مقدمه

محیط کشت نمک ۶.۵ درصد (Salt Tolerance Broth) یک محیط انتخابی مایع است که بر پایه براث Brain Heart Infusion (BHI) یا Tryptic Soy Broth (TSB) تهیه می‌شود و با افزودن ۶.۵ درصد کلرید سدیم (NaCl) برای بررسی توانایی باکتری‌ها در تحمل غلظت‌های بالای نمک طراحی شده است. این محیط نمک را به عنوان عامل انتخابی استفاده می‌کند که رشد باکتری‌های حساس به نمک را مهار کرده و تنها باکتری‌های مقاوم را اجازه رشد می‌دهد. نمک با افزایش فشار اسمزی، نفوذپذیری غشای سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهد و باعث خروج آب از سلول می‌شود، که این امر رشد باکتری‌های غیرمقاوم را متوقف می‌کند. اغلب حاوی مقادیر کمی گلوکز (برای تولید اسید) و نشانگر pH مانند برومکرزول بنفش (Bromcresol Purple) است که تغییر رنگ از بنفش به زرد را در صورت تولید اسید نشان می‌دهد. این محیط در میکروبیولوژی بالینی و تشخیصی برای شناسایی باکتری‌های تحمل‌کننده نمک بالا کاربرد دارد و معمولاً در ترکیب با تست‌های دیگر مانند بایل اسکولین استفاده می‌شود.

کاربردها

این محیط عمدتاً برای تمایز انتروکوکوس (Enterococcus) از استرپتوکوکوس گروه D غیرانتروکوکی استفاده می‌شود. انتروکوکوس‌ها مانند Enterococcus faecalis و Enterococcus faecium قادر به رشد در غلظت ۶.۵ درصد نمک هستند، در حالی که استرپتوکوکوس‌های گروه D غیرانتروکوکی مانند Streptococcus bovis رشد نمی‌کنند. بیش از ۸۰ درصد استرپتوکوکوس گروه B (مانند Streptococcus agalactiae) و گاهی گروه A نیز در این محیط رشد می‌کنند، اما گروه‌های دیگر حساس هستند. این تست در ترکیب با تست بایل اسکولین (Bile Esculin) برای شناسایی دقیق‌تر استفاده می‌شود: نتیجه مثبت در نمک و اسکولین مثبت نشان‌دهنده انتروکوکوس است؛ اسکولین مثبت بدون رشد در نمک، نشان‌دهنده استرپتوکوکوس گروه D غیرانتروکوکی. همچنین، برای غنی‌سازی باکتری‌های مقاوم مانند MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) در نمونه‌های بالینی مانند ادرار، خون یا زخم کاربرد دارد. در میکروبیولوژی غذایی، برای شناسایی باکتری‌های هالوتولرانت (halotolerant) مانند برخی گونه‌های ویبریو یا استافیلوکوکوس استفاده می‌شود. این محیط به تشخیص عفونت‌های روده‌ای، ادراری و سپتی‌سمی کمک می‌کند و در کنترل کیفیت آزمایشگاهی برای تمایز گروه‌های استرپتوکوکی مفید است.

طرز تهیه محیط کشت نمک 6.5 درصد و مواد لازم

طرز تهیه محیط کشت نمک 6.5 درصد به شرح زیر است که برای تهیه ۱ لیتر محیط، مواد زیر لازم است:
– کلرید سدیم (NaCl): ۶۵ گرم (برای ایجاد غلظت ۶.۵ درصد).
– پایه براث: ۲۵-۳۷ گرم BHI یا TSB (Brain Heart Infusion: ۱۷.۵ گرم، یا Tryptic Soy Broth: ۳۰ گرم).
– اختیاری برای نوع با نشانگر: گلوکز ۲ گرم (برای تخمیر و تولید اسید)، برومکرزول بنفش ۰.۰۳ گرم (نشانگر pH).
– اختیاری برای نوع آگار: آگار ۱۵-۲۵ گرم (برای محیط جامد).

روش: مواد را در ۱ لیتر آب دیونیزه یا مقطر حل کنید. مخلوط را حرارت دهید تا کاملاً حل شود (بدون جوشاندن بیش از حد برای جلوگیری از تخریب مواد مغذی). pH را به ۷.۰ ± ۰.۲ (یا ۶.۹ ± ۰.۳) در ۲۵ درجه سانتی‌گراد تنظیم کنید (با افزودن HCl یا NaOH). محیط را در لوله‌ها یا بطری‌های مناسب تقسیم کنید. استریل کردن: اتوکلاو در ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد برای ۱۵ دقیقه (فشار ۱۵ psi). پس از استریل، محیط را در یخچال (۴-۸ درجه) نگهداری کنید. عمر مفید: تا ۶ ماه در شرایط خنک و تاریک. کنترل کیفیت: قبل از استفاده، محیط را برای استریلیتی (عدم رشد در انکوباسیون خالی) و عملکرد (رشد کنترل مثبت مانند Enterococcus faecalis ATCC 29212 و عدم رشد کنترل منفی مانند Streptococcus pyogenes ATCC 19615) بررسی کنید. هشدار: از مواد تازه استفاده کنید و از آلودگی جلوگیری شود.

