تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه فرایندی علمی برای مشخص کردن حدود مورد انتظار نتایج یک آنالیت در جمعیت مرجع تعریف‌شده است. این فرایند شامل انتخاب افراد مرجع، کنترل شرایط پیش‌تحلیلی و تحلیلی، بررسی داده‌های پرت، انتخاب روش آماری و تعیین یا تأیید حدود مرجع است. برای تعیین مستقیم محدوده معمولاً حداقل ۱۲۰ فرد در هر گروه و برای تأیید یک محدوده موجود حداقل ۲۰ فرد مرجع بررسی می‌شوند.

برای عضویت در کانال آموزشی هموستیکا در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/Heamostica

🚀 عضویت در کانال تلگرام

فهرست مطالب مقاله تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

مقدمه تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

نتیجه یک آزمایش زمانی ارزش بالینی پیدا می‌کند که بتوان آن را با یک معیار مناسب مقایسه کرد. در بیشتر آزمایش‌های کمی، این معیار به شکل محدوده مرجع یا فاصله مرجع در کنار نتیجه بیمار گزارش می‌شود. پزشک با مقایسه نتیجه بیمار با این محدوده می‌تواند احتمال وجود یک وضعیت غیرطبیعی را بررسی کند؛ بااین‌حال، قرار گرفتن نتیجه خارج از محدوده مرجع لزوماً به معنای بیماری نیست و قرار گرفتن داخل آن نیز بیماری را به‌طور قطعی رد نمی‌کند.

محدوده مرجع یکی از مهم‌ترین ابزارهای تفسیر نتایج آزمایشگاهی است، اما تنها زمانی معتبر خواهد بود که جمعیت مورد مطالعه، روش اندازه‌گیری، شرایط نمونه‌گیری و روش آماری مورد استفاده با شرایط آزمایشگاه و جمعیت بیماران آن تناسب داشته باشد. استاندارد CLSI EP28-A3c مهم‌ترین راهنمای بین‌المللی برای تعریف، تعیین، انتقال و تأیید محدوده‌های مرجع آزمایش‌های کمی محسوب می‌شود. این استاندارد همچنان در دسترس است و CLSI در سال ۲۰۲۲ نیز یک راهنمای اجرایی جداگانه برای تأیید محدوده‌های مرجع منتشر کرده است. (clsi.org)

محدوده مرجع چیست؟ تعریف فاصله مرجع در آزمایشگاه

محدوده مرجع یا فاصله مرجع (Reference Interval) فاصله‌ای میان دو حد مرجع است که درصد مشخصی از نتایج افراد یک جمعیت مرجع تعریف‌شده را دربر می‌گیرد.

در اغلب آزمایش‌ها، محدوده مرجع شامل ۹۵ درصد مرکزی نتایج جمعیت مرجع است:

• ۲٫۵ درصد افراد مرجع ممکن است نتیجه‌ای پایین‌تر از حد پایین داشته باشند.
• ۲٫۵ درصد نیز ممکن است نتیجه‌ای بالاتر از حد بالا داشته باشند.
• در مجموع حدود ۵ درصد از افراد مرجع، با وجود نداشتن شرایط حذف‌کننده مطالعه، ممکن است خارج از محدوده مرجع قرار گیرند.

مفاهیم اصلی در تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

برای درک روش تعیین محدوده مرجع باید میان چند اصطلاح تفاوت قائل شد.

فرد مرجع (Reference Individual)

فرد مرجع (Reference Individual) فردی است که بر اساس معیارهای ورود و خروج از پیش تعیین‌شده برای شرکت در مطالعه انتخاب شده است. فرد مرجع الزاماً فردی نیست که از هر نظر کاملاً سالم باشد؛ بلکه باید شرایطی را نداشته باشد که به‌طور معنادار بر آنالیت مورد بررسی اثر بگذارد.

جمعیت مرجع (Reference Population)

مجموعه تمام افرادی که معیارهای تعریف‌شده مطالعه را دارند، جمعیت مرجع (Reference Population) نامیده می‌شود.

گروه نمونه مرجع (Reference Sample Group)

افرادی که عملاً از جمعیت مرجع انتخاب شده و از آن‌ها نمونه‌گیری می‌شود، گروه نمونه مرجع (Reference Sample Group) را تشکیل می‌دهند.

