خلاصه روش انجام تست الایزا

روش انجام تست الایزا شامل آماده‌سازی نمونه و معرف‌ها، افزودن استانداردها و کنترل‌ها، انکوباسیون، شست‌وشوی میکروپلیت، افزودن کونژوگه و محلول رنگ‌زا، توقف واکنش و قرائت جذب نوری است. روش دقیق اجرا به طراحی کیت وابسته است؛ در الایزای ساندویچی و غیرمستقیم معمولاً جذب نوری با غلظت رابطه مستقیم دارد، اما در الایزای رقابتی این رابطه اغلب معکوس است.

فهرست مطالب مقاله

تست الایزا چیست و اساس واکنش آن چگونه است؟

تست الایزا یک سنجش ایمنی متصل به آنزیم (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA) است که اتصال اختصاصی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را به یک سیگنال رنگی قابل‌اندازه‌گیری تبدیل می‌کند. این روش برای شناسایی یا اندازه‌گیری آنتی‌ژن‌ها، آنتی‌بادی‌ها، هورمون‌ها، پروتئین‌ها و سایر ترکیبات زیستی به کار می‌رود.

در آزمایش الایزا، یک آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی روی سطح چاهک میکروپلیت تثبیت شده است. پس از افزودن نمونه، ماده هدف در صورت وجود به جزء تثبیت‌شده متصل می‌شود. سپس کونژوگه آنزیمی (Enzyme Conjugate) به کمپلکس ایمنی متصل شده و بعد از شست‌وشوی مواد آزاد، محلول رنگ‌زا به چاهک‌ها افزوده می‌شود.

در بسیاری از کیت‌ها از آنزیم پراکسیداز ترب کوهی (Horseradish Peroxidase; HRP) و سوبسترای تترامتیل بنزیدین (Tetramethylbenzidine; TMB) استفاده می‌شود. رنگ آبی حاصل پس از افزودن محلول متوقف‌کننده معمولاً زرد شده و جذب نوری (Optical Density; OD) اغلب در طول موج ۴۵۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

آیا همه کیت‌های الایزا روش انجام یکسانی دارند؟

خیر؛ روش انجام تست الایزا به طراحی واکنش، نوع پوشش چاهک، شکل کونژوگه و آماده‌سازی نمونه وابسته است. سه الگوی مهم در کیت‌های تشخیصی شامل الایزای ساندویچی، الایزای غیرمستقیم و الایزای رقابتی هستند.

تجهیزات و اجزای مورد نیاز برای انجام تست الایزا

اجرای قابل اعتماد الایزا به تجهیزات کالیبره، نقشه پلیت مشخص و معرف‌های سالم نیاز دارد. دستگاه الایزا ریدر، واشر پلیت و سمپلرها باید مطابق برنامه کنترل کیفیت تجهیزات پایش شوند.

قبل از شروع روش انجام تست الایزا چه مواردی باید بررسی شود؟

پیش از شروع الایزا باید نوع نمونه، رقت، حجم معرف‌ها، زمان و دمای انکوباسیون، برنامه شست‌وشو، مدل منحنی و معیار پذیرش کنترل‌ها از بروشور استخراج شود. آماده‌کردن این اطلاعات پیش از سمپلینگ، اختلاف زمانی میان چاهک‌ها و خطای اجرایی را کاهش می‌دهد.

رساندن مواد و میکروپلیت به دمای مناسب

در بسیاری از کیت‌ها لازم است معرف‌ها و نمونه‌ها پیش از شروع به دمای اتاق برسند. پلیت سرد نباید بلافاصله از کیسه خارج شود؛ زیرا تشکیل رطوبت روی چاهک‌ها می‌تواند بر عملکرد پوشش پلیت اثر بگذارد. استریپ‌های استفاده‌نشده باید همراه نم‌گیر در کیسه بسته نگهداری شوند.

تهیه نقشه پلیت و کنترل زمان سمپلینگ

محل استانداردها، کنترل‌ها و نمونه‌ها از قبل ثبت شود. اگر روش انجام دوپلیکیت را توصیه کرده است، هر استاندارد یا نمونه در دو چاهک قرار گرفته و میانگین OD برای محاسبه استفاده می‌شود. حجم ران باید با توان عملی اپراتور متناسب باشد تا افزودن نمونه‌ها بیش از حد طول نکشد.