روش کار

– آماده‌سازی نمونه: از کشت شبانه (۱۸-۲۴ ساعت) روی آگار خون یا محیط غیرانتخابی، ۳-۵ کلنی خالص انتخاب کنید. سوسپانسیون باکتریایی با کدورت معادل ۰.۵ مک‌فارلند (حدود ۱.۵ × ۱۰^۸ CFU/mL) تهیه کنید.
– تلقیح: ۱-۲ قطره (یا ۱۰-۵۰ μL) از سوسپانسیون را به لوله حاوی ۵-۱۰ میلی‌لیتر محیط نمک ۶.۵ درصد اضافه کنید. از inoculum سبک استفاده کنید تا نتایج دقیق باشد (inoculum سنگین ممکن است نتایج کاذب مثبت بدهد).
– کنترل: لوله کنترل مثبت (انتروکوکوس) و منفی (استرپتوکوکوس حساس) تهیه کنید.
– انکوباسیون: در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد، به صورت هوازی، برای ۲۴-۴۸ ساعت (گاهی تا ۷۲ ساعت برای رشد کند).
– مشاهده: پس از انکوباسیون، لوله را برای کدورت (تغیرت) یا رسوب بررسی کنید. اگر نشانگر وجود داشته باشد، تغییر رنگ را چک کنید.

تفسیر نتایج تست تحمل نمک در محیط کشت 6.5 درصد

– نتیجه مثبت: رشد (کدورت یا رسوب قابل مشاهده) یا تغییر رنگ از بنفش به زرد (در حضور نشانگر، نشان‌دهنده تولید اسید از گلوکز). این نشان‌دهنده تحمل نمک بالا است، مانند انتروکوکوس یا برخی استرپتوکوکوس گروه B. تفسیر: باکتری مقاوم به فشار اسمزی بالا بوده و احتمالاً پاتوژن روده‌ای است.
– نتیجه منفی: عدم رشد (محیط شفاف باقی می‌ماند) یا عدم تغییر رنگ. این نشان‌دهنده حساسیت به نمک است، مانند استرپتوکوکوس گروه D غیرانتروکوکی یا گروه A/C/G. تفسیر: باکتری نمی‌تواند در شرایط اسمزی بالا زنده بماند.
– نتایج احتمالی: رشد کند ممکن است نیاز به انکوباسیون طولانی‌تر داشته باشد. نتایج کاذب مثبت: inoculum سنگین یا آلودگی. نتایج کاذب منفی: محیط قدیمی یا pH نامناسب. همیشه با تست‌های تکمیلی مانند بایل اسکولین یا تست PYR تأیید کنید. در موارد بالینی، نتیجه مثبت ممکن است به عفونت مقاوم اشاره کند.

نتیجه ی تست بر روی محیط نمک 6.5 درصد: سمت راست منفی و سمت چپ مثبت

سوالات رایج

محیط کشت نمک 6.5 درصد چیست؟

محیط کشت نمک 6.5 درصد یک محیط انتخابی برای شناسایی باکتری‌های تحمل‌کننده نمک بالا مانند انتروکوکوس است که بر پایه BHI یا TSB با افزودن NaCl تهیه می‌شود.

کاربرد اصلی محیط کشت نمک 6.5 درصد چیست؟

برای تمایز انتروکوکوس از استرپتوکوکوس گروه D غیرانتروکوکی و غنی‌سازی باکتری‌های مقاوم مانند MRSA در نمونه‌های بالینی استفاده می‌شود.

چگونه محیط کشت نمک 6.5 درصد تهیه می‌شود؟

با حل کردن 65 گرم NaCl و پایه براث در 1 لیتر آب، تنظیم pH به 7.0، و اتوکلاو در 121 درجه برای 15 دقیقه تهیه می‌گردد.

روش کار با محیط کشت نمک 6.5 درصد چگونه است؟

تلقیح سوسپانسیون باکتری، انکوباسیون در 35-37 درجه برای 24-48 ساعت، و بررسی کدورت یا تغییر رنگ.

تفسیر نتایج مثبت در محیط کشت نمک 6.5 درصد چیست؟

کدورت یا تغییر رنگ به زرد نشان‌دهنده رشد باکتری‌های مقاوم مانند انتروکوکوس است.

تفسیر نتایج منفی در محیط کشت نمک 6.5 درصد چیست؟

عدم کدورت یا عدم تغییر رنگ نشان‌دهنده عدم رشد باکتری‌های حساس است.

کنترل کیفیت محیط نمک 6.5 درصد چگونه انجام می‌شود؟

بررسی استریلیتی و عملکرد با کنترل مثبت (Enterococcus faecalis) و منفی (Streptococcus pyogenes).

آیا محیط نمک 6.5 درصد برای همه باکتری‌ها مناسب است؟

خیر، تنها برای باکتری‌های هالوتولرانت مانند انتروکوکوس و برخی استرپتوکوکوس‌ها کاربرد دارد.

عمر مفید محیط نمک 6.5 درصد چقدر است؟

تا 6 ماه در یخچال و شرایط خنک و تاریک.

چرا از نشانگر برومکرزول بنفش در محیط نمک 6.5 درصد استفاده می‌شود؟

برای تشخیص تولید اسید از گلوکز با تغییر رنگ از بنفش به زرد.

آیا محیط نمک 6.5 درصد در میکروبیولوژی غذایی کاربرد دارد؟

بله، برای شناسایی باکتری‌های هالوتولرانت مانند ویبریو یا استافیلوکوکوس.

تفاوت محیط نمک 6.5 درصد با تست بایل اسکولین چیست؟

نمک برای تحمل نمک، اسکولین برای هیدرولیز اسکولین؛ ترکیب آنها برای تمایز دقیق استفاده می‌شود.