مقادیر مرجع (Reference Values)

نتایج به‌دست‌آمده از اندازه‌گیری آنالیت در افراد مرجع، مقادیر مرجع (Reference Values) نامیده می‌شوند.

حدود مرجع پایین و بالا (Reference Limits)

مقادیر مشخص‌کننده ابتدا و انتهای محدوده مرجع، حدود مرجع پایین و بالا (Lower and Upper Reference Limits) هستند.

تفاوت محدوده مرجع با حد تصمیم‌گیری بالینی

یکی از خطاهای رایج در آزمایشگاه، یکسان دانستن محدوده مرجع با حد تصمیم‌گیری بالینی است.

حد تصمیم‌گیری بالینی (Clinical Decision Limit) مقداری است که بر اساس مطالعات پیامدهای بالینی، خطر بیماری، حساسیت و ویژگی تشخیصی یا توافق متخصصان تعیین می‌شود. این حد الزاماً از توزیع نتایج افراد سالم به دست نمی‌آید.

برای مثال، در برخی آزمایش‌ها مانند کلسترول یا هموگلوبین A1c، حدود مورد استفاده بیشتر بر اساس تصمیم‌گیری و راهنماهای بالینی تعیین می‌شوند. در چنین مواردی، تعیین یک محدوده مرجع محلی نباید جایگزین حدود تصمیم‌گیری مورد توافق شود. وظیفه اصلی آزمایشگاه در این شرایط، اطمینان از صحت، استانداردسازی و قابلیت ردیابی نتایج است. (CLSI EP28 Sample)

محدوده مرجع همچنین با مفاهیم زیر تفاوت دارد:

• محدوده اندازه‌گیری تحلیلی دستگاه
• محدوده قابل گزارش
• محدوده درمانی دارو
• حد بحرانی
• حد تشخیص
• حد کمی‌سازی
• مقدار هدف کنترل کیفی

هر یک از این مفاهیم کاربرد متفاوتی دارد و نباید به‌جای محدوده مرجع گزارش شود.

مطالعه مرتبط در هموستیکا

عدم قطعیت اندازه‌گیری یکی از عوامل مهم در تفسیر نتایج نزدیک به حدود مرجع و حدود تصمیم‌گیری بالینی است. در مقاله زیر با مفهوم، محاسبه و کاربرد عدم قطعیت در آزمایشگاه آشنا شوید.

عدم قطعیت در آزمایشگاه تشخیص پزشکی؛ راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

چرا نمی‌توان محدوده مرجع شرکت سازنده را مستقیماً استفاده کرد؟

محدوده مرجع ارائه‌شده توسط شرکت سازنده می‌تواند نقطه شروع مناسبی باشد، اما پذیرش آن بدون بررسی علمی ممکن است موجب تفسیر نادرست نتایج شود. محدوده مرجع تحت تأثیر عوامل متعددی قرار دارد:

• روش و اصل اندازه‌گیری
• کالیبراسیون و قابلیت ردیابی
• نوع دستگاه و معرف
• نوع نمونه، مانند سرم یا پلاسما
• نوع ضدانعقاد
• سن و جنس
• وضعیت بارداری
• زمان نمونه‌گیری
• رژیم غذایی و ناشتا بودن
• فعالیت بدنی
• وضعیت بدنی هنگام نمونه‌گیری
• تفاوت‌های جمعیتی و جغرافیایی
• مصرف دارو، سیگار یا الکل
• روش آماری مورد استفاده

روش‌های تهیه و تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

به‌طور کلی سه رویکرد برای استفاده از محدوده مرجع وجود دارد:

تعیین مستقیم محدوده مرجع (Direct Method)

در روش مستقیم (Direct Method)، افراد مرجع بر اساس معیارهای مشخص انتخاب می‌شوند، از آن‌ها نمونه‌گیری انجام می‌شود و محدوده مرجع با استفاده از نتایج همان افراد محاسبه می‌شود.

این روش از نظر طراحی علمی، روش اصلی تعیین محدوده مرجع است؛ اما اجرای آن به زمان، هزینه، نیروی انسانی، دسترسی به افراد مناسب و حجم نمونه کافی نیاز دارد.

انتقال و تأیید محدوده مرجع

در این روش، آزمایشگاه یک محدوده مرجع را از شرکت سازنده، مطالعه معتبر، آزمایشگاه دیگر یا مطالعه چندمرکزی دریافت می‌کند و سپس مناسب بودن آن را برای روش و جمعیت خود بررسی و تأیید می‌کند.