آماده‌سازی محلول شست‌وشو

محلول شست‌وشوی غلیظ ممکن است با نسبت یک به ده یا یک به بیست رقیق شود. حجم کنسانتره بر اساس تعداد چاهک‌ها محاسبه شود. اگر کریستال مشاهده شد، محلول مطابق دستور سازنده به‌آرامی گرم و مخلوط شود تا کریستال‌ها کاملاً حل شوند.

نمونه بیمار برای تست الایزا چگونه آماده می‌شود؟

آماده‌سازی نمونه در الایزا ممکن است شامل استفاده مستقیم، رقیق‌سازی اولیه یا استخراج آنالیت باشد. نوع سرم یا پلاسما، ضدانعقاد قابل قبول، پایداری و معیار رد نمونه باید دقیقاً از بروشور همان کیت استخراج شود.

استفاده مستقیم از نمونه

در بعضی روش‌های ساندویچی، استاندارد، کنترل و نمونه بدون رقیق‌سازی اولیه وارد چاهک می‌شوند. نمونه باید از نوع تأییدشده، فاقد رسوب قابل توجه و بدون نشانه آلودگی میکروبی باشد.

رقیق‌سازی اولیه نمونه

در روش‌های غیرمستقیم ممکن است نمونه با رقیق‌کننده اختصاصی و نسبت تعیین‌شده رقیق شود. استانداردهای آماده مصرف نباید همراه نمونه رقیق شوند، مگر اینکه دستورالعمل کیت چنین خواسته باشد. خطای کوچک در رقت‌سازی می‌تواند به خطای بزرگ در نتیجه نهایی منجر شود.

استخراج آنالیت در روش رقابتی

در برخی روش‌های رقابتی، آنالیت به پروتئین حامل متصل است و باید با بافر استخراج (Extraction Buffer) و بافر سنجش (Assay Buffer) آزاد شود. نمونه و بافر واکنش باید به‌طور کامل مخلوط شوند؛ در غیر این صورت بازیابی آنالیت کاهش پیدا می‌کند.

شرایط رد یا بررسی مجدد نمونه

• نوع نمونه یا ضدانعقاد با بروشور سازگار نیست.
• نمونه دچار آلودگی میکروبی یا نشتی شده است.
• نمونه خارج از زمان و دمای پایداری نگهداری شده است.
• چرخه‌های انجماد و ذوب بیش از حد انجام شده است.
• همولیز، لیپمی یا ایکتری بر اساس ادعای کیت تداخل قابل توجه ایجاد می‌کند.

روش انجام الایزای ساندویچی با رابطه مستقیم

در الایزای ساندویچی، آنالیت میان دو جزء شناسایی‌کننده قرار می‌گیرد و افزایش غلظت معمولاً باعث افزایش جذب نوری می‌شود. ترتیب رایج شامل انکوباسیون نمونه، شست‌وشو، افزودن کونژوگه، شست‌وشوی دوم، رنگ‌زایی و قرائت است.

1. تعداد چاهک‌های مورد نیاز انتخاب شود.
2. حجم تعیین‌شده از استانداردها، کنترل و نمونه‌ها اضافه شود.
3. پلیت پوشانده و در زمان و دمای مشخص انکوبه شود.
4. محتویات تخلیه و چاهک‌ها طبق برنامه کیت شسته شوند.
5. حجم مشخص کونژوگه آنزیمی افزوده شود.
6. انکوباسیون دوم انجام شود.
7. شست‌وشوی دوم به‌طور کامل اجرا شود.
8. محلول رنگ‌زا اضافه و پلیت در شرایط تعیین‌شده انکوبه شود.
9. محلول متوقف‌کننده با همان ترتیب افزودن رنگ‌زا اضافه شود.
10. جذب نوری با طول موج اصلی و مرجع تعیین‌شده خوانده شود.

روش انجام الایزای غیرمستقیم همراه با رقیق‌سازی نمونه

در الایزای غیرمستقیم، آنتی‌بادی موجود در نمونه به آنتی‌ژن تثبیت‌شده متصل و سپس با آنتی‌بادی ثانویه نشاندار آشکار می‌شود. صحت رقت نمونه و یکسان‌بودن زمان انکوباسیون از عوامل اصلی دقت این روش هستند.

