواندن واکنش و تفسیر ادامه می‌یابد و در نهایت به انتخاب و تحویل فرآورده خونی می‌رسد.

وجود کنترل کیفی مناسب برای معرف‌ها نمی‌تواند نمونه متعلق به بیمار اشتباه را شناسایی کند. اتوماسیون نیز همیشه قادر به تشخیص رولو، واکنش Mixed-field ضعیف یا ناسازگاری نتیجه با سابقه بیمار نیست. به همین دلیل، ایمنی انتقال خون به ترکیب چند عامل وابسته است: شناسایی صحیح بیمار، نمونه مناسب، روش معتبر، معرف و تجهیزات سالم و مهم‌تر از همه، تفسیر آگاهانه کارشناس.

گزارش و تحلیل خطاها و رویدادهای نزدیک به خطا نیز بخشی از هموویژیلانس است. هموویژیلانس فقط بررسی واکنش بیمار پس از تزریق نیست، بلکه زنجیره انتقال خون را از جمع‌آوری و آماده‌سازی فرآورده تا تزریق و پیگیری بیمار بررسی می‌کند.

بخش اول: خطاهای پیش‌تحلیلی در بانک خون

شناسایی بیمار؛ مهم‌ترین مرحله‌ای که خارج از لوله آزمایش انجام می‌شود

پیش از بررسی تکنیک‌های آزمایشگاهی باید به این اصل توجه کرد که معتبرترین روش، بهترین معرف و ماهرترین کارشناس نیز نمی‌توانند نتیجه حاصل از نمونه بیمار اشتباه را اصلاح کنند. اگر نمونه متعلق به فرد دیگری باشد، تمام واکنش‌های مشاهده‌شده ممکن است از نظر فنی کاملاً صحیح باشند، اما به بیمار موردنظر تعلق ندارند.

شناسایی بیمار باید در حضور خود بیمار و با استفاده از حداقل دو شناسه مستقل انجام شود. نام و نام خانوادگی به‌تنهایی کافی نیست، زیرا تشابه اسمی، اشتباه شنیداری، حضور بیماران هم‌نام و ثبت ناقص اطلاعات امکان‌پذیر است. شناسه دوم می‌تواند شماره پرونده، کد شناسایی، تاریخ تولد یا شناسه اختصاصی بیمارستان باشد.

در بیمار هوشیار، بهتر است از بیمار خواسته شود نام و اطلاعات خود را بیان کند. سؤال تأییدی مانند «شما آقای محمدی هستید؟» روش مناسبی نیست، زیرا بیمار ممکن است بدون توجه پاسخ مثبت دهد. در بیمار بیهوش، کودک یا فردی که امکان پاسخ‌گویی ندارد، اطلاعات باید از روی دستبند شناسایی و مطابق دستورالعمل مرکز تطبیق داده شود.

نمونه‌گیر نباید تنها به برچسب تخت، اطلاعات همراه بیمار یا گفته شفاهی یکی از کارکنان اتکا کند. تخت بیمار یک شناسه نیست و ممکن است بیمار جابه‌جا شده باشد.

نمونه خون اشتباه در لوله صحیح یا WBIT

یکی از خطرناک‌ترین خطاهای بانک خون، حالتی است که برچسب لوله از نظر ظاهری کامل و صحیح است، اما خون داخل لوله از بیمار دیگری گرفته شده است. این وضعیت با عنوان Wrong Blood in Tube یا WBIT شناخته می‌شود.

خطر اصلی WBIT در این است که آزمایشگاه معمولاً از روی ظاهر نمونه قادر به شناسایی آن نیست. نام، شماره پرونده و سایر اطلاعات روی لوله ممکن است کاملاً با درخواست آزمایش مطابقت داشته باشند، اما محتویات لوله به فرد دیگری تعلق داشته باشد. اگر بیمار سابقه قبلی در سیستم نداشته باشد و نمونه دوم مستقلی نیز گرفته نشود، احتمال دارد گروه خون اشتباه بدون ایجاد هیچ هشدار واضحی پذیرفته شود.

اختلاف گروه خون فعلی با سابقه قبلی بیمار یکی از مهم‌ترین نشانه‌های احتمالی WBIT است، اما این اختلاف همیشه به معنای اشتباه نمونه‌گیری نیست. پیوند سلول‌های بنیادی، انتقال خون گسترده، ضعف آنتی‌ژن‌ها، واکنش Mixed-field یا برخی شرایط بالینی نیز می‌توانند نتیجه را تغییر دهند. بنابراین اختلاف با سابقه باید باعث توقف گزارش و بررسی مرحله‌به‌مرحله شود، نه نتیجه‌گیری عجولانه.

هنگام مشاهده اختلاف غیرقابل توضیح با سابقه بیمار، کارشناس باید هویت نمونه و درخواست را مجدداً بررسی کند، سوابق انتقال خون یا پیوند را ارزیابی کند و در صورت باقی ماندن شک، نمونه جدیدی درخواست کند که مستقل و با شناسایی مجدد بیمار جمع‌آوری شده باشد.

برچسب‌گذاری نمونه

برچسب‌گذاری باید بلافاصله پس از نمونه‌گیری و در کنار بیمار انجام شود. چسباندن برچسب از پیش آماده‌شده روی لوله، حمل هم‌زمان چند لوله بدون برچسب یا تکمیل اطلاعات پس از خروج از اتاق بیمار، احتمال جابه‌جایی نمونه‌ها را افزایش می‌دهد.

برچسب نمونه بانک خون باید مطابق الزامات مرکز حداقل شامل شناسه‌های قطعی بیمار، زمان نمونه‌گیری و مشخصات نمونه‌گیر باشد. اطلاعات برچسب باید با درخواست آزمایش و اطلاعات سیستم مطابقت داشته باشد. هرگونه اختلاف املایی، شماره پرونده متفاوت، برچسب ناخوانا یا اطلاعات ناقص باید پیش از انجام آزمایش بررسی شود.

کارشناس نباید اطلاعات ناقص یا اشتباه را براساس حدس اصلاح کند. نوشتن نام بیمار توسط کارشناس آزمایشگاه روی لوله‌ای که بدون برچسب ارسال شده، هویت واقعی نمونه را اثبات نمی‌کند و می‌تواند یک نمونه ناشناس را به‌اشتباه معتبر جلوه دهد.

چه نمونه‌ای باید رد شود؟

رد نمونه در بانک خون یک مانع اداری نیست، بلکه یک اقدام حفاظتی برای بیمار است. نمونه‌ای که هویت آن قابل اثبات نیست، نباید فقط به دلیل وضعیت اورژانسی، دشواری نمونه‌گیری یا اصرار بخش پذیرفته شود. البته مرکز باید برای شرایط فوریتی مسیر مشخصی داشته باشد، اما فوریت بالینی نباید باعث شود نمونه مشکوک به‌عنوان نمونه معتبر تلقی شود.

نمونه معمولاً در شرایط زیر نیازمند رد یا بررسی فوری است:

اطلاعات شناسایی ناقص یا مغایر باشد؛ لوله فاقد برچسب باشد؛ برچسب در محل نامناسب و پس از نمونه‌گیری تکمیل شده باشد؛ نمونه از نظر نوع لوله یا حجم با روش آزمایش سازگار نباشد؛ همولیز، لخته یا آلودگی بر نتیجه موردنظر اثر بگذارد؛ زمان جمع‌آوری مشخص نباشد؛ یا تاریخچه اخیر انتقال خون و بارداری برای تعیین اعتبار نمونه در دسترس نباشد.

درخواست نمونه جدید باید همراه با توضیح روشن علت رد باشد. عبارت مبهم «نمونه نامناسب» ارزش آموزشی ندارد. بهتر است علت دقیق مانند «مغایرت شماره پرونده روی لوله و درخواست» یا «نمونه بدون شناسه دوم» ثبت شود تا بخش ارسال‌کننده بتواند از تکرار خطا جلوگیری کند.

اعتبار زمانی نمونه پیش از انتقال خون

اعتبار نمونه پیش از انتقال خون به سابقه بیمار و دستورالعمل مرکز وابسته است. انتقال خون یا بارداری اخیر می‌تواند باعث ایجاد آنتی‌بادی جدید یا افزایش مجدد آنتی‌بادی‌ای شود که در نمونه قدیمی قابل تشخیص نبوده است. بنابراین کارشناس باید پیش از پذیرش نمونه برای آزمایش سازگاری، از زمان نمونه‌گیری و سابقه بالینی مرتبط اطمینان حاصل کند.

استفاده از نمونه قدیمی ممکن است موجب شود آنتی‌بادی ایجادشده پس از جمع‌آوری نمونه شناسایی نشود. در بیماران دارای انتقال خون مکرر، سابقه آنتی‌بادی حتی اگر غربالگری فعلی منفی باشد، اهمیت ویژه دارد و نباید صرفاً براساس نتیجه نمونه فعلی نادیده گرفته شود.

همولیز، لخته و آلودگی نمونه

همولیز موجود در نمونه می‌تواند تفسیر همولیز ناشی از واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را دشوار کند. اگر روش آزمایش همولیز را به‌عنوان نشانه واکنش مثبت در نظر می‌گیرد، استفاده از نمونه از قبل همولیزشده ممکن است باعث تفسیر اشتباه شود.

وجود لخته در نمونه‌ای که انتظار می‌رود حاوی گلبول‌های سالم و قابل استفاده باشد، می‌تواند تهیه سوسپانسیون مناسب را مختل کند یا باعث گیر افتادن سلول‌ها در رشته‌های فیبرین شود. ذرات فیبرین گاهی هنگام خواندن واکنش با آگلوتیناسیون ضعیف یا توده سلولی اشتباه گرفته می‌شوند.

آلودگی میکروبی، نگهداری طولانی‌مدت یا شرایط نامناسب انتقال نیز ممکن است باعث همولیز، تغییر شکل سلول‌ها و ایجاد واکنش‌های غیرقابل اعتماد شود. بنابراین ظاهر نمونه باید پیش از آزمایش بررسی و هر یافته غیرطبیعی ثبت شود.

سابقه بیمار بخشی از آزمایش است

تفسیر آزمون‌های ایمونوهماتولوژی بدون بررسی سابقه بیمار ناقص است. اطلاعاتی مانند انتقال خون اخیر، بارداری، پیوند سلول بنیادی، مصرف برخی داروها، تشخیص بیماری‌های هماتولوژیک، سابقه آنتی‌بادی و نتایج قبلی ABO و Rh می‌توانند علت یک واکنش غیرمنتظره را روشن کنند.

برای مثال، واکنش Mixed-field ممکن است در اثر انتقال گلبول قرمز با گروه متفاوت، پیوند سلول‌های بنیادی یا وجود دو جمعیت سلولی ایجاد شود. غربالگری منفی نیز سابقه یک آنتی‌بادی مهم را حذف نمی‌کند، زیرا تیتر آنتی‌بادی ممکن است با گذشت زمان به زیر حد تشخیص رسیده باشد. به همین دلیل، سوابق آنتی‌بادی باید حفظ شوند و هنگام انتخاب خون سازگار مورد توجه قرار گیرند.

بخش دوم: خطاهای عمومی هنگام انجام آزمایش

سوسپانسیون نامناسب گلبول قرمز

بسیاری از واکنش‌های لوله‌ای به غلظت صحیح گلبول قرمز وابسته‌اند. سوسپانسیون بیش از حد غلیظ، تعداد آنتی‌ژن‌های موجود در محیط واکنش را افزایش می‌دهد و نسبت سرم یا معرف به سلول را تغییر می‌دهد. این وضعیت می‌تواند واکنش‌های ضعیف را کاهش دهد یا خواندن آگلوتیناسیون را دشوار کند.

در مقابل، سوسپانسیون بسیار رقیق ممکن است باعث ایجاد توده‌های کوچک و پراکنده شود که شدت آن‌ها بیش از مقدار واقعی به نظر برسد یا در هنگام دور ریختن سوپرناتانت، بخشی از سلول‌ها از دست برود. نوع روش، معرف و دستورالعمل سازنده تعیین می‌کند چه غلظتی باید استفاده شود؛ بنابراین یک غلظت ثابت برای تمام روش‌ها مناسب نیست.

سوسپانسیون باید یکنواخت، فاقد لخته و با استفاده از سلول‌های مناسب تهیه شود. تخمین چشمی بدون آموزش و کنترل کافی می‌تواند سبب اختلاف میان کارشناسان شود. همچنین انتقال مستقیم خون کامل به لوله بدون تهیه سوسپانسیون استاندارد، نسبت سلول به معرف را غیرقابل کنترل می‌کند.

نسبت نامناسب سرم و سلول

واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی به نسبت مناسب میان آنتی‌بادی موجود در سرم یا معرف و آنتی‌ژن‌های سطح گلبول قرمز نیاز دارد. کاهش حجم سرم می‌تواند مقدار آنتی‌بادی در دسترس را کم کند و باعث از دست رفتن واکنش‌های ضعیف شود. افزودن سلول بیش از حد نیز اثر مشابهی دارد.

در مقابل، افزودن حجم‌های غیرضروری و خارج از دستورالعمل ممکن است شرایط واکنش، قدرت یونی محیط و قابلیت خواندن نتیجه را تغییر دهد. پیپت باید حجم صحیح را تحویل دهد و کارشناس باید از تشکیل کامل قطره، باقی نماندن مایع در نوک و جلوگیری از انتقال آلودگی میان نمونه‌ها مطمئن شود.

اشتباه در افزودن نمونه یا معرف

یکی از ساده‌ترین اما مهم‌ترین خطاها، فراموش کردن افزودن سرم، سلول یا معرف است. این خطا در لوله‌های متعدد، شیفت‌های شلوغ و زمانی که ترتیب کار قطع می‌شود بیشتر رخ می‌دهد. نتیجه ممکن است کاملاً منفی به نظر برسد و در صورت نبود کنترل مناسب، به‌اشتباه گزارش شود.

برای کاهش این خطا، لوله‌ها باید پیش از شروع به‌وضوح شناسایی شوند، افزودن مواد با ترتیب ثابت انجام شود و هر مرحله بلافاصله ثبت یا علامت‌گذاری شود. کارشناس نباید چندین نمونه را به‌صورت هم‌زمان و بدون نظم مشخص آماده کند. همچنین بازگشت به یک ردیف نیمه‌کاره پس از تماس تلفنی یا وقفه کاری، یکی از موقعیت‌های پرخطر است.

زمان و دمای نامناسب

برخی آنتی‌بادی‌ها در دمای اتاق یا پایین‌تر بهتر واکنش می‌دهند، در حالی که آنتی‌بادی‌های IgG دارای اهمیت بالینی معمولاً در ۳۷ درجه سانتی‌گراد و فاز AHG بهتر شناسایی می‌شوند. تغییر دما یا زمان انکوباسیون ممکن است واکنش موردنظر را کاهش دهد یا واکنش‌های مزاحم را تقویت کند.

انکوباسیون کوتاه‌تر از زمان تعیین‌شده ممکن است فرصت کافی برای اتصال آنتی‌بادی فراهم نکند. انکوباسیون طولانی‌تر نیز الزاماً حساسیت را افزایش نمی‌دهد و ممکن است باعث خشک شدن لبه لوله، افزایش واکنش‌های غیراختصاصی یا تأخیر غیرضروری شود.

دمای واقعی انکوباتور یا بن‌ماری باید معتبر باشد. مشاهده عدد ۳۷ روی نمایشگر به‌تنهایی ثابت نمی‌کند که دمای واقعی داخل محفظه یا لوله همان مقدار است.

سانتریفیوژ کمتر یا بیشتر از حد لازم

سانتریفیوژ ناکافی ممکن است تماس سلول‌ها را کاهش دهد و یک واکنش واقعی را ضعیف یا منفی نشان دهد. سانتریفیوژ بیش از حد نیز می‌تواند رسوب سلولی بسیار فشرده‌ای ایجاد کند که به‌سختی باز می‌شود و به اشتباه آگلوتیناسیون مثبت تلقی می‌شود.

برای خواندن صحیح واکنش لوله‌ای، رسوب باید با حرکت کنترل‌شده و ملایم باز شود. تکان شدید می‌تواند آگلوتینات‌های ضعیف را بشکند، در حالی که تکان ناکافی ممکن است رسوب فشرده را به شکل توده مثبت نشان دهد. تنظیم سانتریفیوژ باید براساس روش و دستورالعمل سازنده باشد و زمان‌سنج و سرعت آن به‌صورت دوره‌ای بررسی شوند.

تأخیر در خواندن واکنش

واکنش باید در زمان تعیین‌شده خوانده شود. باقی ماندن طولانی لوله‌ها پس از سانتریفیوژ می‌تواند باعث فشرده شدن رسوب، خشک شدن بخشی از نمونه یا تغییر الگوی تجمع سلولی شود. در برخی روش‌ها، تأخیر ممکن است سبب جدا شدن آگلوتینات‌های ضعیف یا ایجاد ظاهری شود که تفسیر آن دشوار است.

ثبت شدت واکنش نیز باید هم‌زمان با خواندن انجام شود. اتکا به حافظه، به‌ویژه هنگام خواندن چندین لوله، می‌تواند الگوی واقعی واکنش را تغییر دهد.

خواندن و درجه‌بندی نادرست آگلوتیناسیون

درجه‌بندی آگلوتیناسیون فقط یک توصیف ظاهری نیست. تفاوت میان واکنش 4+، 2+، 1+، واکنش ضعیف و Mixed-field می‌تواند در تشخیص عدم تطابق ABO، اثر دوزاژ، حضور بیش از یک آنتی‌بادی یا وجود دو جمعیت سلولی تعیین‌کننده باشد.

کارشناس باید علاوه بر اندازه آگلوتینات‌ها به شفافیت سوپرناتانت، وجود سلول آزاد، همولیز و توزیع جمعیت سلولی توجه کند. گزارش صرف «مثبت» یا «منفی» بسیاری از اطلاعات تفسیرکننده را از بین می‌برد.

رولو؛ تجمع غیرایمنی که می‌تواند با آگلوتیناسیون اشتباه شود

رولو (Rouleaux) حالتی است که گلبول‌های قرمز مانند ستون‌های سکه کنار یکدیگر قرار می‌گیرند. این پدیده معمولاً به‌دلیل تغییر نسبت پروتئین‌های پلاسما و کاهش نیروی دافعه میان گلبول‌های قرمز ایجاد می‌شود و برخلاف آگلوتیناسیون واقعی، حاصل اتصال اختصاصی آنتی‌بادی به آنتی‌ژن نیست.

رولو به‌ویژه در بک‌تایپ، کراس‌مچ و برخی آزمون‌هایی که از سرم یا پلاسمای بیمار استفاده می‌کنند، می‌تواند نتیجه مثبت کاذب ایجاد کند. وجود واکنش‌های مشابه با چند سلول مختلف، سابقه افزایش پروتئین‌های پلاسما و ظاهر سکه‌ای در بررسی میکروسکوپی می‌تواند به تشخیص کمک کند.

تکنیک جایگزینی سالین (Saline Replacement) یکی از روش‌های کاربردی برای افتراق رولو از آگلوتیناسیون واقعی در روش لوله‌ای است. در این روش، پس از سانتریفیوژ، پلاسمای روی سلول‌ها با سالین جایگزین می‌شود، بدون آنکه رسوب سلولی برهم زده شود. از بین رفتن تجمع پس از جایگزینی سالین به نفع رولو است؛ باقی ماندن آگلوتیناسیون احتمال واکنش واقعی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را مطرح می‌کند.