برای بسیاری از آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی، این روش عملی‌ترین انتخاب است.

تعیین غیرمستقیم محدوده مرجع (Indirect Method)

در روش غیرمستقیم (Indirect Method)، از نتایج ذخیره‌شده بیماران در سیستم اطلاعات آزمایشگاهی استفاده می‌شود. سپس با روش‌های آماری تلاش می‌شود بخش غالب مربوط به افراد بدون اختلال مؤثر از داده‌های بیماران جدا شود.

این روش امکان استفاده از هزاران یا میلیون‌ها نتیجه را فراهم می‌کند، اما خطر ورود نتایج بیماران، نتایج تکراری، گروه‌های انتخاب‌شده و داده‌های نامتوازن به محاسبات وجود دارد. بنابراین تعیین غیرمستقیم محدوده مرجع تنها زمانی معتبر است که پاک‌سازی داده‌ها، کنترل کیفیت، بررسی پایداری روش و تحلیل آماری به‌درستی انجام شده باشد. (Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)

پیشنهاد مطالعه مرتبط

اعتبار محدوده مرجع به عملکرد پایدار روش اندازه‌گیری وابسته است. برای آشنایی با شاخص‌های خطا، صحت، دقت و کنترل عملکرد روش‌های آزمایشگاهی، مقاله مفاهیم پایه کنترل کیفیت را مطالعه کنید.

مفاهیم پایه کنترل کیفی آزمایشگاه؛ از خطا و دقت تا نمودار لوی‌جنینگ و قوانین وستگارد

مراحل تعیین مستقیم محدوده مرجع در آزمایشگاه

۱. تعریف هدف مطالعه تعیین فاصله مرجع

پیش از نمونه‌گیری باید مشخص شود:

• کدام آنالیت بررسی می‌شود؟
• نوع نمونه چیست؟
• روش و دستگاه اندازه‌گیری کدام است؟
• محدوده مرجع برای چه جمعیتی استفاده خواهد شد؟
• آیا محدوده دوطرفه یا یک‌طرفه مورد نیاز است؟
• آیا محدوده جداگانه برای سن، جنس یا شرایط خاص لازم است؟
• آیا برای این آزمایش حد تصمیم‌گیری بالینی معتبر وجود دارد؟

هدف مطالعه باید پیش از مشاهده داده‌ها تعیین شود. تغییر هدف یا گروه‌بندی داده‌ها پس از مشاهده نتایج می‌تواند احتمال ایجاد یک محدوده مرجع سوگیرانه را افزایش دهد.

۲. تعریف جمعیت مرجع

جمعیت مرجع باید نماینده افرادی باشد که محدوده مرجع برای آن‌ها استفاده خواهد شد. برای مثال، اگر آزمایشگاه عمدتاً به بزرگسالان یک منطقه جغرافیایی مشخص خدمت می‌کند، انتخاب گروهی کاملاً متفاوت از نظر سن، سبک زندگی یا شرایط جمعیتی ممکن است مناسب نباشد.

تعریف جمعیت مرجع باید شامل مشخصات زیر باشد:

• محدوده سنی
• جنس
• محل زندگی یا جمعیت هدف
• وضعیت بارداری
• شرایط فیزیولوژیک مرتبط
• معیارهای ورود
• معیارهای خروج
• شرایط نمونه‌گیری

۳. تعیین معیارهای ورود و خروج افراد مرجع

معیارهای ورود و خروج باید متناسب با آنالیت مورد مطالعه باشند. استفاده از یک پرسش‌نامه ثابت برای تمام آزمایش‌ها منطقی نیست.

معیارهای خروج احتمالی می‌توانند شامل موارد زیر باشند:

• بیماری حاد یا مزمن مؤثر بر آنالیت
• مصرف داروهای مؤثر
• جراحی یا بستری اخیر
• بارداری، مگر آنکه هدف مطالعه تعیین محدوده بارداری باشد
• ورزش شدید پیش از نمونه‌گیری
• مصرف الکل یا سیگار بر اساس هدف مطالعه
• رژیم غذایی خاص
• چاقی یا کاهش وزن شدید
• خون‌ریزی، اهدای خون یا تزریق خون اخیر
• نتایج غیرعادی در آزمایش‌های غربالگری مرتبط

برای مثال، معیارهای انتخاب فرد مرجع برای تعیین TSH با معیارهای مورد استفاده برای هموگلوبین، ALT، فریتین یا D-dimer یکسان نیست.