1. نمونه با رقیق‌کننده اختصاصی و نسبت بروشور رقیق شود.
2. استانداردهای آماده مصرف و نمونه‌های رقیق‌شده به چاهک‌ها افزوده شوند.
3. پلیت پوشانده و در دمای تعیین‌شده انکوبه شود.
4. محتویات تخلیه و چاهک‌ها شسته شوند.
5. کونژوگه حاوی آنتی‌بادی ثانویه افزوده شود.
6. انکوباسیون دوم و سپس شست‌وشوی دوم انجام شود.
7. محلول رنگ‌زا اضافه و پلیت در تاریکی نگهداری شود.
8. با محلول توقف، واکنش پایان یابد.
9. OD چاهک‌ها در طول موج تعیین‌شده خوانده شود.

روش انجام الایزای رقابتی همراه با مرحله استخراج

در الایزای رقابتی، آنالیت نمونه با جزء نشاندار برای جایگاه اتصال رقابت می‌کند و افزایش غلظت معمولاً موجب کاهش OD می‌شود. بعضی کیت‌ها پیش از واکنش ایمنی به آزادسازی آنالیت از پروتئین حامل نیاز دارند.

1. استاندارد، کنترل و نمونه به چاهک‌ها اضافه شوند.
2. بافر واکنش تازه تهیه‌شده افزوده شود.
3. پلیت به‌آرامی شیک شود تا محتویات یکنواخت شوند.
4. پلیت پوشانده و انکوباسیون اول انجام شود.
5. چاهک‌ها طبق دستور اختصاصی شسته شوند.
6. کونژوگه رقیق‌شده و تازه‌آماده‌شده افزوده شود.
7. انکوباسیون دوم و شست‌وشوی دوم اجرا شود.
8. رنگ‌زا اضافه و واکنش در تاریکی انجام شود.
9. محلول توقف اضافه شود.
10. پلیت قرائت و منحنی نزولی تفسیر شود.

شست‌وشوی صحیح پلیت الایزا چگونه انجام می‌شود؟

شست‌وشوی صحیح باید مواد آزاد را حذف کند، بدون آنکه برنامه اختصاصی کیت تغییر داده شود. شست‌وشوی ناکافی زمینه را بالا می‌برد و برنامه نامناسب واشر ممکن است سیگنال اختصاصی را کاهش دهد.

مراحل شست‌وشوی دستی میکروپلیت

1. حجم تعیین‌شده بافر به تمام چاهک‌ها اضافه شود.
2. از سرریز و انتقال مایع بین چاهک‌ها جلوگیری شود.
3. پلیت وارونه و محتویات آن تخلیه شود.
4. شست‌وشو به تعداد تعیین‌شده تکرار شود.
5. بعد از آخرین شست‌وشو، پلیت وارونه روی کاغذ جاذب تمیز به‌آرامی ضربه زده شود.
6. بدون خشک‌شدن چاهک‌ها، مرحله بعد آغاز شود.

آیا زمان خیساندن همیشه لازم است؟

خیر. بعضی روش‌ها زمان خیساندن (Soaking Time) تعیین می‌کنند، اما برخی پروتکل‌های رقابتی آن را ممنوع می‌دانند. برنامه واشر باید برای هر آزمون جداگانه تعریف و تأیید شود.

کنترل زمان، افزودن TMB و توقف واکنش الایزا

فاصله زمانی میان اولین و آخرین چاهک باید تا حد ممکن کوتاه و ثابت باشد. ترتیب افزودن محلول توقف باید همان ترتیب افزودن TMB باشد تا مدت واکنش رنگی چاهک‌ها یکسان بماند.

• تمام معرف‌ها پیش از شروع در دسترس اپراتور باشند.
• برای افزودن معرف‌های مشترک از سمپلر چندکاناله استفاده شود.
• TMB آلوده یا تغییررنگ‌داده استفاده نشود.
• انکوباسیون رنگ‌زا در نور و دمای توصیه‌شده انجام شود.
• از ایجاد حباب هنگام افزودن محلول توقف جلوگیری شود.
• پلیت در بازه زمانی تعیین‌شده پس از توقف قرائت شود.

پلیت الایزا چگونه قرائت و منحنی استاندارد چگونه رسم می‌شود؟

پس از توقف واکنش، پلیت باید در طول موج تعیین‌شده و در مهلت مجاز بروشور خوانده شود. برای بسیاری از سیستم‌های HRP-TMB طول موج اصلی ۴۵۰ نانومتر و طول موج مرجع ۶۲۰ یا ۶۳۰ نانومتر است، اما انتخاب نهایی با دستورالعمل کیت است.