اثر دوزاژ؛ علت مهم واکنش ضعیف یا منفی کاذب

برخی آنتی‌بادی‌ها با گلبول‌هایی که آنتی‌ژن مربوطه را به‌صورت هموزیگوت بیان می‌کنند، واکنش قوی‌تری دارند و ممکن است با سلول‌های هتروزیگوت واکنش ضعیف یا حتی منفی نشان دهند. این پدیده اثر دوزاژ (Dosage Effect) نام دارد.

اثر دوزاژ در سیستم‌هایی مانند Rh، Kidd، Duffy و MNS اهمیت ویژه‌ای دارد. اگر سلول‌های غربالگری یا پنل فقط آنتی‌ژن هتروزیگوت داشته باشند، ممکن است یک آنتی‌بادی دارای دوزاژ شناسایی نشود. بنابراین نتیجه منفی با یک سلول، لزوماً وجود آنتی‌بادی را رد نمی‌کند و باید وضعیت هموزیگوت یا هتروزیگوت آنتی‌ژن‌ها در آنتی‌گرام بررسی شود.

بخش سوم: خطاهای تعیین گروه خون ABO و روش مرحله‌به‌مرحله رفع عدم تطابق

تعیین گروه خون ABO یکی از پایه‌ای‌ترین و در عین حال حساس‌ترین آزمایش‌های بانک خون است. سادگی ظاهری این آزمایش گاهی باعث می‌شود کارشناس تصور کند هر نتیجه‌ای که در سل‌تایپ به دست می‌آید، مستقیماً قابل گزارش است؛ در حالی که گروه‌بندی ABO زمانی معتبر است که نتیجه بررسی آنتی‌ژن‌های گلبول قرمز با نتیجه بررسی آنتی‌بادی‌های طبیعی پلاسما یا سرم بیمار مطابقت داشته باشد.

در افراد بالغ و در شرایط معمول، سل‌تایپ و بک‌تایپ باید یکدیگر را تأیید کنند. اگر این دو بخش با هم سازگار نباشند، گزارش نهایی گروه خون نباید تا زمان یافتن علت اختلاف انجام شود. عدم تطابق ABO ممکن است ناشی از یک خطای ساده تکنیکی باشد، اما می‌تواند اولین نشانه یک وضعیت مهم مانند زیرگروه A، نقص ایمنی، بدخیمی خونی، انتقال خون اخیر، پیوند سلول بنیادی، اتوآنتی‌بادی سرد یا دو جمعیت گلبول قرمز نیز باشد.

بنابراین، اصل اساسی در بررسی اختلاف ABO این است:

سل‌تایپ و بک‌تایپ چه تفاوتی دارند؟

در سل‌تایپ یا Forward Typing، گلبول‌های قرمز بیمار با معرف‌های شناخته‌شده Anti-A و Anti-B و در صورت نیاز Anti-AB بررسی می‌شوند. هدف این بخش، شناسایی آنتی‌ژن‌های A و B روی سطح گلبول قرمز بیمار است.

در بک‌تایپ یا Reverse Typing، سرم یا پلاسمای بیمار با سلول‌های معرف A1 و B و در برخی روش‌ها با سلول O بررسی می‌شود. هدف این قسمت، شناسایی آنتی‌بادی‌های مورد انتظار Anti-A و Anti-B در پلاسماست.

برای مثال، فرد گروه A باید در سل‌تایپ با Anti-A واکنش مثبت و با Anti-B واکنش منفی داشته باشد. در بک‌تایپ نیز سرم او باید با سلول B واکنش دهد و با سلول A1 واکنش ندهد.

اگر یکی از این الگوها کامل نباشد، باید مشخص شود مشکل در بخش سلولی، بخش سرمی یا هر دو قرار دارد.

پیش از بررسی اختلاف ABO، ابتدا خطای تکنیکی را رد کنید

کارشناس نباید بلافاصله هر اختلاف ABO را به زیرگروه‌های نادر یا بیماری‌های پیچیده نسبت دهد. بخش قابل توجهی از عدم تطابق‌ها ناشی از خطاهای ساده‌ای است که با بازبینی دقیق فرآیند شناسایی می‌شوند.

ابتدا باید هویت بیمار، اطلاعات روی لوله و درخواست آزمایش بررسی شود. سپس نمونه از نظر همولیز، لخته، آلودگی و تاریخ جمع‌آوری ارزیابی گردد. معرف‌ها باید از نظر تاریخ انقضا، شرایط نگهداری، ظاهر و کنترل کیفی بررسی شوند.

پس از آن باید مطمئن شد سوسپانسیون سلولی با غلظت مناسب تهیه شده، قطره صحیح از معرف و نمونه استفاده شده، لوله‌ها به‌درستی برچسب‌گذاری شده‌اند و سانتریفیوژ با زمان و سرعت مناسب انجام شده است.

اگر کوچک‌ترین احتمال جابه‌جایی نمونه، لوله یا معرف وجود دارد، آزمایش باید با شناسایی مجدد و ترجیحاً از نمونه جدید تکرار شود. تکرار آزمایش با همان خطای اولیه، هیچ ارزشی ندارد.

دسته‌بندی عملی عدم تطابق ABO

برای سهولت بررسی، اختلاف‌های ABO معمولاً بر اساس محل ضعف یا واکنش اضافی به چهار گروه کلی تقسیم می‌شوند.

در گروه اول، آنتی‌بادی‌های مورد انتظار در بک‌تایپ ضعیف یا غایب‌اند.

در گروه دوم، آنتی‌ژن‌های A یا B در سل‌تایپ ضعیف یا غایب به نظر می‌رسند.

در گروه سوم، پروتئین‌های غیرطبیعی پلاسما باعث رولو و واکنش کاذب می‌شوند.

در گروه چهارم، شرایط پیچیده‌ای مانند اتوآنتی‌بادی، آلوآنتی‌بادی، انتقال خون، پیوند، Mixed-field یا واکنش‌های غیرمنتظره وجود دارد.

این تقسیم‌بندی برای شروع رفع اشکال مفید است، اما نباید باعث شود کارشناس تنها به یک گروه محدود شود. برخی بیماران ممکن است هم‌زمان بیش از یک علت داشته باشند.

گروه اول: ضعف یا فقدان آنتی‌بادی‌های مورد انتظار در بک‌تایپ

در این حالت، سل‌تایپ معمولاً واضح است اما سرم بیمار با سلول A1 یا B واکنش مورد انتظار را نشان نمی‌دهد یا واکنش بسیار ضعیف است.

برای مثال، سل‌تایپ الگوی گروه A را نشان می‌دهد، اما سرم بیمار با سلول B واکنش منفی یا 1+ دارد. در چنین شرایطی باید به کاهش یا فقدان Anti-B فکر کرد.

نوزادان و کودکان خردسال

بک‌تایپ در نوزادان و کودکان بسیار کم‌سن قابل اتکای کامل نیست، زیرا آنتی‌بادی‌های طبیعی ABO هنوز به مقدار کافی ایجاد نشده‌اند. به همین دلیل، تعیین گروه خون نوزاد عمدتاً بر اساس سل‌تایپ انجام می‌شود و بک‌تایپ ممکن است ضعیف، ناقص یا فاقد واکنش باشد.

وجود آنتی‌بادی مادری نیز می‌تواند تفسیر نمونه نوزاد را پیچیده کند. بنابراین سن بیمار باید پیش از تفسیر بک‌تایپ بررسی شود.

سالمندان

در سالمندان، به‌ویژه افراد بسیار مسن یا بیماران دچار ضعف سیستم ایمنی، تیتر آنتی‌بادی‌های طبیعی ABO ممکن است کاهش یابد. در نتیجه، واکنش بک‌تایپ ضعیف‌تر از حد انتظار دیده می‌شود.

اگر سل‌تایپ واضح باشد اما بک‌تایپ ضعیف باشد، افزایش زمان انکوباسیون در دمای اتاق یا انکوباسیون کنترل‌شده در دمای پایین‌تر ممکن است واکنش را تقویت کند. با این حال، سرمای بیش از حد می‌تواند اتوآنتی‌بادی‌های سرد یا آنتی‌بادی‌های مزاحم را نیز فعال کند؛ بنابراین نتیجه باید با احتیاط تفسیر شود.

نقص ایمنی و کاهش ایمونوگلوبولین

در هیپوگاماگلوبولینمی، آگاماگلوبولینمی، نقص‌های ایمنی، مصرف داروهای سرکوب‌کننده سیستم ایمنی و برخی بدخیمی‌های لنفوئیدی، تولید آنتی‌بادی‌های طبیعی ممکن است کاهش یابد.

در این بیماران، بک‌تایپ می‌تواند ضعیف یا منفی باشد، در حالی که سل‌تایپ طبیعی و واضح است. بررسی سابقه بالینی و نتایج آزمایش‌های ایمونوگلوبولین می‌تواند به توضیح اختلاف کمک کند.

لوسمی، لنفوم و بیماری‌های خونی

برخی بیماران مبتلا به لوسمی، لنفوم یا اختلالات مغز استخوان ممکن است به دلیل اختلال ایمنی، درمان شیمیایی یا پیوند، آنتی‌بادی‌های ضعیف‌تری داشته باشند.

در این موارد، نتیجه نباید صرفاً با افزایش زمان انکوباسیون مجبور به مثبت شدن شود. هدف، پیدا کردن علت واقعی است، نه ایجاد واکنش به هر قیمت.

انتقال حجم زیاد پلاسما یا تعویض پلاسما

دریافت مقادیر زیاد پلاسما، تعویض پلاسما یا برخی درمان‌های جایگزینی می‌تواند غلظت آنتی‌بادی‌های طبیعی بیمار را کاهش دهد یا آنتی‌بادی‌های خارجی وارد گردش خون کند. در نتیجه، الگوی بک‌تایپ ممکن است با سل‌تایپ مطابقت کامل نداشته باشد.

بررسی نوع فرآورده‌های تزریق‌شده و زمان دریافت آن‌ها برای تفسیر ضروری است.

روش عملی بررسی ضعف بک‌تایپ

پس از رد خطای تکنیکی، ابتدا مقدار سرم و سلول‌های معرف بررسی شود. واکنش با سلول‌های A1 و B مجدداً با سوسپانسیون معتبر انجام شود. در صورت نیاز، زمان انکوباسیون در دمای اتاق افزایش یابد.

اگر همچنان واکنش ضعیف باشد، می‌توان انکوباسیون در دمای پایین‌تر را مطابق روش معتبر مرکز انجام داد. کنترل اتولوگ و بررسی واکنش با سلول O می‌تواند به شناسایی آنتی‌بادی سرد غیر ABO کمک کند.

اگر بیمار نوزاد، سالمند، دچار نقص ایمنی یا تحت درمان خاص است، علت بالینی باید در تفسیر لحاظ شود.

گروه دوم: ضعف یا فقدان آنتی‌ژن‌های مورد انتظار در سل‌تایپ

در این گروه، بک‌تایپ ممکن است الگوی مشخصی نشان دهد، اما واکنش گلبول‌های بیمار با Anti-A یا Anti-B ضعیف‌تر از حد انتظار است.

برای مثال، بک‌تایپ به نفع گروه A است، اما واکنش سل‌تایپ با Anti-A فقط 1+ یا Mixed-field است.

زیرگروه‌های A

زیرگروه‌های A یکی از مهم‌ترین علل واکنش ضعیف با Anti-A هستند. گروه‌های A1 و A2 شایع‌ترین فنوتیپ‌های A محسوب می‌شوند، اما زیرگروه‌های ضعیف‌تری مانند A3، Ax، Am و Ael نیز وجود دارند.

شدت واکنش در این زیرگروه‌ها ممکن است از واکنش ضعیف تا Mixed-field یا حتی منفی متغیر باشد. برخی افراد دارای زیرگروه A2 یا A2B ممکن است Anti-A1 تولید کنند که در بک‌تایپ با سلول A1 واکنش می‌دهد و باعث اختلاف می‌شود.

برای بررسی زیرگروه A می‌توان از Anti-A,B، لکتین Anti-A1 و سلول A2 استفاده کرد. نتیجه این آزمون‌ها باید همراه با الگوی واکنش و سابقه بیمار تفسیر شود.

زیرگروه‌های ضعیف B

زیرگروه‌های ضعیف B نادرترند، اما می‌توانند باعث واکنش کم‌رنگ با Anti-B شوند. در این موارد، Anti-A,B ممکن است واکنش قوی‌تری نسبت به Anti-B نشان دهد.

بررسی جذب و رهایش، مواد گروهی محلول در بزاق و روش‌های مولکولی در مراکز مرجع می‌تواند برای تعیین دقیق فنوتیپ استفاده شود.

بدخیمی‌های خونی و کاهش بیان آنتی‌ژن

در برخی لوسمی‌ها، سندرم‌های میلودیسپلاستیک و سایر بیماری‌های مغز استخوان، بیان آنتی‌ژن‌های A یا B روی سطح گلبول قرمز ممکن است کاهش یابد.

این کاهش گاهی فقط در بخشی از سلول‌ها رخ می‌دهد و الگوی Mixed-field ایجاد می‌کند. مقایسه با گروه خون قبلی بیمار و بررسی بیماری زمینه‌ای در این وضعیت بسیار مهم است.

آنتی‌ژن اکتسابی B

در برخی بیماران گروه A، به‌ویژه در بیماری‌های گوارشی، عفونت‌های باکتریایی یا بدخیمی‌های کولون، تغییرات آنزیمی می‌تواند ساختاری شبیه آنتی‌ژن B روی گلبول قرمز ایجاد کند. این پدیده با عنوان Acquired B شناخته می‌شود.

در چنین حالتی، گلبول‌های بیمار ممکن است با برخی معرف‌های Anti-B واکنش ضعیف نشان دهند، در حالی که بک‌تایپ همچنان الگوی گروه A را دارد.

بررسی سابقه قبلی گروه خون، نوع کلون Anti-B، شست‌وشوی سلول‌ها و استفاده از روش‌های تأییدی می‌تواند به حل اختلاف کمک کند.

مقدار زیاد مواد گروهی محلول در پلاسما

در برخی شرایط نادر مانند برخی بدخیمی‌ها، مقدار زیادی ماده گروهی محلول A یا B در پلاسما وجود دارد. اگر گلبول‌ها به‌خوبی شسته نشده باشند، این مواد ممکن است معرف را خنثی کنند و باعث واکنش ضعیف یا منفی کاذب در سل‌تایپ شوند.

شست‌وشوی کامل گلبول‌های قرمز و تکرار آزمایش می‌تواند مشکل را برطرف کند.

روش عملی بررسی ضعف سل‌تایپ

ابتدا گلبول‌های بیمار سه بار با سالین شسته شوند و سوسپانسیون تازه تهیه شود. آزمایش با Anti-A، Anti-B و Anti-A,B تکرار گردد.

شدت و نوع واکنش، به‌ویژه وجود Mixed-field، ثبت شود. در صورت شک به زیرگروه A، از Anti-A1 Lectin و سلول A2 استفاده شود. سابقه قبلی گروه خون، بیماری خونی، انتقال خون و پیوند بررسی گردد.

اگر نتیجه همچنان مبهم است و تعیین دقیق برای تصمیم بالینی ضروری است، نمونه باید به آزمایشگاه مرجع ارسال شود.

گروه سوم: رولو و پروتئین‌های غیرطبیعی

در این گروه، افزایش پروتئین‌های پلاسما باعث تجمع غیرایمنی گلبول‌ها می‌شود. واکنش کاذب ممکن است هم در سل‌تایپ و هم در بک‌تایپ دیده شود، اما اغلب در بک‌تایپ واضح‌تر است؛ زیرا سرم بیمار مستقیماً در واکنش حضور دارد.

مولتیپل میلوما، ماکروگلوبولینمی والدنستروم، التهاب شدید، دریافت برخی محلول‌های حجیم‌کننده پلاسما و افزایش فیبرینوژن از علل مهم رولو هستند.

اگر تمام سلول‌های بک‌تایپ واکنش مشابه نشان دهند، به‌ویژه اگر اتوکنترل نیز مثبت باشد، باید رولو در نظر گرفته شود.

در روش لوله‌ای، تکنیک Saline Replacement می‌تواند برای افتراق رولو از آگلوتیناسیون واقعی استفاده شود. برای سل‌تایپ نیز شست‌وشوی گلبول‌های بیمار ممکن است پروتئین‌های مزاحم را حذف کند.

گروه چهارم: واکنش‌های اضافی یا غیرمنتظره

این گروه شامل شرایطی است که واکنش‌هایی خارج از الگوی معمول ABO ایجاد می‌کنند. آنتی‌بادی‌های سرد، آلوآنتی‌بادی‌ها، اتوآنتی‌بادی‌ها، Mixed-field، انتقال خون اخیر، پیوند سلول بنیادی و مثبت بودن DAT از مهم‌ترین علل آن هستند.

اتوآنتی‌بادی سرد

یک اتوآنتی‌بادی سرد ممکن است با گلبول‌های خود بیمار و سلول‌های معرف واکنش دهد و باعث مثبت شدن غیرمنتظره سل‌تایپ یا بک‌تایپ شود.

اگر اتوکنترل مثبت باشد و واکنش‌ها در دمای پایین قوی‌تر شوند، احتمال آنتی‌بادی سرد مطرح می‌شود. گرم کردن نمونه، معرف‌ها و تجهیزات به دمای ۳۷ درجه و استفاده از تکنیک Prewarm می‌تواند به کاهش مزاحمت کمک کند.

با این حال، تکنیک Prewarm باید مطابق روش معتبر انجام شود، زیرا اجرای نادرست آن می‌تواند برخی آنتی‌بادی‌های دارای اهمیت بالینی را نیز کاهش دهد.

آلوآنتی‌بادی سرد

برخی آلوآنتی‌بادی‌ها مانند Anti-M، Anti-P1 یا Anti-Lea ممکن است در دمای اتاق با سلول‌های بک‌تایپ واکنش دهند. اگر سلول A1 یا B حامل آنتی‌ژن مربوطه باشد، واکنش اضافی ایجاد می‌شود و ممکن است به‌اشتباه به عنوان آنتی‌بادی ABO تفسیر شود.

بررسی واکنش با سلول‌های اضافی، سلول O، اتوکنترل و پانل آنتی‌بادی می‌تواند به افتراق کمک کند.

DAT مثبت

اگر گلبول‌های بیمار در بدن با IgG یا کمپلمان پوشیده شده باشند، DAT مثبت خواهد شد. این پوشش ممکن است در برخی روش‌ها سبب واکنش غیراختصاصی یا تفسیر دشوار سل‌تایپ شود.

در چنین شرایطی، شست‌وشوی گلبول‌ها و بررسی DAT ضروری است. در صورت نیاز، روش‌های حذف آنتی‌بادی از سطح سلول یا استفاده از نمونه جایگزین باید طبق دستورالعمل انجام شود.

انتقال خون اخیر

بیماری که به‌تازگی گلبول قرمز دریافت کرده است، ممکن است دو جمعیت سلولی متفاوت در گردش خون داشته باشد. اگر گروه خون واحدهای تزریق‌شده با گروه بیمار متفاوت باشد، سل‌تایپ می‌تواند Mixed-field نشان دهد.

برای مثال، بیمار گروه A که در شرایط اورژانسی گلبول O دریافت کرده است، ممکن است در واکنش با Anti-A هم‌زمان سلول‌های آگلوتینه‌شده و سلول‌های آزاد نشان دهد.

بررسی تاریخچه انتقال، تعداد و گروه واحدهای تزریق‌شده و گروه خون قبلی بیمار در تفسیر اهمیت دارد.