۴. انتخاب افراد مرجع

انتخاب پیش از نمونه‌گیری

در روش پیشینی (A Priori)، افراد بر اساس پرسش‌نامه، معاینه و معیارهای مطالعه انتخاب می‌شوند و سپس از آن‌ها نمونه‌گیری می‌شود.

انتخاب پس از نمونه‌گیری

در روش پسینی (A Posteriori)، ابتدا نمونه‌گیری انجام می‌شود و سپس بر اساس اطلاعات بالینی یا نتایج آزمایش‌ها، افراد نامناسب حذف می‌شوند.

روش پیشینی از نظر کنترل طراحی مطالعه مناسب‌تر است، اما در بعضی مطالعات ترکیبی از هر دو روش استفاده می‌شود.

۵. تعیین نیاز به تفکیک گروه‌ها یا پارتیشن‌بندی

مقادیر بسیاری از آنالیت‌ها با سن، جنس یا وضعیت فیزیولوژیک تغییر می‌کنند. بنابراین ممکن است نیاز باشد محدوده مرجع به گروه‌های جداگانه تقسیم شود. این فرایند پارتیشن‌بندی (Partitioning) نام دارد.

عوامل متداول برای پارتیشن‌بندی عبارت‌اند از:

• جنس
• سن
• دوران کودکی و بلوغ
• بارداری و سن حاملگی
• یائسگی
• نژاد یا زمینه ژنتیکی، در صورت وجود شواهد معتبر
• شرایط جغرافیایی خاص
• نوع نمونه

تصمیم‌گیری درباره تفکیک گروه‌ها نباید صرفاً بر اساس معناداری آماری باشد. تفاوت مشاهده‌شده باید از نظر بالینی نیز اهمیت داشته باشد. روش‌هایی مانند معیار Harris–Boyd می‌توانند برای بررسی آماری نیاز به پارتیشن‌بندی استفاده شوند، اما قضاوت بالینی و زیستی همچنان ضروری است. (PMC)

۶. تعیین حجم نمونه برای محدوده مرجع

استاندارد CLSI توصیه می‌کند برای تعیین محدوده مرجع به روش ناپارامتریک، حداقل ۱۲۰ فرد مرجع برای هر پارتیشن مستقل وارد مطالعه شوند.

عدد ۱۲۰ یک عدد جادویی نیست، اما امکان برآورد ناپارامتریک صدک‌های ۲٫۵ و ۹۷٫۵ و محاسبه فاصله اطمینان قابل قبول برای حدود مرجع را فراهم می‌کند. حجم نمونه بیشتر باعث کاهش عدم قطعیت حدود مرجع می‌شود.

در صورت استفاده از تعداد کمتر، می‌توان از روش‌های پارامتریک یا مقاوم (Robust) استفاده کرد؛ بااین‌حال، استفاده از نمونه کمتر باید از نظر آماری توجیه شود و فاصله اطمینان حدود مرجع نیز گزارش شود. استفاده از ۲۰ یا ۳۰ فرد برای «تعیین» یک محدوده جدید معمولاً قابل دفاع نیست؛ این تعداد بیشتر برای تأیید یک محدوده موجود کاربرد دارد.

۷. کنترل عوامل پیش‌تحلیلی در تعیین محدوده مرجع

حتی بهترین روش آماری نیز نمی‌تواند خطاهای ناشی از نمونه‌گیری نامناسب را اصلاح کند. شرایط پیش‌تحلیلی مطالعه باید تا حد امکان مشابه شرایط نمونه‌های روتین آزمایشگاه باشد.

موارد زیر باید استاندارد شوند:

• ناشتا بودن یا نبودن
• ساعت نمونه‌گیری
• وضعیت نشسته یا خوابیده
• مدت استراحت پیش از نمونه‌گیری
• زمان بستن تورنیکه
• نوع لوله و ضدانعقاد
• ترتیب خون‌گیری
• زمان جداسازی سرم یا پلاسما
• دمای حمل
• مدت نگهداری
• تعداد دفعات انجماد و ذوب
• شرایط سانتریفیوژ
• معیارهای رد نمونه همولیز، لیپمیک یا ایکتریک

برای آنالیت‌هایی با ریتم شبانه‌روزی، مانند برخی هورمون‌ها، ساعت نمونه‌گیری باید دقیقاً تعریف شود.