کنترل پیش از قرائت

• قطره، آلودگی و اثر انگشت از زیر پلیت پاک شود.
• حباب‌های چاهک‌ها بدون آلودگی متقاطع حذف شوند.
• جهت پلیت و نقشه چاهک‌ها در نرم‌افزار بررسی شود.
• فیلتر اصلی و مرجع صحیح انتخاب شوند.

انتخاب مدل منحنی استاندارد

غلظت استانداردها معمولاً روی محور افقی و OD روی محور عمودی قرار می‌گیرد. مدل منحنی ممکن است نقطه‌به‌نقطه (Point-to-Point)، خطی یا لجستیک چهارپارامتری و پنج‌پارامتری باشد. مدل مناسب باید مطابق اعتبارسنجی و بروشور کیت انتخاب شود؛ استفاده خودکار از 4PL یا 5PL برای همه کیت‌ها صحیح نیست.

تفاوت منحنی مستقیم و معکوس

با نتیجه خارج از محدوده اندازه‌گیری الایزا چه کنیم؟

نتیجه خارج از محدوده منحنی نباید با برون‌یابی نامعتبر به‌صورت عدد قطعی گزارش شود. بسته به دستورالعمل کیت، نمونه با رقت مناسب تکرار می‌شود یا به‌صورت بیشتر یا کمتر از حد اندازه‌گیری گزارش خواهد شد.

• اگر رقیق‌سازی مجاز است، نتیجه به‌دست‌آمده در ضریب رقت ضرب شود.
• اگر کیت رقیق‌سازی نمونه را تأیید نکرده است، روش خودسرانه تغییر نکند.
• در روش رقابتی، OD پایین می‌تواند نشان‌دهنده غلظت بالا باشد.
• نتیجه ناسازگار با سایر یافته‌ها از نظر خطای نمونه، QC، رقت و اثر هوک بررسی شود.

کنترل کیفیت تست الایزا و معیار معتبر بودن ران

نتایج فقط زمانی قابل گزارش‌اند که کنترل‌ها، استانداردها و شکل منحنی تمام معیارهای پذیرش همان کیت را داشته باشند. منطقی‌بودن نتیجه بیمار نمی‌تواند ران نامعتبر را قابل گزارش کند.

• OD استاندارد صفر یا بلانک در محدوده مجاز باشد.
• استانداردهای متوالی روند مستقیم یا معکوس مورد انتظار را نشان دهند.
• کنترل‌های مثبت، منفی یا سرمی در محدوده تعیین‌شده باشند.
• اختلاف دوپلیکیت‌ها از حد مصوب آزمایشگاه بیشتر نباشد.
• پیام خطای ریدر یا واشر وجود نداشته باشد.
• منحنی استاندارد جدید برای همان ران رسم شده باشد.

چه زمانی آزمایش الایزا باید تکرار شود؟

ران نامعتبر، اختلاف غیرمجاز تکرارها، نتیجه خارج از محدوده، خطای پیپتینگ، آلودگی چاهک، خرابی واشر، منحنی نامنظم و نتیجه ناسازگار با انتظار تحلیلی از دلایل تکرار هستند. تکرار باید پس از شناسایی و اصلاح علت انجام شود؛ تکرار ساده بدون اقدام اصلاحی احتمال بازتولید همان خطا را بالا می‌برد.

خطاهای رایج و عیب‌یابی روش انجام تست الایزا

جدول زیر ارتباط میان الگوی خطا، علت‌های محتمل و اقدام اصلاحی را نشان می‌دهد. تشخیص علت باید بر اساس توزیع خطا در پلیت و سوابق همان ران انجام شود.

محدودیت‌ها و تداخل‌های مهم در آزمایش الایزا

نتیجه الایزا وابسته به روش، معرف، ماتریکس نمونه و اختصاصیت آنتی‌بادی‌ها است و به‌تنهایی معادل تشخیص بالینی نیست. واکنش متقاطع، آنتی‌بادی‌های هتروفیل، فاکتور روماتوئید، همولیز، لیپمی، ایکتری و نگهداری نامناسب ممکن است در برخی کیت‌ها تداخل ایجاد کنند.