پیوند سلول‌های بنیادی خون‌ساز

پس از پیوند سلول‌های بنیادی با گروه ABO متفاوت، گروه خونی بیمار ممکن است به‌تدریج تغییر کند. در دوره انتقالی، واکنش Mixed-field، ضعف آنتی‌ژن‌ها یا اختلاف میان سل‌تایپ و بک‌تایپ قابل مشاهده است.

تفسیر این بیماران باید با اطلاع از گروه ABO بیمار و دهنده، نوع پیوند و زمان سپری‌شده از پیوند انجام شود.

کیمریسم و دو جمعیت سلولی

کیمریسم می‌تواند در دوقلوها، پس از پیوند یا در برخی شرایط نادر ایجاد شود. حضور دو جمعیت گلبول قرمز با فنوتیپ متفاوت ممکن است واکنش Mixed-field واقعی ایجاد کند.

در این حالت، برخلاف رسوب فشرده یا آگلوتیناسیون ضعیف، دو جمعیت مشخص از سلول‌های آگلوتینه و غیرآگلوتینه دیده می‌شوند.

Mixed-field در گروه‌بندی ABO

Mixed-field یکی از یافته‌هایی است که نباید به‌سادگی به‌عنوان 2+ یا واکنش ضعیف گزارش شود. در این الگو، بخشی از گلبول‌ها آگلوتینه می‌شوند و بخشی دیگر به‌صورت آزاد باقی می‌مانند.

علل مهم Mixed-field شامل انتقال خون با گروه متفاوت، پیوند سلول بنیادی، زیرگروه A3 یا B3، کیمریسم، انتقال خون جنین و مادر و برخی بدخیمی‌های خونی است.

برای تأیید Mixed-field، باید رسوب به‌آرامی باز شود و الگوی دو جمعیتی به‌دقت بررسی شود. در صورت شک، مشاهده میکروسکوپی یا استفاده از روش ژل می‌تواند کمک‌کننده باشد.

تاریخچه بالینی بیمار در تفسیر این یافته ضروری است. Mixed-field بدون بررسی سابقه نباید صرفاً به‌عنوان زیرگروه ضعیف گزارش شود.

الگوریتم عملی بررسی عدم تطابق ABO

هنگامی که سل‌تایپ و بک‌تایپ تطابق ندارند، کارشناس می‌تواند به ترتیب زیر عمل کند:

ابتدا گزارش گروه خون متوقف شود و نتیجه اولیه به‌عنوان نتیجه قطعی وارد سیستم نشود.

هویت بیمار، لوله، درخواست و سابقه گروه خون قبلی بررسی شود.

آزمایش با لوله‌های جدید، معرف معتبر و سوسپانسیون تازه تکرار شود.

واکنش‌ها با شدت کامل و نوع الگو، از جمله Mixed-field، ثبت شوند.

اگر مشکل در بک‌تایپ است، سن، وضعیت ایمنی، آنتی‌بادی سرد و نسبت سرم به سلول بررسی شود.

اگر مشکل در سل‌تایپ است، گلبول‌ها شسته شوند و احتمال زیرگروه، انتقال خون، پیوند یا DAT مثبت ارزیابی گردد.

اگر واکنش‌های کاذب متعدد وجود دارد، رولو و آنتی‌بادی سرد بررسی شوند.

اتوکنترل، DAT، سلول O، Anti-A,B، Anti-A1 Lectin و سلول A2 بر اساس الگوی اختلاف انتخاب شوند.

تا زمان حل اختلاف، فرآورده خونی باید مطابق سیاست ایمن مرکز و با در نظر گرفتن سازگاری ABO انتخاب شود.

کنترل کیفی تعیین گروه خون

رفع اشکال بیمار زمانی معتبر است که کارشناس از عملکرد صحیح معرف‌ها و سیستم آزمایش مطمئن باشد. کنترل کیفی Anti-A، Anti-B، Anti-AB، سلول‌های A1 و B و سایر معرف‌های مورد استفاده باید طبق برنامه آزمایشگاه انجام شده باشد.

کنترل مثبت نشان می‌دهد معرف توانایی ایجاد واکنش مورد انتظار را دارد و کنترل منفی، اختصاصیت آن را بررسی می‌کند. تغییر شدت واکنش نسبت به روزهای قبل، حتی اگر نتیجه همچنان مثبت باشد، می‌تواند نشانه افت فعالیت معرف یا مشکل فنی باشد.

سلول‌های معرف باید از نظر همولیز، کدورت، آلودگی، تاریخ انقضا و پروفایل آنتی‌ژنی بررسی شوند. معرف‌ها نباید بین لوله‌ها تماس پیدا کنند و قطره‌چکان هر ویال فقط برای همان معرف استفاده شود.

چه زمانی باید نمونه جدید درخواست شود؟

نمونه جدید زمانی ضروری است که هویت نمونه مورد تردید باشد، نتیجه با سابقه قبلی اختلاف غیرقابل توضیح داشته باشد، احتمال WBIT وجود داشته باشد یا کیفیت نمونه اجازه تفسیر معتبر ندهد.

همچنین اگر انتقال خون یا درمانی بین زمان نمونه‌گیری و انجام آزمایش رخ داده باشد که بتواند نتیجه را تغییر دهد، نمونه تازه ممکن است لازم باشد.

درخواست نمونه جدید نباید به‌عنوان جایگزین بررسی علمی استفاده شود. اگر یک اختلاف بیولوژیک واقعی وجود داشته باشد، نمونه جدید ممکن است همان نتیجه را تکرار کند. بنابراین علت درخواست باید روشن باشد: رفع شک هویتی، جایگزینی نمونه نامناسب یا بررسی تغییر جدید وضعیت بیمار.

چه زمانی می‌توان گروه خون را گزارش کرد؟

گروه خون زمانی قابل گزارش است که سل‌تایپ و بک‌تایپ با هم سازگار باشند یا علت اختلاف به‌طور مستند مشخص شده باشد.

در نوزادان، برخی بیماران پیوندی یا شرایط خاص، ممکن است تطابق کلاسیک وجود نداشته باشد. در این موارد، گزارش باید مطابق سیاست آزمایشگاه و با توضیح مناسب انجام شود.

کارشناس نباید با حذف نتیجه‌ای که با فرض اولیه هماهنگ نیست، اختلاف را ظاهراً برطرف کند. برای مثال، حذف بک‌تایپ غیرمنتظره یا نادیده گرفتن واکنش Mixed-field، حل اختلاف محسوب نمی‌شود.

در ایمونوهماتولوژی، نتیجه معتبر نتیجه‌ای نیست که ساده‌تر به نظر برسد؛ نتیجه‌ای است که تمام واکنش‌های مشاهده‌شده را توضیح دهد.

بخش چهارم: خطاهای تعیین گروه RhD و روش رفع نتایج ضعیف، متناقض یا غیرمنتظره

تعیین RhD پس از گروه ABO یکی از مهم‌ترین آزمون‌های روتین بانک خون است، اما برخلاف تصور رایج، گزارش RhD همیشه به مشاهده یک واکنش مثبت یا منفی ساده محدود نمی‌شود. شدت واکنش با Anti-D، نوع معرف، روش آزمایش، وضعیت DAT، سابقه انتقال خون، پیوند سلول‌های بنیادی و وجود دو جمعیت سلولی می‌توانند تفسیر نتیجه را تغییر دهند.

در بسیاری از موارد، واکنش واضح 3+ یا 4+ با Anti-D به‌راحتی به‌عنوان RhD مثبت تفسیر می‌شود. مشکل زمانی آغاز می‌شود که واکنش ضعیف، Mixed-field، متغیر میان دو معرف یا ظاهراً منفی باشد. در چنین شرایطی، کارشناس نباید تنها بر اساس یک لوله یا یک بار تکرار آزمایش، نتیجه قطعی گزارش کند.

اصل مهم در تعیین RhD این است:

آنتی‌ژن D چرا اهمیت دارد؟

آنتی‌ژن D یکی از ایمنوژن‌ترین آنتی‌ژن‌های گلبول قرمز پس از آنتی‌ژن‌های ABO است. فردی که آنتی‌ژن D را ندارد، در صورت مواجهه با گلبول‌های RhD مثبت ممکن است Anti-D تولید کند. این موضوع به‌ویژه در زنان در سن باروری اهمیت دارد، زیرا تشکیل Anti-D می‌تواند در بارداری‌های بعدی موجب بیماری همولیتیک جنین و نوزاد شود.

به همین دلیل، اشتباه در گزارش RhD می‌تواند دو پیامد مهم داشته باشد. گزارش نادرست یک فرد RhD منفی به‌عنوان مثبت ممکن است او را در معرض گلبول RhD مثبت قرار دهد. در مقابل، گزارش فرد RhD مثبت به‌عنوان منفی نیز می‌تواند موجب مصرف غیرضروری واحدهای محدود RhD منفی شود.

نخستین مرحله در رفع اشکال RhD؛ رد خطای ساده تکنیکی

پیش از بررسی Weak D، Partial D یا سایر واریانت‌های پیچیده، باید احتمال خطاهای ساده رد شود. کارشناس باید اطمینان حاصل کند معرف صحیح به لوله اضافه شده، تاریخ انقضا و شرایط نگهداری آن مناسب است، سوسپانسیون سلولی غلظت صحیح دارد و زمان و سرعت سانتریفیوژ مطابق دستورالعمل بوده است.

برچسب‌گذاری لوله Anti-D و کنترل Rh باید بررسی شود. استفاده اشتباه از Anti-A یا Anti-B به‌جای Anti-D، جابه‌جایی لوله‌ها یا انتقال قطره از یک معرف به معرف دیگر از خطاهای ساده اما واقعی در شیفت‌های شلوغ است.

واکنش باید بلافاصله پس از سانتریفیوژ و با باز کردن صحیح رسوب خوانده شود. سانتریفیوژ بیش از حد ممکن است رسوب فشرده‌ای ایجاد کند که مثبت کاذب به نظر برسد، در حالی که تکان شدید می‌تواند واکنش ضعیف واقعی را از بین ببرد.

کنترل Rh چه نقشی دارد؟

در برخی روش‌ها و با برخی معرف‌های Anti-D، استفاده از کنترل Rh برای تشخیص واکنش غیراختصاصی ضروری است. اگر Anti-D مثبت و کنترل Rh نیز مثبت باشد، نمی‌توان نتیجه را مستقیماً RhD مثبت گزارش کرد، زیرا واکنش ممکن است ناشی از تجمع غیراختصاصی، پوشش گلبول‌ها با پروتئین یا مثبت بودن DAT باشد.

کنترل Rh باید از نظر ترکیب با معرف Anti-D سازگار باشد و نباید به‌صورت تصادفی از یک محلول نامرتبط استفاده شود. دستورالعمل سازنده معرف تعیین می‌کند چه کنترلی لازم است و آیا در روش جاری به کنترل جداگانه نیاز وجود دارد یا خیر.

مثبت بودن کنترل Rh یک هشدار است و باید پیش از گزارش نتیجه، علت آن بررسی شود.

واکنش مثبت کاذب Anti-D

مثبت کاذب ممکن است در اثر سانتریفیوژ بیش از حد، سوسپانسیون غلیظ، لوله آلوده، خشک شدن نمونه، استفاده از معرف نامناسب یا تفسیر اشتباه رسوب فشرده ایجاد شود.

یکی از علل مهم‌تر، مثبت بودن DAT است. اگر گلبول‌های بیمار در بدن با IgG یا کمپلمان پوشیده شده باشند، برخی روش‌ها یا معرف‌ها ممکن است واکنش غیراختصاصی نشان دهند. در این وضعیت، بررسی DAT و کنترل Rh اهمیت دارد.

رولو نیز ممکن است به‌ویژه در نمونه‌های دارای پروتئین بالا، تجمع کاذب ایجاد کند. شست‌وشوی گلبول‌های بیمار با سالین و تهیه سوسپانسیون تازه می‌تواند پروتئین‌های مزاحم را کاهش دهد.

برخی بیماران پس از دریافت فرآورده یا داروهای خاص ممکن است واکنش‌های غیرمعمول نشان دهند. بنابراین نتیجه غیرمنتظره باید همراه با سابقه بیمار تفسیر شود.

واکنش منفی کاذب Anti-D

منفی کاذب ممکن است به علت حذف تصادفی معرف، استفاده از مقدار ناکافی Anti-D، سوسپانسیون بیش از حد غلیظ، سانتریفیوژ ناکافی، استفاده از معرف آسیب‌دیده یا دمای نامناسب رخ دهد.

استفاده از گلبول‌های شسته‌نشده در نمونه‌هایی که حاوی مواد مزاحم هستند نیز می‌تواند واکنش را تضعیف کند. در برخی واریانت‌های D، تراکم آنتی‌ژن روی سطح سلول کم است و روش فوری ممکن است واکنش منفی یا بسیار ضعیف نشان دهد.

اگر نتیجه با سابقه بیمار اختلاف دارد یا واکنش بسیار ضعیف مشاهده می‌شود، آزمایش باید با روش معتبر و معرف مناسب تکرار شود، نه اینکه نتیجه منفی بلافاصله پذیرفته شود.

Weak D چیست؟

در فنوتیپ Weak D، آنتی‌ژن D روی سطح گلبول قرمز وجود دارد، اما تعداد جایگاه‌های آنتی‌ژنی کمتر از حد معمول است. به همین دلیل، واکنش با Anti-D در روش مستقیم ممکن است ضعیف یا منفی باشد، در حالی که در مرحله آنتی‌گلوبولین واکنش مثبت ظاهر می‌شود.

در گذشته، بسیاری از موارد Weak D با عنوان Du گزارش می‌شدند. امروزه اصطلاح Weak D از نظر علمی مناسب‌تر است، اما واژه Du هنوز در برخی آزمایشگاه‌ها و دستورالعمل‌های قدیمی استفاده می‌شود.

آزمون Weak D معمولاً شامل انکوباسیون گلبول‌های بیمار با Anti-D، شست‌وشوی کامل سلول‌ها و افزودن AHG است. اجرای صحیح مرحله شست‌وشو و استفاده از Check Cells در نتایج منفی برای اعتبار آزمون ضروری است.

آیا برای همه بیماران باید Weak D انجام شود؟

پاسخ به نوع بیمار، سیاست مرکز و الزامات ملی بستگی دارد. در بسیاری از سیستم‌ها، بررسی Weak D برای اهداکنندگان خون اهمیت بیشتری دارد، زیرا واحدی که دارای آنتی‌ژن D ضعیف است نباید به‌اشتباه RhD منفی برچسب‌گذاری شود.

در گیرندگان خون، به‌ویژه زنان در سن باروری، سیاست‌های محافظه‌کارانه ممکن است متفاوت باشند. برخی افراد دارای واریانت‌های D می‌توانند Anti-D تولید کنند و بدون بررسی مولکولی نمی‌توان تمام انواع Weak D و Partial D را فقط بر اساس شدت آگلوتیناسیون از یکدیگر جدا کرد.

بنابراین، کارشناس باید از سیاست مصوب مرکز خود پیروی کند و نتیجه Weak D را بدون توجه به نوع بیمار و هدف آزمایش تفسیر نکند.

تفاوت Weak D و Partial D

در Weak D کلاسیک، ساختار کلی آنتی‌ژن D حفظ شده، اما مقدار بیان آن کمتر است. در Partial D، بخشی از اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن D وجود ندارد یا تغییر کرده است. فرد دارای Partial D ممکن است با برخی Anti-Dها واکنش مثبت نشان دهد، اما در صورت مواجهه با آنتی‌ژن کامل D، علیه بخش‌های ازدست‌رفته آنتی‌بادی تولید کند.

مشکل عملی این است که تست سرولوژیک روتین همیشه قادر به افتراق قطعی Weak D از Partial D نیست. نوع کلون Anti-D می‌تواند سبب شود یک واریانت با یک معرف مثبت و با معرف دیگر ضعیف یا منفی شود.

در موارد مهم، به‌ویژه زنان در سن باروری، بیماران دارای نتیجه متناقض یا افرادی که سابقه Anti-D دارند، بررسی مولکولی RHD می‌تواند راهگشا باشد.

کارشناس نباید از شدت واکنش به‌تنهایی نتیجه بگیرد که بیمار قطعاً Weak D یا Partial D دارد.

DEL چیست؟

DEL یکی از واریانت‌های بسیار ضعیف آنتی‌ژن D است که مقدار آنتی‌ژن روی سطح گلبول قرمز آن‌قدر کم است که حتی آزمون معمول Weak D ممکن است منفی باشد. شناسایی DEL معمولاً به روش‌های جذب و رهایش یا بررسی مولکولی نیاز دارد.

DEL در همه جمعیت‌ها فراوانی یکسانی ندارد و اهمیت آن بیشتر در طب انتقال خون و تعیین وضعیت اهداکننده مطرح می‌شود. در آزمایشگاه روتین بیمارستانی، نتیجه منفی Weak D الزاماً وجود DEL را رد نمی‌کند.

اختلاف نتیجه با دو معرف Anti-D

ممکن است نمونه با یک معرف Anti-D مثبت و با معرف دیگر منفی یا ضعیف باشد. این اختلاف می‌تواند ناشی از تفاوت کلون‌های مونوکلونال، تفاوت قدرت معرف، واریانت D، خطای تکنیکی یا شرایط نگهداری باشد.

در چنین شرایطی باید ابتدا کنترل کیفی هر دو معرف بررسی شود. آزمایش با سوسپانسیون تازه و شرایط یکسان تکرار گردد و شدت واکنش دقیق ثبت شود.

اگر اختلاف پابرجا ماند، نباید نتیجه براساس معرف قوی‌تر انتخاب شود. سابقه بیمار، نوع کلون‌ها، DAT و در صورت لزوم بررسی مولکولی باید در تصمیم‌گیری دخالت داده شوند.

Mixed-field در RhD Typing

الگوی Mixed-field در تست RhD نشان می‌دهد بخشی از گلبول‌ها با Anti-D واکنش داده‌اند و بخشی دیگر واکنش نداده‌اند. این یافته ممکن است ناشی از انتقال گلبول RhD متفاوت، پیوند سلول بنیادی، کیمریسم، انتقال جنینی ـ مادری یا برخی واریانت‌های آنتی‌ژن D باشد.

برای مثال، بیمار RhD منفی که اخیراً گلبول RhD مثبت دریافت کرده است، ممکن است دو جمعیت سلولی نشان دهد. همچنین بیمار RhD مثبت پس از دریافت مقدار زیادی گلبول RhD منفی ممکن است الگوی مشابهی داشته باشد.

Mixed-field نباید به‌عنوان 1+ یا 2+ ساده گزارش شود. کارشناس باید وجود دو جمعیت را ثبت و تاریخچه انتقال خون را بررسی کند.

تأثیر انتقال خون بر نتیجه RhD

پس از انتقال گلبول قرمز، نتیجه RhD نمونه ممکن است تحت تأثیر گروه سلول‌های تزریق‌شده قرار گیرد. هرچه تعداد واحدهای تزریق‌شده بیشتر و فاصله زمانی از انتقال کمتر باشد، احتمال مشاهده جمعیت سلولی اهداکننده بیشتر است.

اگر بیمار سابقه قبلی معتبر دارد، نتیجه فعلی باید با آن مقایسه شود. در صورت نبود سابقه و مشاهده Mixed-field، تعیین RhD قطعی ممکن است نیازمند بررسی نمونه پیش از انتقال، روش‌های تکمیلی یا تکرار آزمایش در زمان مناسب باشد.