۸. کنترل شرایط تحلیلی و کیفیت روش اندازه‌گیری

تمام نمونه‌ها باید با همان سیستم اندازه‌گیری مورد استفاده برای نمونه‌های بیماران آزمایش شوند. پیش از انجام مطالعه باید از وضعیت مناسب موارد زیر اطمینان حاصل شود:

• کالیبراسیون
• کنترل کیفیت داخلی
• صحت و دقت روش
• پایداری معرف
• نگهداری دستگاه
• قابلیت ردیابی اندازه‌گیری
• یکنواختی واحد گزارش
• نبود تغییر مهم در لات معرف یا کالیبراتور

بهتر است نمونه‌ها در چند روز و تحت شرایط نماینده عملکرد واقعی آزمایشگاه اندازه‌گیری شوند، مگر آنکه طراحی مطالعه دلیل مشخصی برای انجام تمام آزمایش‌ها در یک ران داشته باشد.

کنترل عملکرد روش پیش از تعیین محدوده مرجع

برای آشنایی کامل با کنترل کیفیت داخلی، کنترل کیفیت خارجی و ارزیابی عملکرد روش، مقالات زیر را مطالعه کنید.

کنترل کیفی آزمایشگاه تشخیص پزشکی
کنترل کیفی خارجی در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی؛ راهنمای جامع EQA

تحلیل آماری داده‌های تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

بررسی اولیه داده‌های مرجع

پیش از محاسبه حدود مرجع باید داده‌ها از نظر موارد زیر بررسی شوند:

• خطای ورود داده
• واحدهای ناهماهنگ
• نتایج تکراری
• داده‌های گمشده
• شکل توزیع
• چولگی
• وجود چند جمعیت متفاوت
• داده‌های پرت
• نیاز به پارتیشن‌بندی

استفاده از هیستوگرام، نمودار جعبه‌ای، نمودار Q–Q و نمودار پراکندگی نسبت به سن می‌تواند در شناخت ساختار داده‌ها کمک‌کننده باشد.

روش ناپارامتریک تعیین محدوده مرجع

روش ناپارامتریک، روش توصیه‌شده برای مجموعه داده‌های دارای حداقل ۱۲۰ فرد در هر پارتیشن است. این روش به فرض توزیع نرمال وابسته نیست.

داده‌ها از کوچک به بزرگ مرتب می‌شوند و صدک‌های ۲٫۵ و ۹۷٫۵ به‌عنوان حدود مرجع انتخاب می‌شوند.

رتبه نظری حدود با روابط زیر محاسبه می‌شود:

برای ۱۲۰ نتیجه:

در عمل نرم‌افزار آماری با استفاده از روش تعریف‌شده، بین رتبه‌های مجاور درون‌یابی انجام می‌دهد. نوع الگوریتم محاسبه صدک باید در گزارش مطالعه ذکر شود؛ زیرا نرم‌افزارهای مختلف ممکن است از تعاریف متفاوتی برای صدک استفاده کنند.

روش پارامتریک تعیین حدود مرجع

اگر توزیع داده‌ها تقریباً نرمال باشد، محدوده مرجع ۹۵ درصد را می‌توان به‌صورت زیر برآورد کرد:

در بعضی موارد می‌توان از تبدیل لگاریتمی یا تبدیل Box–Cox استفاده کرد و پس از محاسبه حدود، مقادیر را به مقیاس اصلی برگرداند.

روش مقاوم (Robust Method)

روش مقاوم یا Robust برای داده‌هایی با حجم نمونه کمتر یا توزیع غیرنرمال طراحی شده است. این روش حساسیت کمتری به مقادیر انتهایی دارد، اما باید با نرم‌افزار معتبر و همراه با فاصله اطمینان مناسب اجرا شود.

استفاده از روش Robust نباید بهانه‌ای برای استفاده از حجم نمونه بسیار کم یا انتخاب نامناسب افراد مرجع باشد.

محدوده مرجع یک‌طرفه

در بعضی آزمایش‌ها تنها حد بالا یا حد پایین اهمیت دارد. در این شرایط می‌توان محدوده یک‌طرفه تعریف کرد؛ برای مثال:

انتخاب صدک و درصد پوشش باید پیش از تحلیل و بر اساس کاربرد بالینی تعیین شود. نمی‌توان پس از مشاهده داده‌ها، صدکی را انتخاب کرد که نتیجه مطلوب‌تری ایجاد کند.