وجود یا شدت هر تداخل باید از داده‌های عملکردی همان کیت بررسی شود. نمی‌توان همه نمونه‌های همولیز یا لیپمیک را بدون توجه به ادعای سازنده رد کرد، همان‌طور که نمی‌توان اثر آن‌ها را در همه روش‌ها نادیده گرفت.

الگوریتم عملی بررسی و گزارش نتیجه الایزا

مسیر تصمیم‌گیری باید از بررسی نمونه و QC آغاز شود، نه از تفسیر عدد بیمار. الگوریتم زیر یک مسیر عمومی است و باید با SOP هر آزمون تطبیق داده شود.

نمونه کامنت فارسی برای نتیجه خارج از محدوده

نمونه کامنت انگلیسی

روش‌های ایمنی مرتبط و تفاوت آن‌ها با الایزا

الایزا یک روش آزمایشگاهی مبتنی بر اتصال اختصاصی و سیگنال آنزیمی است. روش‌های ایمنی سلولی، آزمون‌های پوستی و آزمایش‌های آزادسازی اینترفرون مکانیسم و تفسیر متفاوتی دارند و جایگزین مستقیم یکدیگر نیستند.

ایمنی زیستی و شیمیایی هنگام انجام الایزا

تمام نمونه‌های انسانی باید بالقوه عفونی در نظر گرفته شوند و اقدامات حفاظتی بر اساس ارزیابی ریسک آزمایشگاه انتخاب شوند. محلول توقف نیز معمولاً اسیدی است و تماس آن با پوست و چشم باید پیشگیری شود.

• از روپوش، دستکش و محافظ چشم متناسب با ارزیابی ریسک استفاده شود.
• از پیپت‌کردن دهانی و ایجاد آئروسل جلوگیری شود.
• برگه اطلاعات ایمنی مواد مطالعه شود.
• پسماندهای بیولوژیک و شیمیایی جداگانه دفع شوند.
• سطوح کار و تجهیزات طبق SOP ضدعفونی شوند.

چک‌لیست نهایی کارشناس برای روش انجام تست الایزا به صورت صحیح

• بروشور کیت و نسخه SOP بررسی شد.
• نمونه، معرف‌ها و استریپ‌های پلیت شرایط قابل قبول دارند.
• نقشه پلیت و ترتیب سمپلینگ ثبت شده است.
• رقیق‌سازی نمونه، استاندارد و کونژوگه صحیح است.
• برنامه شست‌وشو و زمان خیساندن مطابق کیت تنظیم شده است.
• ترتیب افزودن TMB و Stop Solution یکسان است.
• طول موج اصلی و مرجع درست انتخاب شده‌اند.
• کنترل‌ها و منحنی معیار پذیرش را دارند.
• نتیجه خارج از محدوده بدون برون‌یابی گزارش نشده است.
• واحد، ضریب رقت و کامنت لازم در گزارش ثبت شده‌اند.

مطالعه تکمیلی روش‌های سرولوژی در هموستیکا

مقالات زیر مستقیماً پروتکل الایزا نیستند، اما برای تکمیل مهارت کارشناسان در اجرای آزمایش‌های سرولوژی، کنترل کیفی و تفسیر واکنش‌های آنتی‌ژن و آنتی‌بادی مفید هستند.

جمع‌بندی روش انجام تست الایزا

روش انجام تست الایزا یک دستور ثابت برای تمام کیت‌ها نیست. نمونه ممکن است مستقیم وارد چاهک شود، پیش از آزمایش رقیق شود یا برای آزادسازی آنالیت به مرحله استخراج نیاز داشته باشد. در روش‌های ساندویچی و غیرمستقیم معمولاً غلظت و OD رابطه مستقیم دارند، در حالی که این رابطه در الایزای رقابتی اغلب معکوس است.

دقت پیپتینگ، کنترل زمان انکوباسیون، شست‌وشوی یکنواخت، آماده‌سازی صحیح کونژوگه، انتخاب مدل منحنی و تأیید کنترل‌ها تعیین‌کننده اعتبار نتیجه هستند. کارشناس آزمایشگاه باید از تعمیم تنظیمات یک کیت به کیت دیگر خودداری کند و نتیجه را تنها پس از معتبرشدن ران گزارش دهد.

سؤالات رایج درباره روش انجام تست الایزا

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر درباره الایزا

منابع زیر برای مرور اصول روش، شست‌وشو، تحلیل منحنی، عیب‌یابی و ایمنی زیستی انتخاب شده‌اند.