تأثیر پیوند سلول‌های بنیادی

پس از پیوند سلول‌های بنیادی از دهنده‌ای با RhD متفاوت، الگوی RhD بیمار ممکن است به‌تدریج تغییر کند. در دوره گذار، حضور دو جمعیت سلولی، واکنش ضعیف یا اختلاف با سابقه قابل مشاهده است.

برای تفسیر این بیماران باید RhD بیمار پیش از پیوند، RhD دهنده، زمان پیوند و وضعیت Engraftment مشخص باشد. گزارش نتیجه بدون این اطلاعات ممکن است گمراه‌کننده باشد.

تأثیر DAT مثبت بر RhD Typing

در DAT مثبت، گلبول‌های بیمار با ایمونوگلوبولین یا کمپلمان پوشیده شده‌اند. این وضعیت می‌تواند در برخی روش‌ها باعث واکنش غیراختصاصی با Anti-D یا کنترل Rh شود.

اولین اقدام، شست‌وشوی گلبول‌ها و تهیه سوسپانسیون تازه است. اگر کنترل Rh همچنان مثبت باشد، نتیجه Anti-D مستقیم قابل اتکا نیست. در چنین حالتی ممکن است نیاز به روش‌های تخصصی مانند Elution، استفاده از معرف‌های مناسب یا بررسی مولکولی وجود داشته باشد.

کارشناس نباید صرفاً مثبت بودن Anti-D را در حضور کنترل مثبت به‌عنوان RhD مثبت گزارش کند.

الگوریتم عملی بررسی نتیجه RhD ضعیف یا متناقض

هنگامی که نتیجه RhD واضح نیست، ابتدا گزارش متوقف شود.

هویت نمونه، سابقه RhD بیمار و سابقه انتقال خون یا پیوند بررسی گردد.

آزمایش با سوسپانسیون تازه، لوله جدید و معرف معتبر تکرار شود.

کنترل Rh مطابق دستورالعمل سازنده انجام و تفسیر شود.

اگر واکنش منفی یا ضعیف است، مشخص شود آیا براساس نوع بیمار و سیاست مرکز انجام Weak D لازم است.

اگر کنترل Rh مثبت است، DAT بررسی شود و گلبول‌ها شسته شوند.

اگر واکنش Mixed-field است، سابقه انتقال خون، پیوند و وجود دو جمعیت سلولی بررسی گردد.

اگر نتیجه با دو معرف متفاوت است، نوع کلون‌ها و احتمال واریانت D در نظر گرفته شود.

در موارد مهم یا غیرقابل حل، نمونه برای بررسی مولکولی RHD یا آزمایشگاه مرجع ارسال شود.

چه زمانی RhD مثبت گزارش می‌شود؟

در واکنش واضح و معتبر با Anti-D، همراه با کنترل منفی و نبود یافته متناقض، نتیجه RhD مثبت قابل گزارش است.

در موارد Weak D، نحوه گزارش باید مطابق سیاست مرکز و نوع بیمار باشد. یک نتیجه که برای اهداکننده RhD مثبت در نظر گرفته می‌شود، ممکن است برای گیرنده خون با رویکرد محافظه‌کارانه متفاوت مدیریت شود.

در صورت شک به Partial D یا واریانت‌های پیچیده، نتیجه باید با توضیح مناسب و پس از بررسی تکمیلی گزارش شود.

چه زمانی RhD منفی گزارش می‌شود؟

نتیجه RhD منفی زمانی معتبر است که واکنش با Anti-D منفی باشد، کنترل‌ها قابل قبول باشند و روش متناسب با نوع بیمار اجرا شده باشد.

اگر براساس سیاست مرکز انجام Weak D لازم است، نتیجه منفی مستقیم پیش از تکمیل آزمون Weak D نهایی نیست.

در نمونه دارای DAT مثبت، Mixed-field یا سابقه انتقال خون گسترده، منفی بودن یک لوله Anti-D ممکن است برای تعیین قطعی کافی نباشد.

خطاهای رایج کارشناسان در تعیین RhD

یکی از خطاهای شایع، تفسیر هر رسوب فشرده به‌عنوان واکنش مثبت است. رسوب باید به‌آرامی باز شود و وجود آگلوتیناسیون واقعی بررسی گردد.

خطای دیگر، بی‌توجهی به کنترل Rh مثبت است. مثبت بودن کنترل، اعتبار نتیجه Anti-D را زیر سؤال می‌برد و نباید نادیده گرفته شود.

برخی کارشناسان هر واکنش ضعیف را Weak D می‌نامند، در حالی که واکنش ضعیف می‌تواند ناشی از واریانت D، Mixed-field، DAT مثبت، معرف ضعیف یا خطای فنی باشد.

تکرار چندباره آزمایش با همان معرف و همان نمونه بدون تغییر شرایط نیز اشتباه است. اگر علت خطا در معرف، سوسپانسیون یا نمونه باشد، تکرار همان نتیجه ارزش تشخیصی ایجاد نمی‌کند.

بی‌توجهی به سابقه بیمار، به‌ویژه انتقال خون و پیوند، از دیگر علل گزارش اشتباه RhD است.

کنترل کیفی معرف Anti-D

معرف Anti-D باید از نظر ظاهر، تاریخ انقضا، شرایط نگهداری و عملکرد کنترل شود. کنترل مثبت باید با سلول RhD مثبت واکنش مورد انتظار نشان دهد و کنترل منفی با سلول RhD منفی بدون آگلوتیناسیون باشد.

شدت واکنش کنترل مثبت باید در طول زمان پایش شود. کاهش تدریجی شدت ممکن است قبل از منفی شدن کامل معرف، افت عملکرد را نشان دهد.

ویال Anti-D نباید آلوده شود و قطره‌چکان آن نباید با نمونه یا معرف دیگر تماس پیدا کند. باقی ماندن طولانی معرف در دمای اتاق یا قرار گرفتن مکرر در معرض تغییرات دمایی می‌تواند عملکرد آن را مختل کند.

اگر کنترل کیفی رد شود، نتایج بیماران از آخرین کنترل قابل قبول باید بررسی شوند و تا رفع مشکل، معرف نباید برای گزارش نتیجه استفاده شود.

بخش پنجم: خطاهای آزمایش آنتی‌گلوبولین مستقیم و غیرمستقیم

آزمایش آنتی‌گلوبولین یا Coombs Test یکی از حساس‌ترین بخش‌های ایمونوهماتولوژی است. این آزمون برای شناسایی IgG یا اجزای کمپلمان متصل به گلبول قرمز یا آنتی‌بادی‌های موجود در سرم استفاده می‌شود.

کوچک‌ترین خطا در شست‌وشوی گلبول‌ها، افزودن AHG، زمان‌بندی، سانتریفیوژ یا اعتبارسنجی نتیجه منفی می‌تواند آزمون را به‌صورت کاذب منفی یا مثبت نشان دهد.

آزمایش آنتی‌گلوبولین مستقیم و غیرمستقیم از نظر هدف یکسان نیستند. DAT پوشش گلبول‌های بیمار را در داخل بدن بررسی می‌کند، در حالی که IAT اتصال آنتی‌بادی به گلبول قرمز را در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی می‌کند.

شست‌وشوی گلبول‌ها؛ حساس‌ترین مرحله آزمون AHG

هدف از شست‌وشو، حذف ایمونوگلوبولین‌های آزاد موجود در محیط است. اگر IgG آزاد در لوله باقی بماند، می‌تواند معرف AHG را خنثی کند و مانع واکنش آن با IgG متصل به سطح گلبول شود. نتیجه چنین خطایی، منفی کاذب است.

گلبول‌ها باید طبق روش معتبر، معمولاً چند بار با حجم کافی سالین شسته شوند. پس از هر شست‌وشو، سوپرناتانت باید به‌طور کامل تخلیه شود، بدون آنکه بخش قابل توجهی از رسوب سلولی از دست برود.

شست‌وشوی ناقص فقط به معنای کم بودن تعداد دفعات نیست. استفاده از سالین آلوده، تخلیه ناقص سوپرناتانت، باقی ماندن مایع زیاد روی رسوب یا تأخیر طولانی میان شست‌وشو و افزودن AHG نیز می‌تواند نتیجه را مختل کند.

پس از آخرین شست‌وشو، AHG باید بدون تأخیر اضافه شود. باقی ماندن طولانی رسوب سلولی بدون AHG ممکن است باعث جدا شدن آنتی‌بادی‌های ضعیف از سطح سلول شود.

فراموش کردن افزودن AHG

یکی از جدی‌ترین خطاهای آزمون کومبس، فراموش کردن افزودن معرف AHG است. در این حالت لوله پس از شست‌وشو و سانتریفیوژ منفی دیده می‌شود و اگر Check Cells استفاده نشوند، خطا قابل تشخیص نخواهد بود.

به همین دلیل، تمام نتایج منفی در فاز AHG باید با گلبول‌های حساس‌شده به IgG کنترل شوند. مثبت شدن Check Cells نشان می‌دهد AHG در لوله وجود داشته و فعال بوده و شست‌وشوی گلبول‌ها نیز به‌اندازه‌ای مؤثر بوده که معرف خنثی نشده است.

Check Cells چه چیزی را ثابت می‌کنند؟

Check Cells یا Coombs Control Cells گلبول‌های قرمزی هستند که با مقدار کنترل‌شده IgG حساس شده‌اند. پس از منفی شدن آزمون AHG، افزودن آن‌ها باید واکنش مثبت ایجاد کند.

اگر پس از افزودن Check Cells واکنش مثبت مشاهده نشود، نتیجه منفی بیمار معتبر نیست. این وضعیت ممکن است ناشی از فراموش شدن AHG، غیرفعال بودن معرف، خنثی شدن AHG توسط IgG آزاد یا خطای فنی باشد.

در چنین حالتی، آزمون باید از ابتدا تکرار شود. افزودن دوباره AHG به همان لوله یا گزارش نتیجه منفی قابل قبول نیست.

کنترل کیفی AHG

معرف AHG ممکن است پلی‌اسپسیفیک یا مونواسپسیفیک باشد. AHG پلی‌اسپسیفیک معمولاً علیه IgG و اجزای کمپلمان واکنش دارد، در حالی که معرف‌های مونواسپسیفیک برای تفکیک IgG و کمپلمان استفاده می‌شوند.

کنترل کیفی AHG باید نشان دهد معرف قادر به واکنش با سلول‌های حساس‌شده مناسب است و با سلول‌های منفی واکنش غیراختصاصی ایجاد نمی‌کند.

آلودگی معرف، نگهداری نامناسب، یخ‌زدگی، حرارت، تماس قطره‌چکان با نمونه و استفاده پس از انقضا می‌توانند عملکرد AHG را کاهش دهند.

علل DAT مثبت واقعی

DAT مثبت نشان می‌دهد سطح گلبول‌های بیمار در داخل بدن با IgG، کمپلمان یا هر دو پوشیده شده است. این یافته به‌تنهایی یک تشخیص نهایی نیست و باید با وضعیت بالینی بیمار تفسیر شود.

کم‌خونی همولیتیک خودایمنی، بیماری همولیتیک جنین و نوزاد، واکنش همولیتیک انتقال خون، برخی عفونت‌ها، بیماری‌های لنفوپرولیفراتیو و واکنش‌های وابسته به دارو از علل مهم DAT مثبت هستند.

ممکن است بیمار DAT مثبت داشته باشد، اما شواهدی از همولیز وجود نداشته باشد. بنابراین مثبت بودن DAT به‌تنهایی اثبات نمی‌کند که گلبول‌ها در حال تخریب‌اند.

DAT مثبت کاذب

نمونه لخته‌شده ممکن است در حین تشکیل لخته، کمپلمان را در شرایط آزمایشگاهی فعال کند و در برخی بیماران نتیجه مثبت غیرواقعی ایجاد کند. به همین دلیل، نوع نمونه و شرایط جمع‌آوری باید با روش سازگار باشد.

شست‌وشوی ناکافی گلبول‌ها، آلودگی لوله، سانتریفیوژ بیش از حد، سوسپانسیون غلیظ و تفسیر رسوب فشرده نیز می‌توانند مثبت کاذب ایجاد کنند.

گلبول‌های آلوده یا نمونه قدیمی ممکن است واکنش‌های غیراختصاصی نشان دهند. همچنین باقی ماندن فیبرین در نمونه می‌تواند با آگلوتیناسیون اشتباه شود.

DAT منفی کاذب

DAT ممکن است در حضور پوشش واقعی گلبول‌ها منفی شود اگر تعداد مولکول‌های IgG کمتر از حد تشخیص روش باشد، آنتی‌بادی از نوعی باشد که معرف معمول آن را شناسایی نمی‌کند یا IgG با میل اتصال پایین در حین شست‌وشو از سطح سلول جدا شود.

شست‌وشوی نامناسب، تأخیر در افزودن AHG، استفاده از معرف غیرفعال یا فراموش کردن AHG نیز از علل مهم منفی کاذب‌اند.

در شرایطی که شک بالینی به همولیز ایمنی زیاد است اما DAT منفی است، استفاده از روش حساس‌تر یا معرف‌های اختصاصی ممکن است لازم باشد.

تفسیر DAT با AHG مونواسپسیفیک

اگر DAT پلی‌اسپسیفیک مثبت باشد، آزمایش با Anti-IgG و Anti-C3 می‌تواند نوع پوشش سلولی را مشخص کند.

مثبت بودن Anti-IgG به نفع پوشش گلبول‌ها با IgG است. مثبت بودن Anti-C3 می‌تواند در اتوآنتی‌بادی‌های سرد، برخی واکنش‌های دارویی یا فعال شدن کمپلمان دیده شود.

مثبت بودن هم‌زمان IgG و C3 در برخی کم‌خونی‌های همولیتیک خودایمنی گرم و واکنش‌های انتقال خون مشاهده می‌شود.

این الگوها باید همراه با Eluate، اتوکنترل، غربالگری آنتی‌بادی و شواهد همولیز تفسیر شوند.

الگوریتم عملی برخورد با DAT مثبت

ابتدا نتیجه با روش صحیح و کنترل‌های معتبر تأیید شود.

سابقه انتقال خون اخیر، بارداری، داروها، بیماری زمینه‌ای و علائم همولیز بررسی گردد.

DAT با معرف‌های مونواسپسیفیک Anti-IgG و Anti-C3 تفکیک شود.

در صورت وجود IgG روی سطح گلبول‌ها و نیاز بالینی، Elution انجام شود تا اختصاصیت آنتی‌بادی متصل به سلول بررسی گردد.

غربالگری آنتی‌بادی، اتوکنترل و سرم بیمار نیز بررسی شوند.

اگر بیمار اخیراً انتقال خون داشته و DAT جدیداً مثبت شده است، واکنش همولیتیک تأخیری انتقال خون باید در نظر گرفته شود.

اگر DAT مثبت است اما شواهدی از همولیز وجود ندارد، نتیجه باید به‌عنوان یک یافته آزمایشگاهی تفسیر شود، نه تشخیص قطعی کم‌خونی همولیتیک.

خطاهای مهم IAT

در IAT، آنتی‌بادی موجود در سرم بیمار باید در مرحله انکوباسیون به آنتی‌ژن گلبول قرمز متصل شود. هر عاملی که این اتصال را کاهش دهد یا مرحله AHG را مختل کند، ممکن است نتیجه منفی کاذب ایجاد کند.

نسبت ناکافی سرم به سلول، زمان انکوباسیون کوتاه، دمای نامناسب، سوسپانسیون غلیظ، حذف Enhancer، شست‌وشوی ناقص و استفاده از AHG غیرفعال از علل مهم هستند.

در مقابل، آلودگی، سانتریفیوژ بیش از حد، وجود آنتی‌بادی سرد، رولو و خشک شدن لوله می‌توانند مثبت کاذب ایجاد کنند.

تأثیر تأخیر میان شست‌وشو و افزودن AHG

پس از آخرین شست‌وشو، AHG باید بلافاصله افزوده شود. تأخیر می‌تواند باعث جدا شدن IgGهای دارای میل اتصال پایین از سطح گلبول شود و نتیجه را ضعیف یا منفی کند.

همچنین رسوب سلولی نباید پیش از افزودن AHG برای مدت طولانی در معرض محیط باقی بماند. در روش‌های دستی، نظم زمانی میان لوله‌ها اهمیت زیادی دارد.

نسبت سرم به سلول در IAT

اگر حجم سرم کم یا تعداد سلول‌ها زیاد باشد، آنتی‌بادی کافی برای پوشاندن گلبول‌ها وجود نخواهد داشت. این وضعیت به‌ویژه در آنتی‌بادی‌های ضعیف یا کم‌تیتر باعث منفی کاذب می‌شود.

کارشناس باید حجم‌های تعیین‌شده در SOP را رعایت کند و از افزودن چشمی یا قطره‌های نامساوی خودداری کند.

نقش محیط‌های تقویت‌کننده

LISS، آلبومین، PEG و سایر محیط‌های تقویت‌کننده می‌توانند سرعت یا قدرت اتصال آنتی‌بادی را افزایش دهند. استفاده از هرکدام شرایط خاص خود را دارد.

افزودن مقدار نادرست، ترکیب روش‌های ناسازگار یا استفاده از زمان انکوباسیون مربوط به یک Enhancer برای Enhancer دیگر می‌تواند نتیجه را مختل کند.

PEG حساسیت بالایی دارد، اما ممکن است واکنش‌های ضعیف یا اتوآنتی‌بادی‌ها را برجسته کند و نیازمند شست‌وشوی دقیق است. LISS نیز به نسبت صحیح سرم و سلول و زمان انکوباسیون مشخص وابسته است.

چه زمانی نتیجه منفی کومبس معتبر است؟

نتیجه منفی تنها زمانی معتبر است که تمام کنترل‌ها قابل قبول باشند، AHG به‌درستی اضافه شده باشد، شست‌وشو کامل انجام شده باشد و Check Cells پس از افزودن، واکنش مثبت مورد انتظار نشان دهند.

اگر Check Cells منفی باشند، نتیجه بیمار فاقد اعتبار است و آزمایش باید از ابتدا تکرار شود.

ثبت صرف «منفی» بدون ثبت کنترل Check Cells در روش دستی، یک نقص جدی در مستندسازی آزمون AHG محسوب می‌شود.

بخش ششم: خطاهای غربالگری آنتی‌بادی و روش مرحله‌به‌مرحله بررسی نتایج غیرمنتظره

غربالگری آنتی‌بادی یکی از مهم‌ترین آزمون‌های پیش از انتقال خون است، زیرا هدف آن شناسایی آنتی‌بادی‌های غیرمنتظره‌ای است که ممکن است علیه آنتی‌ژن‌های گلبول قرمز ایجاد شده باشند. این آنتی‌بادی‌ها می‌توانند در اثر انتقال خون قبلی، بارداری یا مواجهه‌های ایمنی دیگر تشکیل شوند و در صورت نادیده گرفته شدن، موجب واکنش همولیتیک انتقال خون یا بیماری همولیتیک جنین و نوزاد شوند.

با وجود اهمیت این آزمون، نتیجه غربالگری آنتی‌بادی به‌تنهایی تشخیص نهایی نیست. نتیجه مثبت فقط نشان می‌دهد سرم یا پلاسمای بیمار با حداقل یکی از سلول‌های غربالگری واکنش داده است. این نتیجه مشخص نمی‌کند آنتی‌بادی چیست، آیا از نظر بالینی اهمیت دارد، آیا بیش از یک آنتی‌بادی وجود دارد یا واکنش مشاهده‌شده ناشی از اتوآنتی‌بادی، رولو، خطای تکنیکی یا عوامل غیراختصاصی است.

از سوی دیگر، نتیجه منفی غربالگری نیز وجود همه آنتی‌بادی‌ها را رد نمی‌کند. ممکن است آنتی‌ژن مربوط به یک آنتی‌بادی روی سلول‌های غربالگری وجود نداشته باشد، به‌صورت هتروزیگوت بیان شده باشد، تیتر آنتی‌بادی پایین باشد یا شرایط آزمون برای شناسایی آن مناسب نباشد.

بنابراین اصل مهم در تفسیر غربالگری آنتی‌بادی این است:

سلول‌های غربالگری چه ویژگی‌هایی باید داشته باشند؟

سلول‌های غربالگری معمولاً مجموعه‌ای از دو یا سه سلول گروه O با فنوتیپ آنتی‌ژنی شناخته‌شده هستند. استفاده از سلول گروه O باعث می‌شود آنتی‌بادی‌های طبیعی ABO با سلول‌ها واکنش ندهند و تمرکز آزمون بر آنتی‌بادی‌های غیرمنتظره باشد.

این سلول‌ها باید آنتی‌ژن‌های مهم و دارای اهمیت بالینی را با الگویی مناسب پوشش دهند. وجود آنتی‌ژن‌هایی از سیستم‌های Rh، Kell، Kidd، Duffy، MNS، Lewis، P و Lutheran در آنتی‌گرام سلول‌ها بررسی می‌شود.

کارشناس باید پیش از تفسیر نتیجه، آنتی‌گرام همان لات سلول‌های غربالگری را مطالعه کند. استفاده از آنتی‌گرام مربوط به لات قبلی یا ثبت نکردن شماره لات می‌تواند به تفسیر اشتباه منجر شود.

سلول‌های غربالگری باید از نظر تاریخ انقضا، همولیز، کدورت، تغییر رنگ، آلودگی و شرایط نگهداری بررسی شوند. سلولی که ظاهراً آسیب‌دیده است، حتی اگر تاریخ انقضا نداشته باشد، نباید مورد استفاده قرار گیرد.

نتیجه غربالگری مثبت؛ اولین اقدام چیست؟

پس از مشاهده نتیجه مثبت، اولین اقدام نباید انتخاب تصادفی چند سلول یا تکرار چندباره همان آزمایش باشد. ابتدا باید مطمئن شد واکنش واقعی و قابل تکرار است.

هویت بیمار، نمونه، سلول‌های غربالگری، معرف‌ها و کنترل‌ها باید بررسی شوند. شدت واکنش، فاز ایجاد آن و سلول‌هایی که واکنش داده‌اند باید دقیقاً ثبت شود.

سپس اتوکنترل انجام یا بررسی شود. اتوکنترل از سرم بیمار و گلبول‌های خود بیمار تشکیل می‌شود و به افتراق اولیه میان آلوآنتی‌بادی و اتوآنتی‌بادی کمک می‌کند.

اگر غربالگری مثبت و اتوکنترل منفی باشد، احتمال وجود آلوآنتی‌بادی بیشتر است. اگر غربالگری و اتوکنترل هر دو مثبت باشند، اتوآنتی‌بادی، آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا، رولو یا پوشش گلبول‌های بیمار باید بررسی شود.

البته اتوکنترل به‌تنهایی تعیین‌کننده نیست. بیماری که اخیراً انتقال خون دریافت کرده است ممکن است اتوکنترل مثبت داشته باشد، زیرا گلبول‌های اهداکننده حساس‌شده در گردش خون او حضور دارند. همچنین در برخی شرایط، اتوآنتی‌بادی ضعیف ممکن است اتوکنترل منفی ایجاد کند.

اهمیت فاز واکنش

زمان و مرحله‌ای که واکنش ظاهر می‌شود، اطلاعات مهمی درباره ماهیت آنتی‌بادی فراهم می‌کند.

واکنش در فاز Immediate Spin یا دمای اتاق بیشتر به نفع آنتی‌بادی‌های سرد، IgM یا واکنش‌های مرتبط با سیستم‌هایی مانند Lewis، P1، M و N است. با این حال، نباید فقط براساس دمای واکنش نتیجه گرفت که آنتی‌بادی از نظر بالینی بی‌اهمیت است.

واکنش در ۳۷ درجه یا فاز AHG بیشتر با آنتی‌بادی‌های IgG دارای اهمیت بالینی مانند Rh، Kell، Kidd و Duffy سازگار است.

اگر واکنش در تمام فازها دیده شود، ممکن است بیش از یک آنتی‌بادی، اتوآنتی‌بادی با دامنه حرارتی گسترده یا ترکیبی از آنتی‌بادی سرد و گرم وجود داشته باشد.

شدت واکنش در هر فاز باید جداگانه ثبت شود. ثبت یک نتیجه کلی مانند «Screen مثبت» اطلاعات لازم برای شناسایی آنتی‌بادی را از بین می‌برد.

غربالگری مثبت و اتوکنترل منفی

این الگو بیشتر به نفع آلوآنتی‌بادی است. در این شرایط، مرحله بعدی انجام پنل شناسایی آنتی‌بادی است.

پیش از شروع پنل، باید آنتی‌گرام سلول‌های غربالگری بررسی شود. مقایسه سلول‌های مثبت و منفی می‌تواند سرنخ اولیه درباره اختصاصیت احتمالی آنتی‌بادی ایجاد کند.

برای مثال، اگر فقط سلولی که آنتی‌ژن K دارد واکنش دهد و سایر سلول‌ها K منفی باشند، Anti-K مطرح می‌شود. با این حال، نتیجه نهایی فقط براساس سه سلول غربالگری قابل قبول نیست و باید با پنل مناسب تأیید شود.

همچنین باید سابقه بیمار بررسی شود. وجود آنتی‌بادی قبلی، حتی اگر در نمونه فعلی ضعیف باشد، می‌تواند مسیر شناسایی را مشخص کند.

غربالگری مثبت و اتوکنترل مثبت

این الگو می‌تواند ناشی از اتوآنتی‌بادی باشد، اما باید علل مختلف بررسی شوند.

اگر واکنش‌ها در دمای اتاق قوی‌تر باشند و با گرم کردن کاهش یابند، اتوآنتی‌بادی سرد مطرح می‌شود.

اگر واکنش در فاز AHG با تمام یا بیشتر سلول‌ها مشاهده شود و DAT نیز مثبت باشد، اتوآنتی‌بادی گرم محتمل است.

رولو، افزایش پروتئین‌های پلاسما، داروها، انتقال خون اخیر و آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا نیز می‌توانند الگوی مشابه ایجاد کنند.

در این وضعیت، DAT، الگوی واکنش با پنل، فاز واکنش، سابقه انتقال خون و شواهد همولیز باید بررسی شوند.

کارشناس نباید صرفاً با مشاهده اتوکنترل مثبت، تمام واکنش‌ها را اتوآنتی‌بادی تلقی کند. ممکن است بیمار هم‌زمان اتوآنتی‌بادی و آلوآنتی‌بادی داشته باشد و آلوآنتی‌بادی مهم زیر پوشش واکنش‌های گسترده پنهان شده باشد.

غربالگری مثبت با یک سلول و منفی با سلول‌های دیگر

این الگو معمولاً نشان می‌دهد آنتی‌ژن مربوط به آنتی‌بادی فقط روی یکی از سلول‌های غربالگری وجود دارد یا روی آن سلول به‌صورت هموزیگوت بیان شده است.

برای مثال، Anti-Jka یا Anti-Fya ممکن است فقط با سلولی واکنش دهد که آنتی‌ژن مربوطه را به‌صورت هموزیگوت دارد. اگر سایر سلول‌ها آنتی‌ژن را نداشته باشند یا به‌صورت هتروزیگوت بیان کنند، واکنش ممکن است منفی شود.

اثر دوزاژ در این وضعیت اهمیت زیادی دارد. بنابراین آنتی‌گرام باید از نظر وضعیت هموزیگوت و هتروزیگوت بررسی شود.

گاهی واکنش با یک سلول می‌تواند ناشی از آنتی‌ژن کم‌شیوعی باشد که فقط همان سلول آن را بیان می‌کند. در این حالت، پنل‌های معمول ممکن است نتیجه منفی نشان دهند و بررسی سلول‌های اضافی لازم شود.

غربالگری مثبت با همه سلول‌ها

واکنش با تمام سلول‌های غربالگری می‌تواند دلایل مختلفی داشته باشد و نباید بلافاصله به‌عنوان پان‌آگلوتیناسیون ناشی از اتوآنتی‌بادی گزارش شود.

آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا، اتوآنتی‌بادی گرم، اتوآنتی‌بادی سرد، رولو، آنتی‌بادی‌های متعدد یا واکنش غیراختصاصی از علل احتمالی هستند.

اتوکنترل در اینجا کمک‌کننده است. غربالگری همه‌مثبت با اتوکنترل مثبت بیشتر به نفع اتوآنتی‌بادی است. غربالگری همه‌مثبت با اتوکنترل منفی احتمال آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا یا چند آلوآنتی‌بادی را مطرح می‌کند.

شدت یکنواخت یا متغیر واکنش‌ها نیز اهمیت دارد. واکنش‌های تقریباً یکسان با همه سلول‌ها می‌توانند با اتوآنتی‌بادی یا آنتی‌ژن با شیوع بالا سازگار باشند. تفاوت واضح شدت‌ها ممکن است ناشی از اثر دوزاژ یا حضور چند آنتی‌بادی باشد.

غربالگری مثبت در دمای اتاق و منفی در فاز AHG

این الگو معمولاً با آنتی‌بادی‌های سرد یا IgM سازگار است. Anti-P1، Anti-Lea، Anti-Leb، Anti-M، Anti-N و Anti-I از موارد احتمالی هستند.

اهمیت بالینی این آنتی‌بادی‌ها به دامنه حرارتی و قدرت واکنش آن‌ها بستگی دارد. آنتی‌بادی‌ای که فقط در دمای پایین واکنش می‌دهد معمولاً اهمیت کمتری دارد، اما اگر در ۳۷ درجه نیز فعال باشد، ممکن است بر انتخاب خون و کراس‌مچ اثر بگذارد.

در چنین شرایطی، استفاده از تکنیک Prewarm می‌تواند واکنش‌های سرد مزاحم را کاهش دهد. با این حال، اجرای Prewarm باید دقیق باشد و نباید به‌گونه‌ای انجام شود که آنتی‌بادی‌های مهم IgG نیز از دست بروند.

غربالگری منفی اما کراس‌مچ ناسازگار

غربالگری منفی تضمین نمی‌کند تمام واحدهای خون با بیمار سازگار خواهند بود. ممکن است واحد اهداکننده دارای آنتی‌ژن کم‌شیوعی باشد که روی سلول‌های غربالگری وجود ندارد و بیمار علیه آن آنتی‌بادی داشته باشد.

در این حالت، غربالگری منفی است اما کراس‌مچ با یک یا چند واحد خاص ناسازگار می‌شود.

علل دیگر شامل ناسازگاری ABO، DAT مثبت واحد خون، خطای تعیین گروه واحد، آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن کم‌شیوع، خطای فنی یا آلودگی هستند.

این وضعیت باید در بخش کراس‌مچ به‌صورت جداگانه بررسی شود، اما اصل مهم این است که نتیجه منفی Screen هرگز مجوز نادیده گرفتن کراس‌مچ ناسازگار نیست.

پنل شناسایی آنتی‌بادی

پس از مثبت شدن غربالگری، از پنل سلولی برای تعیین اختصاصیت آنتی‌بادی استفاده می‌شود. پنل معمولاً شامل تعداد بیشتری سلول گروه O با پروفایل آنتی‌ژنی شناخته‌شده است.

هدف، مقایسه الگوی سلول‌های واکنش‌دهنده و غیرواکنش‌دهنده با جدول آنتی‌ژنی پنل است.

کارشناس باید برای هر سلول، شدت واکنش در هر فاز را ثبت کند و سپس آنتی‌ژن‌هایی را که با الگوی واکنش سازگار نیستند، کنار بگذارد.

حذف یک آنتی‌بادی احتمالی فقط زمانی معتبر است که سلول‌های منفی مناسب برای آن آنتی‌ژن بررسی شده باشند. برای آنتی‌بادی‌های دارای اثر دوزاژ، استفاده از سلول‌های هموزیگوت برای رد کردن اختصاصیت اهمیت دارد.

قانون سه یا Rule of Three

برای تأیید سرولوژیک یک آنتی‌بادی، معمولاً باید حداقل سه سلول دارای آنتی‌ژن مربوطه واکنش مثبت و سه سلول فاقد آن آنتی‌ژن واکنش منفی نشان دهند.

این اصل با عنوان Rule of Three شناخته می‌شود و احتمال همخوانی تصادفی الگوی واکنش را کاهش می‌دهد.

اگر پنل موجود تعداد کافی سلول مناسب نداشته باشد، باید سلول‌های انتخابی اضافی بررسی شوند.

با این حال، قانون سه به‌تنهایی کافی نیست. فنوتیپ بیمار باید با اختصاصیت آنتی‌بادی سازگار باشد. بیماری که آنتی‌ژن K را روی گلبول‌های خود دارد، در شرایط معمول نباید آلوآنتی‌بادی Anti-K تولید کرده باشد.

در بیمار اخیراً تزریق‌شده، فنوتیپ سرولوژیک ممکن است تحت تأثیر سلول‌های اهداکننده باشد و در این صورت ژنوتایپ یا نمونه پیش از انتقال می‌تواند مفید باشد.

نقش فنوتیپ بیمار

پس از مطرح شدن یک آنتی‌بادی، باید بررسی شود آیا بیمار آنتی‌ژن مربوطه را ندارد یا خیر. آلوآنتی‌بادی معمولاً علیه آنتی‌ژنی ایجاد می‌شود که روی گلبول‌های خود بیمار وجود ندارد.

اگر بیمار در سه ماه گذشته انتقال خون دریافت کرده باشد، فنوتیپ سرولوژیک ممکن است ترکیبی از سلول‌های بیمار و اهداکننده باشد. در این شرایط، نتیجه منفی یا مثبت فنوتیپ باید با احتیاط تفسیر شود.

DAT مثبت نیز می‌تواند فنوتیپ‌گیری با معرف‌های AHG-dependent را مختل کند. در چنین مواردی، روش مولکولی یا استفاده از تکنیک‌های تخصصی ممکن است لازم باشد.

وجود چند آنتی‌بادی هم‌زمان

در بیماران دارای انتقال خون مکرر، وجود بیش از یک آلوآنتی‌بادی شایع‌تر است. در این حالت، الگوی پنل ممکن است نامنظم و شدت واکنش‌ها متفاوت باشد.

برای شناسایی چند آنتی‌بادی باید سلول‌هایی انتخاب شوند که یک آنتی‌ژن را دارند و آنتی‌ژن‌های احتمالی دیگر را ندارند. این کار با عنوان Selected Cells شناخته می‌شود.

استفاده از سلول‌های آنزیم‌تیمار شده نیز ممکن است به تفکیک آنتی‌بادی‌ها کمک کند. آنزیم‌ها معمولاً واکنش آنتی‌بادی‌های Rh، Kidd، Lewis و P1 را تقویت و آنتی‌ژن‌های Duffy و برخی آنتی‌ژن‌های MNS را تخریب می‌کنند.

نتیجه آنزیمی باید در کنار پنل اصلی تفسیر شود و نباید به‌تنهایی مبنای شناسایی آنتی‌بادی قرار گیرد.

اثر دوزاژ در شناسایی آنتی‌بادی

Anti-Jka، Anti-Jkb، Anti-Fya، Anti-Fyb، Anti-M، Anti-N، Anti-S، Anti-s و برخی آنتی‌بادی‌های Rh ممکن است اثر دوزاژ نشان دهند.

اگر آنتی‌ژن روی یک سلول به‌صورت هتروزیگوت باشد، واکنش ممکن است ضعیف یا منفی شود. بنابراین برای رد کردن این آنتی‌بادی‌ها، باید تا حد امکان سلول‌های دارای بیان هموزیگوت استفاده شوند.

نادیده گرفتن اثر دوزاژ می‌تواند باعث شود یک آنتی‌بادی مهم از فهرست احتمالات حذف شود.

Screen مثبت ولی پنل منفی

گاهی غربالگری اولیه مثبت است اما پنل شناسایی آنتی‌بادی واکنشی نشان نمی‌دهد. این وضعیت می‌تواند علل مختلفی داشته باشد.

ممکن است آنتی‌ژن کم‌شیوع فقط روی یکی از سلول‌های غربالگری وجود داشته باشد و در پنل حضور نداشته باشد.

ممکن است آنتی‌بادی ضعیف یا ناپایدار باشد و در زمان انجام پنل دیگر قابل تشخیص نباشد.

تفاوت روش، محیط تقویت‌کننده، زمان انکوباسیون یا دمای انجام غربالگری و پنل نیز می‌تواند علت باشد.

خطای فنی، آلودگی یک سلول غربالگری یا آسیب‌دیدگی سلول نیز باید بررسی شود.

در این شرایط، غربالگری باید با همان سلول و در صورت امکان با ویال جدید همان لات یا لات دیگر تکرار شود. آنتی‌گرام سلول واکنش‌دهنده از نظر آنتی‌ژن‌های کم‌شیوع بررسی گردد و سابقه بیمار نیز مطالعه شود.

Screen منفی ولی پنل مثبت

اگر پنل بدون دلیل مشخص انجام شده و واکنش مثبت نشان دهد، ممکن است آنتی‌ژن مربوطه روی سلول‌های غربالگری وجود نداشته یا به‌صورت هتروزیگوت بیان شده باشد.

تفاوت حساسیت روش‌ها، تعداد بیشتر سلول‌های پنل و وجود آنتی‌ژن‌های اضافی می‌تواند باعث شود پنل آنتی‌بادی‌ای را آشکار کند که Screen آن را شناسایی نکرده است.

این وضعیت اهمیت انتخاب مناسب سلول‌های غربالگری و بررسی اثر دوزاژ را نشان می‌دهد.

واکنش‌های ضعیف و متغیر

برخی آنتی‌بادی‌ها مانند Anti-Jka می‌توانند واکنش‌های ضعیف، متغیر یا ناپایدار ایجاد کنند. تیتر آن‌ها ممکن است با گذشت زمان کاهش یابد، اما پس از مواجهه مجدد پاسخ آنامنستیک ایجاد کنند.

بنابراین، سابقه آنتی‌بادی اهمیت زیادی دارد. اگر بیمار در گذشته Anti-Jka داشته است، منفی بودن غربالگری فعلی به معنای حذف این سابقه نیست و باید خون فاقد آنتی‌ژن مربوطه انتخاب شود.

واکنش‌های ضعیف باید با تکرار هدفمند، بررسی فاز، استفاده از روش حساس‌تر و در صورت نیاز بررسی سلول‌های انتخابی تأیید شوند.

آنتی‌بادی‌های HTLA

آنتی‌بادی‌های High Titer, Low Avidity یا HTLA معمولاً واکنش‌های ضعیف و گسترده با بسیاری از سلول‌های پنل ایجاد می‌کنند. این واکنش‌ها ممکن است در فاز AHG دیده شوند و شناسایی آنتی‌بادی‌های مهم‌تر را دشوار کنند.

شدت واکنش HTLA معمولاً ضعیف است و حتی در رقت‌های بالا باقی می‌ماند. آنتی‌بادی‌هایی مانند Anti-Ch، Anti-Rg و برخی آنتی‌بادی‌های سیستم Knops در این گروه قرار می‌گیرند.

این آنتی‌بادی‌ها معمولاً اهمیت بالینی محدودی دارند، اما مشکل اصلی آن‌ها پوشاندن آلوآنتی‌بادی‌های مهم است. در این شرایط، روش‌های خنثی‌سازی، جذب یا ارجاع به آزمایشگاه مرجع ممکن است لازم باشد.

آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا

اگر تمام سلول‌های غربالگری و پنل مثبت باشند اما اتوکنترل منفی باشد، باید آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا در نظر گرفته شود.

در این حالت، یافتن سلول منفی برای تأیید اختصاصیت دشوار است. فنوتیپ نادر بیمار، سابقه قومی و استفاده از سلول‌های مرجع می‌تواند کمک‌کننده باشد.

نمونه معمولاً باید برای بررسی تکمیلی به آزمایشگاه مرجع ارسال شود. انتخاب خون سازگار نیز ممکن است نیازمند جست‌وجوی اهداکنندگان نادر باشد.

آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن کم‌شیوع

در آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن کم‌شیوع، غربالگری ممکن است منفی باشد، زیرا سلول‌های غربالگری آن آنتی‌ژن را ندارند. ناسازگاری ممکن است فقط هنگام کراس‌مچ با واحد خاصی ظاهر شود.

Anti-Kpa، Anti-Wra و برخی آنتی‌بادی‌های دیگر می‌توانند چنین الگویی ایجاد کنند.

در این وضعیت، بررسی سلول اهداکننده، DAT واحد و تکرار کراس‌مچ با واحدهای دیگر کمک‌کننده است.

اتوآنتی‌بادی گرم

اتوآنتی‌بادی گرم معمولاً در ۳۷ درجه و فاز AHG واکنش می‌دهد و اغلب با تمام یا بیشتر سلول‌های غربالگری و پنل واکنش ایجاد می‌کند. اتوکنترل و DAT نیز معمولاً مثبت‌اند.

مهم‌ترین چالش، تشخیص آلوآنتی‌بادی پنهان در زیر واکنش گسترده اتوآنتی‌بادی است.

جذب اتولوگ در بیماری که اخیراً انتقال خون نداشته است می‌تواند اتوآنتی‌بادی را از سرم حذف کند. در بیمار اخیراً تزریق‌شده، جذب آلوژنیک ممکن است لازم باشد.

کارشناس نباید فقط ضعیف‌ترین واحد را انتخاب و آن را «کمترین ناسازگاری» تلقی کند، بدون آنکه احتمال آلوآنتی‌بادی مهم بررسی شده باشد.

اتوآنتی‌بادی سرد

اتوآنتی‌بادی سرد معمولاً در دمای پایین یا دمای اتاق واکنش قوی‌تری دارد. Anti-I یکی از شایع‌ترین موارد است.

این آنتی‌بادی ممکن است باعث آگلوتیناسیون خودبه‌خودی گلبول‌های بیمار، اختلال در گروه‌بندی ABO، مثبت شدن غربالگری و ناسازگاری کراس‌مچ شود.

گرم نگه داشتن نمونه از زمان جمع‌آوری، شست‌وشوی گلبول‌ها با سالین گرم و استفاده از تکنیک Prewarm می‌تواند مزاحمت را کاهش دهد.

دامنه حرارتی از تیتر مهم‌تر است. آنتی‌بادی سردی که تا ۳۰ یا ۳۷ درجه واکنش می‌دهد، اهمیت بیشتری نسبت به آنتی‌بادی با تیتر بالا و فعالیت فقط در ۴ درجه دارد.

نقش DAT در غربالگری مثبت

اگر غربالگری و اتوکنترل مثبت باشند، DAT باید بررسی شود. DAT مثبت نشان می‌دهد گلبول‌های بیمار در داخل بدن پوشیده شده‌اند و می‌تواند از اتوآنتی‌بادی، آلوآنتی‌بادی پس از انتقال خون یا دارو ناشی شود.

اما DAT منفی اتوآنتی‌بادی را کاملاً رد نمی‌کند. برخی اتوآنتی‌بادی‌ها فقط در سرم وجود دارند یا مقدار پوشش سلولی کمتر از حد تشخیص است.

نتیجه DAT باید همراه با پنل، اتوکنترل، سابقه انتقال خون و یافته‌های همولیز تفسیر شود.

الگوریتم عملی بررسی غربالگری مثبت

ابتدا نتیجه و کنترل‌ها تأیید شوند.

شدت و فاز واکنش هر سلول ثبت گردد.

اتوکنترل انجام شود.

سابقه انتقال خون، بارداری، آنتی‌بادی قبلی و داروها بررسی شود.

در صورت مثبت بودن اتوکنترل، DAT انجام شود.

پنل شناسایی آنتی‌بادی با همان روش یا روش مناسب انجام گردد.

الگوی سلول‌های مثبت و منفی با آنتی‌گرام مقایسه شود.

اثر دوزاژ در رد آنتی‌بادی‌ها در نظر گرفته شود.

Rule of Three اجرا و فنوتیپ بیمار بررسی شود.

در صورت وجود چند آنتی‌بادی، سلول‌های انتخابی یا روش‌های تکمیلی استفاده شوند.

اگر الگو قابل حل نیست، واکنش گسترده وجود دارد یا خون سازگار یافت نمی‌شود، نمونه به آزمایشگاه مرجع ارسال شود.

چه زمانی نتیجه شناسایی آنتی‌بادی قابل قبول است؟

شناسایی زمانی معتبر است که الگوی واکنش با اختصاصیت آنتی‌بادی سازگار باشد، تعداد کافی سلول مثبت و منفی بررسی شده باشد، فنوتیپ بیمار با وجود آلوآنتی‌بادی سازگار باشد و واکنش‌های اضافی بدون توضیح باقی نمانده باشند.

وجود یک الگوی تقریباً مشابه، برای گزارش قطعی کافی نیست. اگر چند سلول برخلاف الگوی پیشنهادی واکنش می‌دهند یا واکنش مورد انتظار ندارند، باید احتمال چند آنتی‌بادی، دوزاژ، خطای فنی یا آنتی‌ژن‌های اضافی بررسی شود.

در مواردی که شناسایی کامل امکان‌پذیر نیست، گزارش باید محدودیت را بیان کند و تصمیم انتقال خون بر اساس ایمن‌ترین اطلاعات موجود گرفته شود.

بخش هفتم: خطاهای کراس‌مچ و بررسی مرحله‌به‌مرحله ناسازگاری

آزمایش کراس‌مچ آخرین بررسی سرولوژیک پیش از تحویل گلبول قرمز است. هدف آن اطمینان از سازگاری میان سرم یا پلاسمای بیمار و گلبول‌های واحد اهداکننده است.

کراس‌مچ جایگزین تعیین صحیح ABO، غربالگری آنتی‌بادی یا بررسی سابقه بیمار نیست. این آزمون بخشی از مجموعه ارزیابی پیش از انتقال خون است.

ناسازگاری کراس‌مچ ممکن است ناشی از ناسازگاری ABO، آلوآنتی‌بادی، اتوآنتی‌بادی، آنتی‌ژن کم‌شیوع، DAT مثبت واحد خون، خطای فنی یا اشتباه در شناسایی نمونه و واحد باشد.

اولین اقدام در کراس‌مچ ناسازگار

در صورت ناسازگاری، واحد نباید تحویل شود و نتیجه نباید با تکرار ساده نادیده گرفته شود.

ابتدا هویت بیمار، نمونه و واحد خون بررسی شود. شماره واحد، گروه ABO و RhD روی کیسه، سگمنت و سیستم باید تطبیق داده شوند.

گروه خون بیمار و واحد مجدداً تأیید شود. ناسازگاری ABO یکی از اولین عللی است که باید رد شود.

سپس نتیجه غربالگری آنتی‌بادی، سابقه آنتی‌بادی و فاز ایجاد ناسازگاری بررسی گردد.

کراس‌مچ با سگمنت جدید و لوله جدید تکرار شود تا احتمال آلودگی یا خطای افزودن مواد کاهش یابد.

کراس‌مچ ناسازگار در فاز Immediate Spin

ناسازگاری در فاز فوری بیشتر احتمال ناسازگاری ABO، آنتی‌بادی سرد یا خطای فنی را مطرح می‌کند.

ابتدا گروه ABO بیمار و واحد بررسی شود. اگر سازگار هستند، آنتی‌بادی‌هایی مانند Anti-P1، Anti-M، Anti-N، Anti-Lea یا Anti-Leb ممکن است مطرح باشند.

رولو نیز می‌تواند در فاز فوری واکنش کاذب ایجاد کند. بررسی ظاهر واکنش، اتوکنترل و تکنیک جایگزینی سالین در روش مناسب می‌تواند کمک‌کننده باشد.

کراس‌مچ ناسازگار در فاز AHG

ناسازگاری فقط در فاز AHG بیشتر به نفع آنتی‌بادی IgG دارای اهمیت بالینی است.

اگر Screen مثبت است، باید واحد فاقد آنتی‌ژن مربوط به آنتی‌بادی شناسایی‌شده انتخاب شود.

اگر Screen منفی است، احتمال آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن کم‌شیوع روی واحد اهداکننده، DAT مثبت واحد یا خطای فنی مطرح می‌شود.

تکرار کراس‌مچ با واحدهای دیگر می‌تواند کمک کند. اگر فقط یک واحد ناسازگار است و سایر واحدها سازگارند، بررسی DAT و فنوتیپ واحد ناسازگار مفید است.

Screen مثبت و همه واحدها ناسازگار

اگر غربالگری مثبت و تمام واحدها ناسازگار باشند، ممکن است آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن شایع، اتوآنتی‌بادی یا چند آلوآنتی‌بادی وجود داشته باشد.

الگوی پنل، اتوکنترل و DAT باید بررسی شوند. انتخاب تصادفی واحدهای بیشتر بدون شناسایی علت معمولاً راه‌حل مؤثری نیست.

اگر آنتی‌بادی مشخص شده باشد، واحدهای آنتی‌ژن‌منفی باید انتخاب و کراس‌مچ شوند.

اگر اتوآنتی‌بادی وجود دارد، ابتدا باید آلوآنتی‌بادی‌های پنهان تا حد امکان رد شوند.

Screen منفی و یک واحد ناسازگار

این الگو احتمال آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن کم‌شیوع روی همان واحد، DAT مثبت واحد، آلودگی سگمنت یا خطای فنی را مطرح می‌کند.

گروه خون واحد و بیمار دوباره بررسی شود. DAT روی سلول‌های واحد انجام شود. کراس‌مچ با سگمنت جدید تکرار گردد.

اگر واحدهای دیگر سازگارند، واحد ناسازگار نباید انتخاب شود تا علت مشخص شود.

Screen منفی و همه واحدها ناسازگار

این حالت ممکن است ناشی از اتوآنتی‌بادی، رولو، آنتی‌بادی سرد، خطای روش، نمونه نامناسب یا ناسازگاری ABO باشد.

اتوکنترل و DAT بیمار باید بررسی شوند. اگر اتوکنترل مثبت است، اتوآنتی‌بادی محتمل‌تر است.

اگر واکنش فقط در دمای اتاق وجود دارد، تکنیک Prewarm ممکن است کمک کند.

اگر واکنش در تمام فازها و با شدت مشابه دیده می‌شود، رولو یا اتوآنتی‌بادی گسترده مطرح است.

کراس‌مچ سازگار با وجود Screen مثبت

اگر آنتی‌بادی بیمار با سلول‌های غربالگری واکنش دهد، ممکن است برخی واحدهای اهداکننده آنتی‌ژن مربوطه را نداشته باشند و کراس‌مچ با آن‌ها سازگار باشد.

با این حال، انتخاب واحد فقط براساس سازگاری کراس‌مچ کافی نیست. در آنتی‌بادی دارای اهمیت بالینی، واحد باید از نظر آنتی‌ژن مربوطه منفی باشد و این موضوع تأیید شود.

ممکن است یک واحد به دلیل بیان هتروزیگوت یا واکنش ضعیف ظاهراً سازگار شود، در حالی که همچنان آنتی‌ژن را دارد.

DAT مثبت واحد خون

گاهی واحد اهداکننده DAT مثبت است و فقط کراس‌مچ با همان واحد ناسازگار می‌شود.

DAT مثبت واحد ممکن است دلایل مختلفی داشته باشد و باید مطابق سیاست مرکز بررسی شود. چنین واحدی معمولاً برای تزریق انتخاب نمی‌شود تا علت مشخص گردد.

اگر سگمنت آلوده یا شرایط نگهداری نامناسب باشد نیز واکنش کاذب ممکن است ایجاد شود.

انتخاب واحد برای بیمار دارای آلوآنتی‌بادی

پس از شناسایی آلوآنتی‌بادی دارای اهمیت بالینی، باید واحدهای فاقد آنتی‌ژن مربوطه انتخاب شوند.

منفی بودن آنتی‌ژن باید با برچسب معتبر، اطلاعات تأمین‌کننده یا فنوتیپ‌گیری تأیید شود.

سپس کراس‌مچ در فاز مناسب انجام گردد. سازگاری کراس‌مچ تأیید نهایی است، اما جایگزین اثبات آنتی‌ژن‌منفی بودن واحد نیست.

در بیمار دارای سابقه آنتی‌بادی، حتی اگر Screen فعلی منفی باشد، باید واحد فاقد آنتی‌ژن مربوطه انتخاب شود.

مفهوم Least Incompatible و خطای رایج در استفاده از آن

اصطلاح Least Incompatible گاهی در بیماران دارای اتوآنتی‌بادی گرم به کار می‌رود، اما می‌تواند گمراه‌کننده باشد.

انتخاب واحدی که واکنش ضعیف‌تری دارد، تضمین نمی‌کند آن واحد ایمن‌تر است. تفاوت شدت ممکن است ناشی از تغییرات تکنیکی یا بیان آنتی‌ژن‌ها باشد.

مهم‌ترین اقدام، بررسی و رد آلوآنتی‌بادی‌های مهم و انتخاب واحدهای مناسب بر اساس فنوتیپ یا ژنوتیپ بیمار است.

نباید زمان زیادی صرف مقایسه جزئی شدت ناسازگاری چند واحد شود، در حالی که آلوآنتی‌بادی پنهان بررسی نشده است.

کراس‌مچ در شرایط اورژانسی

در خونریزی شدید ممکن است زمان کافی برای تکمیل تمام آزمایش‌ها وجود نداشته باشد. در این شرایط، انتخاب فرآورده باید مطابق دستورالعمل اورژانسی مرکز انجام شود.

اگر گروه ABO بیمار هنوز تأیید نشده است، معمولاً از گلبول قرمز گروه O با سیاست مناسب RhD استفاده می‌شود.

هم‌زمان نمونه بیمار باید جمع‌آوری و آزمایش‌ها ادامه یابد. فوریت بالینی نباید باعث توقف بررسی آزمایشگاهی شود.

زمان تحویل، نوع واحد، نام درخواست‌کننده و وضعیت آزمایش‌ها باید ثبت شوند.

اگر پس از تحویل اضطراری، آنتی‌بادی مهم شناسایی شود، تیم درمان و بانک خون باید سریعاً مطلع شوند.

الگوریتم عملی کراس‌مچ ناسازگار

تحویل واحد متوقف شود.

هویت بیمار، نمونه و شماره واحد بررسی گردد.

ABO و RhD بیمار و واحد مجدداً تأیید شود.

مرحله‌ای که ناسازگاری در آن رخ داده است مشخص گردد.

نتیجه Screen، پنل، اتوکنترل و DAT بررسی شود.

کراس‌مچ با سگمنت و لوله جدید تکرار گردد.

اگر فقط یک واحد ناسازگار است، DAT و آنتی‌ژن‌های واحد بررسی شوند.

اگر همه واحدها ناسازگارند، اتوآنتی‌بادی، آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن شایع یا چند آنتی‌بادی بررسی شود.

واحد مناسب بر اساس آنتی‌ژن‌منفی بودن و سازگاری انتخاب گردد.

اگر علت قابل حل نیست، نمونه برای بررسی مرجع ارسال شود و تصمیم بالینی با هماهنگی مسئول فنی و پزشک انجام گیرد.

بخش هشتم: تفسیر الگوهای آگلوتیناسیون و خطاهای خواندن واکنش‌ها

در آزمایش‌های ایمونوهماتولوژی، بسیاری از تصمیم‌ها بر پایه مشاهده مستقیم واکنش سلولی انجام می‌شوند. به همین دلیل، مهارت در خواندن آگلوتیناسیون فقط یک توانایی ظاهری نیست، بلکه بخشی از اعتبار نتیجه آزمایش است. کارشناس باید بتواند میان آگلوتیناسیون واقعی، رولو، رسوب فشرده، فیبرین، همولیز، واکنش Mixed-field و سایر الگوهای غیرطبیعی تفاوت قائل شود.

خطای خواندن ممکن است حتی زمانی رخ دهد که تمام مراحل فنی به‌درستی انجام شده‌اند. یک واکنش 1+ ممکن است منفی گزارش شود، یک رسوب فشرده ممکن است 2+ تلقی شود یا یک Mixed-field واقعی به‌عنوان واکنش ضعیف ثبت شود. این اشتباه‌ها می‌توانند مسیر کامل بررسی بیمار را تغییر دهند.

اصل مهم این است:

واکنش 4+ چگونه دیده می‌شود؟

در واکنش 4+ تقریباً تمام گلبول‌های قرمز در یک یا چند آگلوتینات بزرگ تجمع یافته‌اند و سوپرناتانت کاملاً شفاف است. با حرکت ملایم لوله، توده سلولی بزرگ به‌صورت یکپارچه حرکت می‌کند و سلول آزاد قابل توجهی دیده نمی‌شود.

این واکنش معمولاً در حضور آنتی‌ژن قوی و آنتی‌بادی مناسب دیده می‌شود. در گروه‌بندی ABO، واکنش‌های Anti-A و Anti-B در افراد دارای آنتی‌ژن مربوطه اغلب 3+ یا 4+ هستند.

با این حال، رسوب بیش از حد فشرده پس از سانتریفیوژ شدید ممکن است به‌اشتباه 4+ تلقی شود. واکنش واقعی باید پس از باز کردن ملایم رسوب همچنان به‌صورت توده‌های مشخص باقی بماند.

واکنش 3+

در واکنش 3+ چند آگلوتینات بزرگ مشاهده می‌شود و بیشتر سلول‌ها در این توده‌ها قرار دارند. سوپرناتانت معمولاً شفاف است، اما اندازه توده‌ها از واکنش 4+ کوچک‌تر است.

تفاوت میان 3+ و 4+ ممکن است در تصمیم بالینی همیشه تعیین‌کننده نباشد، اما ثبت صحیح آن در تحلیل اختلاف‌ها، مقایسه لات‌ها، کنترل کیفیت و بررسی اثر دوزاژ اهمیت دارد.

واکنش 2+

در واکنش 2+ آگلوتینات‌های متوسط همراه با مقدار مشخصی سلول آزاد دیده می‌شوند. سوپرناتانت ممکن است هنوز نسبتاً شفاف باشد، اما توده‌ها کوچک‌تر و پراکنده‌تر از 3+ هستند.

این واکنش باید با تکان ملایم و یکنواخت خوانده شود. اگر رسوب به‌درستی باز نشود، ممکن است 2+ به‌صورت 3+ گزارش شود. اگر بیش از حد تکان داده شود، توده‌ها شکسته و واکنش ضعیف‌تر از مقدار واقعی دیده می‌شود.

واکنش 1+

در واکنش 1+ آگلوتینات‌های کوچک در میان تعداد زیادی سلول آزاد مشاهده می‌شوند. تشخیص این واکنش نیازمند دقت بیشتری است، زیرا ممکن است با رسوب ناقص، ذرات فیبرین یا آلودگی اشتباه شود.

واکنش 1+ در غربالگری آنتی‌بادی، پنل یا کراس‌مچ می‌تواند اهمیت زیادی داشته باشد و نباید صرفاً به‌دلیل ضعیف بودن نادیده گرفته شود.

کارشناس باید فاز واکنش، تکرارپذیری، کنترل‌ها و سابقه بیمار را بررسی کند. واکنش ضعیف قابل تکرار معمولاً ارزش بیشتری از یک واکنش منفرد و غیرقابل تکرار دارد.

واکنش ضعیف یا W+

در واکنش Weak Positive آگلوتینات‌ها بسیار کوچک‌اند و ممکن است فقط با مشاهده دقیق یا میکروسکوپ قابل تشخیص باشند. این الگو باید از سلول‌های آزاد نامنظم، ذرات و رسوب ناقص تفکیک شود.

اگر واکنش فقط در یک لوله مشاهده می‌شود، تکرار هدفمند با لوله جدید، بررسی آنتی‌گرام و کنترل‌ها ضروری است.

گزارش W+ نباید به‌صورت خودکار به معنی بی‌اهمیت بودن باشد. برخی آنتی‌بادی‌های مهم، به‌ویژه در تیتر پایین یا دارای اثر دوزاژ، ممکن است فقط واکنش بسیار ضعیف ایجاد کنند.

واکنش منفی

در واکنش منفی، رسوب گلبول‌های قرمز به‌طور کامل و یکنواخت باز می‌شود و هیچ آگلوتینات قابل مشاهده‌ای باقی نمی‌ماند.

نتیجه منفی فقط زمانی معتبر است که روش و کنترل‌ها قابل قبول باشند. در مرحله AHG، منفی بودن باید با Check Cells تأیید شود.

رسوبی که به‌دلیل سانتریفیوژ زیاد به‌سختی باز می‌شود، نباید پیش از باز شدن کامل منفی یا مثبت گزارش شود.

Mixed-field؛ واکنش ضعیف نیست

در Mixed-field دو جمعیت مجزای سلولی مشاهده می‌شوند. بخشی از سلول‌ها آگلوتینه شده‌اند و بخشی دیگر آزاد باقی مانده‌اند. این الگو با واکنش 1+ یا 2+ تفاوت دارد.

در واکنش ضعیف، تقریباً تمام سلول‌ها متعلق به یک جمعیت‌اند و فقط اندازه آگلوتینات‌ها کوچک است. در Mixed-field، دو رفتار مشخص دیده می‌شود: یک جمعیت واکنش می‌دهد و جمعیت دیگر واکنش نمی‌دهد.

علل مهم Mixed-field شامل انتقال خون با گروه متفاوت، پیوند سلول بنیادی، زیرگروه‌های A3 و B3، کیمریسم، انتقال خون جنینی ـ مادری و برخی بدخیمی‌های خونی هستند.

در روش ژل، Mixed-field ممکن است به شکل تجمع سلول‌ها در بخش بالایی ستون همراه با رسوب سلول‌های منفی در پایین دیده شود.

کارشناس باید Mixed-field را به‌صراحت گزارش کند و آن را به عددی مانند 2+ تبدیل نکند، زیرا این تبدیل اطلاعات مهم درباره وجود دو جمعیت سلولی را از بین می‌برد.

همولیز به‌عنوان واکنش مثبت

در برخی واکنش‌های آنتی‌ژن و آنتی‌بادی، فعال شدن کمپلمان می‌تواند باعث همولیز شود. همولیز در این شرایط ممکن است نشانه واکنش مثبت باشد، حتی اگر آگلوتیناسیون واضح وجود نداشته باشد.

به همین دلیل، سوپرناتانت باید پیش از دور ریختن یا خواندن نتیجه بررسی شود. تغییر رنگ صورتی یا قرمز می‌تواند نشانه همولیز باشد.

اما اگر نمونه از ابتدا همولیزشده باشد، نمی‌توان مشخص کرد همولیز ناشی از واکنش آزمایش است یا کیفیت نامناسب نمونه. بنابراین وضعیت اولیه نمونه باید ثبت شود.

در غربالگری آنتی‌بادی یا کراس‌مچ، همولیز جدیدی که فقط در یک لوله ایجاد شده است باید به‌عنوان واکنش احتمالی بررسی شود.

چگونه همولیز واقعی واکنش را از نمونه همولیزشده تشخیص دهیم؟

اگر تمام لوله‌های حاوی نمونه بیمار از ابتدا سوپرناتانت قرمز دارند، احتمال همولیز پیش‌تحلیلی بیشتر است.

اگر فقط لوله حاوی یک سلول خاص یا واحد خاص پس از انکوباسیون همولیز شده باشد، احتمال واکنش ایمنی مطرح می‌شود.

مقایسه با اتوکنترل، کنترل منفی و وضعیت نمونه اولیه کمک‌کننده است.

در صورت شک، استفاده از نمونه جدید غیرهمولیزشده ممکن است لازم باشد.

رولو و تفاوت آن با آگلوتیناسیون

رولو معمولاً ظاهر منظم‌تری دارد و گلبول‌ها مانند سکه‌های روی هم قرارگرفته دیده می‌شوند. آگلوتیناسیون واقعی بیشتر به شکل توده‌های نامنظم و فشرده است.

بررسی میکروسکوپی می‌تواند کمک‌کننده باشد، اما مشاهده میکروسکوپی به‌تنهایی همیشه قطعی نیست. تکنیک جایگزینی سالین در شرایط مناسب می‌تواند افتراق را تأیید کند.

اگر پس از جایگزینی پلاسما با سالین، تجمع از بین برود، رولو محتمل است. اگر آگلوتیناسیون باقی بماند، واکنش واقعی بیشتر مطرح می‌شود.

فیبرین و لخته‌های کوچک

فیبرین می‌تواند به شکل رشته‌ها یا توده‌های کوچک در لوله دیده شود و با آگلوتیناسیون ضعیف اشتباه شود.

این حالت بیشتر در نمونه‌هایی دیده می‌شود که به‌طور کامل لخته نشده‌اند، به‌خوبی سانتریفیوژ نشده‌اند یا حاوی ذرات لخته هستند.

فیبرین معمولاً شکل نامنظم و رشته‌ای دارد و با باز کردن رسوب رفتار متفاوتی از آگلوتینات واقعی نشان می‌دهد.

در صورت شک، نمونه باید مجدداً سانتریفیوژ یا از نمونه مناسب دیگری استفاده شود. حذف مکانیکی ذرات و سپس گزارش نتیجه بدون اطمینان از کیفیت نمونه روش قابل قبولی نیست.

رسوب فشرده و شبه‌آگلوتیناسیون

سانتریفیوژ بیش از حد می‌تواند سلول‌ها را به‌صورت رسوبی فشرده در ته لوله قرار دهد. اگر کارشناس لوله را فقط کمی حرکت دهد، این رسوب ممکن است به شکل یک توده بزرگ دیده شود و مثبت کاذب ایجاد کند.

رسوب فشرده با حرکت کنترل‌شده معمولاً به‌تدریج و به‌صورت یکنواخت باز می‌شود، در حالی که آگلوتینات واقعی به توده‌های مشخص تقسیم می‌شود.

به همین دلیل، سرعت و زمان سانتریفیوژ باید با روش مطابقت داشته باشد و نحوه باز کردن رسوب میان کارکنان استاندارد شود.

آلودگی و ذرات خارجی

گردوغبار، الیاف پنبه، ذرات درپوش، رسوبات معرف یا آلودگی میکروبی ممکن است در لوله دیده شوند و با آگلوتیناسیون اشتباه شوند.

توده‌های ناشی از آلودگی معمولاً شکل نامنظم دارند و با توزیع گلبول‌های قرمز هماهنگ نیستند.

ظاهر معرف‌ها باید پیش از استفاده بررسی شود. ویال کدر، دارای رسوب غیرمنتظره، همولیز یا تغییر رنگ نباید بدون بررسی استفاده شود.

آگلوتیناسیون خودبه‌خودی گلبول‌های بیمار

در حضور اتوآنتی‌بادی سرد، گلبول‌های بیمار ممکن است حتی پیش از افزودن معرف به‌صورت خودبه‌خودی آگلوتینه شوند. این وضعیت می‌تواند سل‌تایپ، شمارش سلولی، تهیه سوسپانسیون و سایر آزمون‌ها را مختل کند.

اگر سوسپانسیون بیمار بدون معرف نیز تجمع نشان دهد، باید اتوکنترل و DAT بررسی شوند.

گرم نگه داشتن نمونه، شست‌وشوی سلول‌ها با سالین گرم و استفاده از روش Prewarm ممکن است مزاحمت را کاهش دهد.

کارشناس نباید آگلوتیناسیون خودبه‌خودی را به‌عنوان واکنش اختصاصی Anti-A، Anti-B یا Anti-D گزارش کند.

تفاوت آگلوتیناسیون ماکروسکوپی و میکروسکوپی

خواندن ماکروسکوپی روش اصلی در بسیاری از آزمون‌های لوله‌ای است. استفاده از میکروسکوپ ممکن است برای تأیید واکنش‌های بسیار ضعیف یا افتراق الگوها کمک‌کننده باشد، اما نباید به‌صورت روتین برای تبدیل هر نتیجه منفی به مثبت استفاده شود.

بررسی میکروسکوپی بیش از حد حساس می‌تواند تجمعات کوچک و غیراختصاصی را برجسته کند و مثبت کاذب افزایش یابد.

هر آزمایشگاه باید مشخص کند در چه شرایطی خواندن میکروسکوپی مجاز یا لازم است و نحوه گزارش آن چگونه خواهد بود.

خطاهای خواندن در روش ژل

در روش ژل، محل قرارگیری گلبول‌ها در ستون نشان‌دهنده شدت واکنش است. سلول‌های باقی‌مانده در بالای ستون معمولاً واکنش قوی‌تر و رسوب کامل در پایین ستون نتیجه منفی را نشان می‌دهد.

با این حال، خطاهایی مانند حجم نادرست نمونه، سوسپانسیون غلیظ، وجود لخته، سانتریفیوژ نامناسب، خشک شدن کارت، استفاده از کارت خارج از دمای مناسب و خواندن با تأخیر می‌توانند الگوی غیرقابل اعتماد ایجاد کنند.

Mixed-field در ژل باید از پراکندگی نامنظم ناشی از کیفیت بد نمونه یا لخته تفکیک شود.

نتیجه ژل نیز مانند روش لوله‌ای باید همراه با کنترل‌ها، سابقه بیمار و الگوی سایر تست‌ها تفسیر شود.

خطاهای خواندن در روش میکروپلیت

در روش میکروپلیت، توزیع سلول‌ها در کف چاهک مبنای تفسیر است. تشکیل یک دکمه فشرده معمولاً به نفع نتیجه منفی و پخش شدن سلول‌ها در سطح چاهک به نفع واکنش مثبت است.

لرزش پلیت، زمان نامناسب خواندن، تبخیر، حجم نادرست، شست‌وشوی ناکافی و آلودگی میان چاهک‌ها می‌توانند الگو را تغییر دهند.

خواندن دستی پلیت نیازمند نور و زاویه مناسب است. نتیجه مرزی باید با روش تأییدی بررسی شود.

تفاوت واکنش واقعی و Carry-over

Carry-over زمانی رخ می‌دهد که مقدار کمی از نمونه، سلول یا معرف از یک لوله یا چاهک به دیگری منتقل شود. این انتقال می‌تواند یک واکنش ضعیف کاذب ایجاد کند.

استفاده مشترک از نوک پیپت، تماس قطره‌چکان با لبه لوله، پاشش هنگام مخلوط‌کردن و چیدمان نامناسب نمونه‌ها از علل آن هستند.

اگر واکنش ضعیف فقط کنار یک نمونه بسیار قوی دیده شود، احتمال Carry-over باید بررسی گردد.

تکرار با لوله جدید، نوک جدید و ترتیب کاری متفاوت می‌تواند کمک‌کننده باشد.

واکنش غیرقابل تکرار

گاهی واکنش ضعیفی در آزمایش اول دیده می‌شود اما در تکرار از بین می‌رود. این حالت ممکن است ناشی از خطای خواندن، آلودگی، حجم نامناسب، تغییر دما یا آنتی‌بادی بسیار ضعیف باشد.

نباید نتیجه اول را بدون بررسی حذف کرد. تفاوت میان دو تکرار باید مستند و علت احتمالی بررسی شود.

تکرار باید هدفمند باشد و در صورت امکان با نمونه یا معرف تازه و توسط کارشناس دوم انجام شود.

اگر واکنش اولیه در فاز AHG بوده و با سابقه بیمار سازگار است، استفاده از روش حساس‌تر یا ارسال به آزمایشگاه مرجع ممکن است لازم باشد.

بخش نهم: خطاهای رایج کارشناسان هنگام انجام آزمایش‌های ایمونوهماتولوژی

بسیاری از خطاهای روزمره ناشی از ناآگاهی کامل از روش نیستند، بلکه در اثر عجله، عادت‌های نادرست، وقفه در کار و انجام هم‌زمان تعداد زیادی آزمایش رخ می‌دهند.

شناخت این خطاها به کارشناس کمک می‌کند پیش از اینکه نتیجه غیرمنتظره ایجاد شود، روش کاری خود را اصلاح کند.

شروع آزمایش بدون بررسی نمونه

یکی از خطاهای رایج این است که نمونه بلافاصله وارد فرآیند آزمایش می‌شود، بدون آنکه هویت، کیفیت، تاریخ نمونه‌گیری و سابقه بیمار بررسی شود.

این کار ممکن است باعث شود آزمایش روی نمونه قدیمی، همولیزشده، اشتباه یا فاقد اعتبار زمانی انجام شود.

پیش از باز کردن لوله، کارشناس باید حداقل اطلاعات هویتی، نوع نمونه، کیفیت ظاهری و سوابق مهم را کنترل کند.

آماده کردن هم‌زمان تعداد زیاد لوله

انجام گروه‌بندی یا کراس‌مچ تعداد زیادی بیمار به‌صورت هم‌زمان احتمال جابه‌جایی، فراموش کردن معرف و انتقال آلودگی را افزایش می‌دهد.

بهتر است تعداد نمونه‌های هر سری با ظرفیت کاری و روش کنترل‌شده آزمایشگاه متناسب باشد.

هر لوله باید پیش از افزودن نمونه به‌وضوح شناسایی شود و ترتیب ثابتی برای افزودن معرف‌ها وجود داشته باشد.

استفاده از برچسب‌های مبهم

نوشتن فقط شماره‌هایی مانند 1 و 2 روی لوله‌ها بدون ارتباط روشن با بیمار یا مرحله آزمایش خطرناک است.

برچسب باید به‌گونه‌ای باشد که حتی پس از وقفه کاری، هویت لوله و محتویات آن مشخص بماند.

در کراس‌مچ، شماره واحد خون نیز باید به‌صورت واضح و کامل ثبت شود.

افزودن معرف بدون مشاهده قطره

گاهی قطره‌چکان حباب دارد یا قطره کامل تشکیل نمی‌شود. کارشناس ممکن است تصور کند معرف افزوده شده، در حالی که حجم کافی وارد لوله نشده است.

هنگام افزودن هر قطره باید خروج آن مشاهده شود. قطره‌چکان نباید با لبه لوله یا نمونه تماس پیدا کند.

استفاده از یک پیپت برای چند نمونه

استفاده از نوک مشترک یا شست‌وشوی ناکافی پیپت می‌تواند Carry-over ایجاد کند.

برای هر نمونه و معرف باید از وسیله انتقال مناسب و تمیز استفاده شود.

در روش دستی، پیپت‌های کالیبره و نوک یک‌بارمصرف ترجیح دارند.

مخلوط نکردن صحیح

پس از افزودن سلول و سرم یا معرف، محتویات باید به‌طور یکنواخت مخلوط شوند. مخلوط‌نکردن ممکن است تماس آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را کاهش دهد.

در مقابل، تکان شدید می‌تواند همولیز ایجاد کند یا آگلوتینات‌های ضعیف را پس از سانتریفیوژ بشکند.

شدت و روش مخلوط‌کردن باید با SOP هماهنگ باشد.

استفاده از سوسپانسیون چشمی و غیراستاندارد

تهیه سوسپانسیون بسیار غلیظ یا رقیق یکی از علل شایع اختلاف نتایج میان کارشناسان است.

رنگ ظاهری سوسپانسیون به نوع نمونه، هماتوکریت و حجم سالین وابسته است و همیشه معیار دقیقی نیست.

روش تهیه باید استاندارد و قابل تکرار باشد.

استفاده از معرف سرد یا بسیار گرم

معرفی که مستقیماً از یخچال خارج شده ممکن است در برخی روش‌ها دمای محیط واکنش را تغییر دهد. از سوی دیگر، باقی ماندن طولانی معرف در دمای اتاق یا کنار منبع گرما می‌تواند فعالیت آن را کاهش دهد.

معرف باید طبق دستورالعمل سازنده به شرایط مصرف برسد و پس از استفاده به‌موقع به محل نگهداری بازگردد.

گرم کردن مستقیم ویال روی دستگاه یا در دست برای مدت طولانی روش استانداردی نیست.

بی‌توجهی به زمان انکوباسیون

زمان انکوباسیون نباید به‌صورت تقریبی و براساس حافظه تعیین شود. شروع زمان هر سری باید ثبت یا با تایمر کنترل شود.

کوتاه شدن زمان ممکن است واکنش را از دست بدهد و طولانی شدن بیش از حد می‌تواند واکنش‌های غیراختصاصی ایجاد کند.

قرار دادن لوله در بن‌ماری بدون کنترل سطح آب

اگر سطح آب مناسب نباشد یا لوله بیش از حد بالا یا پایین قرار گیرد، انتقال حرارت یکنواخت نخواهد بود.

دمای واقعی بن‌ماری و زمان رسیدن لوله به دمای موردنظر باید در اعتبارسنجی روش لحاظ شده باشد.

نفوذ آب آلوده به داخل لوله نیز می‌تواند نتیجه را مختل کند.

شست‌وشوی دستی ناکافی

در تست AHG، باقی ماندن مقدار کمی IgG آزاد می‌تواند معرف را خنثی و نتیجه را منفی کاذب کند.

تخلیه ناقص سوپرناتانت، کم بودن حجم سالین و تأخیر میان شست‌وشوها از خطاهای شایع‌اند.

پس از آخرین شست‌وشو، AHG باید فوراً اضافه شود.

افزودن Check Cells به نتیجه مثبت

Check Cells برای اعتبارسنجی نتایج منفی مرحله AHG استفاده می‌شوند. افزودن آن‌ها به لوله‌ای که از قبل مثبت است معمولاً ضرورتی ندارد و ممکن است تفسیر را پیچیده کند.

نتایج منفی بدون Check Cells مثبت معتبر نیستند.

تکرار آزمایش بدون تغییر هیچ عامل

تکرار همان آزمایش با همان لوله، همان معرف، همان نمونه و همان روش اغلب فقط همان خطا را بازتولید می‌کند.

تکرار باید یک هدف داشته باشد؛ برای مثال استفاده از سوسپانسیون تازه، معرف با لات دیگر، نمونه جدید، روش متفاوت یا کارشناس دوم.

پیش از تکرار باید مشخص شود کدام فرضیه در حال آزمون است.

انتخاب نتیجه‌ای که با انتظار هماهنگ‌تر است

گاهی کارشناس از میان دو نتیجه متفاوت، نتیجه‌ای را انتخاب می‌کند که با سابقه بیمار یا تصور اولیه سازگارتر است.

این کار ممکن است یک خطای واقعی، تغییر بالینی یا نمونه اشتباه را پنهان کند.

هر اختلاف باید حل یا به‌طور مستند توضیح داده شود.

نادیده گرفتن واکنش ضعیف

واکنش 1+ یا W+ ممکن است به‌دلیل اهمیت ظاهراً کم، منفی تلقی شود. این اشتباه به‌ویژه در Anti-Jka، Anti-Fya و آنتی‌بادی‌های دارای دوزاژ خطرناک است.

هر واکنش قابل تکرار باید بررسی شود، حتی اگر بسیار ضعیف باشد.

خواندن دیرهنگام لوله‌ها

پس از سانتریفیوژ، واکنش‌ها باید در بازه تعیین‌شده خوانده شوند. تأخیر ممکن است رسوب را فشرده، واکنش را ضعیف یا الگو را تغییر دهد.

کارشناس نباید چند سری لوله را سانتریفیوژ کند و سپس با فاصله زیاد آن‌ها را بخواند.

تکان دادن شدید لوله

حرکت شدید ممکن است آگلوتینات‌های ضعیف را بشکند و واکنش مثبت را منفی نشان دهد.

لوله باید با حرکت ملایم و یکنواخت خوانده شود. روش باز کردن رسوب باید میان کارکنان هماهنگ باشد.

نادیده گرفتن همولیز

تمرکز صرف بر آگلوتیناسیون ممکن است باعث شود همولیز به‌عنوان نشانه واکنش مثبت ثبت نشود.

سوپرناتانت هر لوله باید بررسی و وضعیت اولیه نمونه در نظر گرفته شود.

گزارش نتیجه بدون بررسی سابقه

سابقه آنتی‌بادی، انتقال خون، بارداری، پیوند و نتایج قبلی بخشی از تفسیر آزمایش است.

منفی شدن آنتی‌بادی در نمونه فعلی، سابقه آن را حذف نمی‌کند.

گزارش گروه خون با وجود اختلاف حل‌نشده

سل‌تایپ و بک‌تایپ نامنطبق نباید با انتخاب یکی از دو نتیجه گزارش شوند.

در شرایط خاص که اختلاف قابل انتظار است، مانند نوزاد یا بیمار پیوندی، گزارش باید با توضیح و براساس سیاست مرکز انجام شود.

تحویل واحد ناسازگار بدون مسیر اورژانسی

در شرایط فوری ممکن است خون پیش از تکمیل بررسی‌ها تحویل شود، اما این اقدام باید براساس مسیر اورژانسی تعریف‌شده و با ثبت کامل انجام شود.

ناسازگاری نباید صرفاً به دلیل درخواست تلفنی نادیده گرفته شود.

بخش دهم: الگوریتم‌های سریع رفع اشکال برای کارشناس بانک خون

الگوریتم‌های زیر برای جایگزینی SOP یا تصمیم مسئول فنی طراحی نشده‌اند، بلکه به کارشناس کمک می‌کنند هنگام مشاهده نتیجه غیرمنتظره، مسیر بررسی را منظم دنبال کند.

الگوریتم اول: سل‌تایپ و بک‌تایپ تطابق ندارند

ابتدا نتیجه نهایی گزارش نشود.

هویت بیمار، لوله و درخواست بررسی شود.

سابقه قبلی ABO، انتقال خون و پیوند کنترل گردد.

آزمایش با لوله، سوسپانسیون و معرف تازه تکرار شود.

مشخص شود اختلاف در سل‌تایپ است یا بک‌تایپ.

در ضعف بک‌تایپ، سن، نقص ایمنی، نسبت سرم به سلول و آنتی‌بادی سرد بررسی شود.

در ضعف سل‌تایپ، سلول‌ها شسته و احتمال زیرگروه، بیماری خونی، انتقال خون و DAT مثبت بررسی گردد.

در واکنش اضافی، اتوکنترل، سلول O، رولو و آنتی‌بادی سرد بررسی شوند.

در Mixed-field، انتقال خون، پیوند، زیرگروه و کیمریسم مدنظر قرار گیرند.

اگر علت مشخص نشد، نمونه جدید یا ارجاع به آزمایشگاه مرجع انجام شود.

الگوریتم دوم: Anti-D ضعیف یا متناقض است

گزارش RhD متوقف شود.

سابقه RhD، انتقال خون و پیوند بررسی گردد.

آزمایش با سوسپانسیون تازه و معرف معتبر تکرار شود.

کنترل Rh بررسی گردد.

در کنترل مثبت، DAT و واکنش غیراختصاصی ارزیابی شود.

در واکنش ضعیف یا منفی، سیاست انجام Weak D بررسی گردد.

در اختلاف میان دو Anti-D، نوع کلون و واریانت D مطرح شود.

در Mixed-field، وجود دو جمعیت سلولی بررسی گردد.

در موارد مهم یا حل‌نشده، بررسی مولکولی RHD توصیه شود.

الگوریتم سوم: غربالگری آنتی‌بادی مثبت است

صحت کنترل‌ها و هویت نمونه بررسی شود.

شدت و فاز واکنش سلول‌ها ثبت گردد.

اتوکنترل انجام شود.

سابقه آنتی‌بادی، بارداری و انتقال خون بررسی گردد.

در اتوکنترل مثبت، DAT انجام شود.

پنل شناسایی آنتی‌بادی اجرا گردد.

اثر دوزاژ، Rule of Three و فنوتیپ بیمار بررسی شوند.

در واکنش‌های گسترده، اتوآنتی‌بادی یا آنتی‌ژن با شیوع بالا مطرح شود.

در الگوی پیچیده یا خون سازگار دشوار، نمونه به مرکز مرجع ارسال شود.

الگوریتم چهارم: Screen منفی ولی کراس‌مچ ناسازگار است

ABO بیمار و واحد دوباره بررسی شود.

کراس‌مچ با سگمنت و لوله جدید تکرار گردد.

مشخص شود ناسازگاری در Immediate Spin یا AHG است.

اگر فقط یک واحد ناسازگار است، DAT واحد و آنتی‌ژن کم‌شیوع بررسی شود.

اگر همه واحدها ناسازگارند، اتوکنترل، DAT بیمار، رولو و آنتی‌بادی سرد بررسی شوند.

سابقه آنتی‌بادی بیمار مجدداً کنترل گردد.

واحد ناسازگار تا روشن شدن علت تحویل نشود.

الگوریتم پنجم: DAT مثبت است

نتیجه با کنترل معتبر تأیید شود.

نمونه و نوع ضدانعقاد بررسی گردد.

سابقه انتقال خون، دارو، بارداری و شواهد همولیز ارزیابی شود.

DAT با Anti-IgG و Anti-C3 تفکیک گردد.

غربالگری، اتوکنترل و در صورت نیاز Elution انجام شود.

در انتقال خون اخیر، واکنش همولیتیک تأخیری بررسی گردد.

DAT مثبت بدون شواهد همولیز به‌عنوان تشخیص قطعی همولیز گزارش نشود.

الگوریتم ششم: همه سلول‌های پنل مثبت‌اند

اتوکنترل بررسی شود.

در اتوکنترل مثبت، اتوآنتی‌بادی، رولو یا واکنش غیراختصاصی مطرح است.

در اتوکنترل منفی، آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا یا چند آلوآنتی‌بادی مطرح می‌شود.

DAT و فاز واکنش بررسی شوند.

شدت یکنواخت یا متغیر واکنش‌ها ثبت گردد.

در صورت نیاز، جذب، Elution، سلول‌های انتخابی یا آزمایشگاه مرجع استفاده شود.

الگوریتم هفتم: واکنش فقط در دمای اتاق دیده می‌شود

آنتی‌بادی سرد یا IgM مطرح شود.

اتوکنترل و DAT بررسی شوند.

دامنه حرارتی تعیین گردد.

آنتی‌گرام برای آنتی‌ژن‌های M، N، P1 و Lewis بررسی شود.

در صورت مزاحمت، تکنیک Prewarm مطابق SOP اجرا گردد.

وجود واکنش در ۳۷ درجه یا AHG از نظر اهمیت بالینی ارزیابی شود.

الگوریتم هشتم: واکنش Mixed-field مشاهده شده است

واکنش به‌عنوان Mixed-field ثبت شود، نه 1+ یا 2+.

سابقه انتقال خون اخیر بررسی گردد.

گروه واحدهای تزریق‌شده با گروه بیمار مقایسه شود.

سابقه پیوند سلول بنیادی و گروه دهنده بررسی گردد.

احتمال زیرگروه A3 یا B3، کیمریسم و بیماری خونی در نظر گرفته شود.

در صورت نیاز، نمونه پیش از انتقال، روش ژل، بررسی مولکولی یا آزمایشگاه مرجع استفاده شود.

بخش یازدهم: چه زمانی کارشناس باید آزمایش را متوقف و موضوع را ارجاع دهد؟

استقلال علمی کارشناس به معنای ادامه نامحدود آزمایش بدون حمایت تخصصی نیست. برخی نتایج باید سریعاً به مسئول فنی، پزشک بانک خون یا آزمایشگاه مرجع ارجاع شوند.

وجود اختلاف هویتی، احتمال WBIT، ناسازگاری ABO، واکنش گسترده غیرقابل تفسیر، آنتی‌بادی علیه آنتی‌ژن با شیوع بالا، اتوآنتی‌بادی همراه با نیاز فوری به خون، نتیجه RhD متناقض در زن باردار و نبود واحد سازگار از موارد مهم ارجاع هستند.

همچنین زمانی که نتیجه با سابقه بیمار اختلاف اساسی دارد و علت فنی یا بالینی مشخص نیست، گزارش نباید صرفاً براساس نتیجه فعلی انجام شود.

ارجاع باید همراه با اطلاعات کامل باشد. ارسال یک نمونه بدون سابقه انتقال خون، بارداری، نتایج DAT، پنل و گروه قبلی، فرآیند بررسی را کند و ناقص می‌کند.

چه اطلاعاتی هنگام ارجاع باید ارسال شود؟

مشخصات کامل بیمار و دلیل درخواست باید درج شود.

سابقه انتقال خون، بارداری، پیوند و آنتی‌بادی‌های قبلی ثبت گردد.

نتایج ABO، RhD، DAT، Screen، پنل، اتوکنترل و کراس‌مچ همراه با شدت و فاز واکنش ارسال شوند.

روش و معرف‌های استفاده‌شده، شماره لات و هر اقدام رفع اشکال انجام‌شده مشخص گردد.

نمونه مناسب بیمار و در صورت نیاز سگمنت واحدهای ناسازگار ارسال شود.

بخش دوازدهم: مستندسازی نتیجه و رفع اشکال

مستندسازی در ایمونوهماتولوژی فقط برای بازرسی یا تکمیل فرم نیست. اگر نتیجه غیرمنتظره‌ای رخ دهد، ثبت دقیق مراحل به کارشناس بعدی اجازه می‌دهد بفهمد چه آزمایش‌هایی انجام شده و هر نتیجه چگونه تفسیر شده است.

عبارت‌هایی مانند «تکرار شد»، «بررسی شد» یا «مشکلی نبود» کافی نیستند. باید مشخص شود آزمایش با چه روش و چه تغییری تکرار شده، نتیجه هر مرحله چه بوده و چرا نتیجه نهایی پذیرفته شده است.

برای مثال، در اختلاف ABO بهتر است ثبت شود که سل‌تایپ با سلول شسته‌شده تکرار شده، بک‌تایپ پس از انکوباسیون چه تغییری داشته، اتوکنترل و سلول O چه نتیجه‌ای داده‌اند و علت نهایی اختلاف چه بوده است.

در کراس‌مچ ناسازگار نیز باید شماره واحد، فاز ناسازگاری، نتیجه Screen، DAT واحد و تصمیم نهایی ثبت شوند.

ثبت شدت واکنش

ثبت فقط «مثبت» یا «منفی» اطلاعات کافی برای مقایسه و تفسیر ایجاد نمی‌کند.

شدت واکنش، Mixed-field، همولیز و فاز واکنش باید تا حد امکان ثبت شوند.

این موضوع در بررسی تغییرات آنتی‌بادی، مقایسه با نتایج قبلی و ارزیابی عملکرد معرف‌ها اهمیت دارد.

ثبت سابقه آنتی‌بادی

آنتی‌بادی شناسایی‌شده نباید با منفی شدن در نمونه‌های بعدی از سابقه بیمار حذف شود.

تیتر بسیاری از آنتی‌بادی‌ها با گذشت زمان کاهش می‌یابد، اما مواجهه مجدد می‌تواند پاسخ سریع و واکنش همولیتیک ایجاد کند.

سابقه آنتی‌بادی باید در سیستم به‌صورت دائمی یا مطابق سیاست مرکز قابل مشاهده باشد و هنگام انتخاب واحد خون در نظر گرفته شود.

ثبت نتیجه حل‌نشده

گاهی با وجود بررسی مناسب، اختصاصیت آنتی‌بادی یا علت اختلاف به‌طور کامل مشخص نمی‌شود. در این شرایط نباید یک نتیجه قطعی و غیرمطمئن ثبت شود.

گزارش باید محدودیت را بیان کند؛ برای مثال «واکنش آنتی‌بادی غیرمنتظره مشاهده شد؛ تعیین اختصاصیت در حال بررسی است» یا «گروه ABO به دلیل Mixed-field ناشی از انتقال اخیر نیازمند تفسیر با سابقه بیمار است.»

نحوه گزارش باید مطابق سیاست آزمایشگاه و با تأیید مسئول فنی باشد.

بخش سیزدهم: پیشگیری عملی از خطا در شیفت روزانه

پیشگیری از خطا همیشه به فناوری پیچیده نیاز ندارد. بسیاری از خطاها با نظم کاری، استفاده از چک‌های کوتاه و توقف آگاهانه پیش از گزارش کاهش می‌یابند.

کارشناس باید پیش از شروع هر سری آزمایش از آمادگی دستگاه، معرف، کنترل و محیط کار مطمئن شود.

نمونه‌ها باید به تعداد قابل مدیریت پردازش شوند.

هر وقفه در کار باید به‌عنوان نقطه خطر در نظر گرفته شود. پس از بازگشت، مرحله آخر از روی ثبت مکتوب بررسی شود، نه حافظه.

نتیجه غیرمنتظره باید باعث توقف کوتاه و بازبینی شود.

قانون توقف پیش از گزارش

پیش از تأیید نتیجه، کارشناس باید از خود بپرسد:

آیا هویت نمونه قطعی است؟

آیا نتیجه با سابقه بیمار سازگار است؟

آیا کنترل‌ها قابل قبول‌اند؟

آیا سل‌تایپ و بک‌تایپ مطابقت دارند؟

آیا واکنش ضعیف، Mixed-field یا همولیز وجود دارد؟

آیا نتیجه Screen، DAT و کراس‌مچ با هم قابل توضیح‌اند؟

اگر پاسخ یکی از این پرسش‌ها منفی یا نامشخص باشد، گزارش باید متوقف و بررسی ادامه یابد.

ارتباط کنترل کیفیت با رفع خطای بیمار

هنگام مشاهده نتیجه غیرمنتظره، باید مشخص شود مشکل فقط مربوط به یک بیمار است یا می‌تواند تمام نتایج آن سری را تحت تأثیر قرار داده باشد.

اگر چند بیمار الگوی مشابه غیرعادی نشان می‌دهند، احتمال مشکل معرف، دستگاه، دما یا روش افزایش می‌یابد.

اگر کنترل کیفی رد شده است، نتیجه بیمار حتی اگر ظاهراً منطقی باشد، قابل پذیرش نیست.

ارتباط خطاهای آزمایشگاه با هموویژیلانس

خطایی که پیش از رسیدن خون به بیمار شناسایی می‌شود، Near Miss است و ارزش گزارش دارد. گزارش Near Miss به این معنا نیست که کارشناس مقصر بوده است؛ بلکه فرصتی برای شناسایی نقاط خطر و جلوگیری از تکرار حادثه است.

نمونه اشتباه، اختلاف گروه خون، انتخاب اولیه واحد نامناسب، برچسب‌گذاری اشتباه و کشف آنتی‌بادی پیش از تحویل خون از نمونه‌های رویدادهایی هستند که می‌توانند در سیستم هموویژیلانس ثبت و تحلیل شوند.

جمع‌بندی

بیشتر خطاهای ایمونوهماتولوژی با یک علامت واضح مانند خرابی کامل دستگاه یا منفی شدن همه کنترل‌ها ظاهر نمی‌شوند. بسیاری از آن‌ها به شکل واکنش ضعیف، اختلاف جزئی با سابقه، Mixed-field، کراس‌مچ ناسازگار با یک واحد یا نتیجه‌ای که «تقریباً درست» به نظر می‌رسد، دیده می‌شوند.

مهارت اصلی کارشناس بانک خون این نیست که فقط مراحل آزمایش را اجرا کند؛ بلکه باید بتواند تشخیص دهد چه زمانی نتیجه قابل اعتماد نیست و چگونه علت را مرحله‌به‌مرحله پیدا کند.

در برخورد با هر نتیجه غیرمنتظره، ابتدا باید خطای هویتی و تکنیکی رد شود. سپس نمونه، معرف، تجهیزات، فاز واکنش، اتوکنترل، DAT، سابقه انتقال خون و شرایط بالینی بیمار بررسی شوند.

تکرار آزمایش زمانی ارزشمند است که هدف مشخصی داشته باشد. تکرار بدون تغییر شرایط فقط ممکن است همان خطا را دوباره تولید کند.

واکنش ضعیف نباید نادیده گرفته شود، Mixed-field نباید به یک عدد ساده تبدیل شود، نتیجه منفی AHG بدون Check Cells معتبر نیست و کراس‌مچ ناسازگار نباید بدون یافتن علت کنار گذاشته شود.

ایمنی انتقال خون از مجموعه‌ای از تصمیم‌های کوچک اما دقیق ساخته می‌شود. بررسی هویت، تهیه سوسپانسیون صحیح، رعایت زمان و دما، خواندن درست آگلوتیناسیون، توجه به سابقه آنتی‌بادی و توقف پیش از گزارش نتیجه نامطمئن، هرکدام می‌توانند از یک خطای جدی جلوگیری کنند.

سؤالات رایج درباره منابع خطا در بانک خون

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر درباره خطاهای بانک خون

AABB Standards for Blood Banks and Transfusion Serviceshttps://www.aabb.org/standards-accreditation/standards/blood-banks-and-transfusion-services
ISBT Immunohaematology Resourceshttps://www.isbtweb.org/isbt-working-parties/immunohaematology/resources.html
Serious Hazards of Transfusion (SHOT) – Annual Report 2024https://www.shotuk.org/shot-reports/annual-shot-report-2024/
SHOT – Near Miss: Wrong Blood in Tube (WBIT)https://www.shotuk.org/wp-content/uploads/2024/10/13a.-Near-Miss-%E2%80%93-Wrong-Blood-in-Tube-WBIT-2023.pdf
CLSI ILA33 – Validation of Automated Systems for Immunohematological Testinghttps://clsi.org/shop/standards/ila33/
CLSI PRE04 – Handling, Transport, Processing, and Storage of Blood Specimenshttps://clsi.org/shop/standards/pre04/