شناسایی و حذف داده‌های پرت در تعیین محدوده مرجع

داده پرت (Outlier) نتیجه‌ای است که نسبت به سایر داده‌ها فاصله غیرمنتظره‌ای دارد. وجود داده پرت ممکن است ناشی از موارد زیر باشد:

• خطای نمونه‌گیری
• خطای تحلیلی
• اشتباه ورود داده
• بیماری تشخیص داده‌نشده
• تفاوت زیستی واقعی
• وجود یک زیرجمعیت متفاوت

روش‌های Dixon–Reed و Tukey از روش‌های شناخته‌شده بررسی داده‌های پرت در مطالعات محدوده مرجع هستند. در روش Dixon–Reed، فاصله مقدار انتهایی مشکوک با مقدار بعدی با دامنه کل داده‌ها مقایسه می‌شود. اگر نسبت این فاصله به دامنه کل حداقل یک‌سوم باشد، مقدار انتهایی می‌تواند به‌عنوان داده پرت در نظر گرفته شود. (Acute Care Testing)

نوع روش شناسایی داده‌های پرت می‌تواند تأثیر قابل‌توجهی بر حد پایین یا بالای محدوده مرجع داشته باشد؛ به‌خصوص در توزیع‌های چوله. بنابراین استفاده مکانیکی و افراطی از روش‌های حذف داده پرت ممکن است باعث تولید محدوده‌ای غیرواقعی شود. (PubMed)

تشخیص منشأ نتایج غیرعادی

پیش از حذف یک مقدار پرت باید احتمال خطای تصادفی، خطای سیستماتیک یا تغییر واقعی زیستی بررسی شود. مقاله زیر تفاوت این خطاها و روش تشخیص آن‌ها را توضیح می‌دهد.

خطای تصادفی و سیستماتیک در آزمایشگاه؛ تفاوت‌ها، مثال‌ها و روش تشخیص

فاصله اطمینان حدود مرجع در آزمایشگاه

حد پایین و حد بالای محاسبه‌شده، برآوردهایی از حدود واقعی جمعیت هستند. این برآوردها دارای عدم قطعیت‌اند و باید در مطالعات تعیین محدوده مرجع، فاصله اطمینان آن‌ها محاسبه شود.

CLSI استفاده از فاصله اطمینان ۹۰ درصد برای هر یک از حدود مرجع را توصیه می‌کند. هرچه حجم نمونه بیشتر باشد، فاصله اطمینان حدود باریک‌تر و برآورد دقیق‌تر خواهد بود. (MedCalc)

برای مثال، گزارش علمی محدوده مرجع بهتر است به این شکل باشد:

• حد پایین: مقدار برآوردشده همراه با فاصله اطمینان ۹۰ درصد
• حد بالا: مقدار برآوردشده همراه با فاصله اطمینان ۹۰ درصد

فاصله اطمینان حدود مرجع با خود محدوده مرجع تفاوت دارد. محدوده مرجع پراکندگی نتایج افراد را نشان می‌دهد؛ اما فاصله اطمینان، عدم قطعیت برآورد حد پایین یا بالا را بیان می‌کند.

ارتباط فاصله اطمینان و عدم قطعیت اندازه‌گیری

فاصله اطمینان حدود مرجع، عدم قطعیت برآورد حدود جمعیت را نشان می‌دهد؛ درحالی‌که عدم قطعیت اندازه‌گیری به پراکندگی قابل انتساب به نتیجه آزمایش مربوط است. برای بررسی دقیق تفاوت این مفاهیم، راهنمای زیر را بخوانید.

عدم قطعیت در آزمایشگاه تشخیص پزشکی

روش تأیید محدوده مرجع در آزمایشگاه با ۲۰ نمونه

بیشتر آزمایشگاه‌ها محدوده مرجع را از ابتدا تعیین نمی‌کنند، بلکه محدوده ارائه‌شده توسط سازنده یا یک منبع معتبر را تأیید می‌کنند.

پیش از انجام آزمایش باید مشخص شود که:

• روش اندازه‌گیری مشابه یا قابل مقایسه است.
• کالیبراسیون و قابلیت ردیابی تفاوت مهمی ندارد.
• نوع نمونه و شرایط پیش‌تحلیلی مشابه است.
• جمعیت مطالعه اصلی با جمعیت آزمایشگاه قابل مقایسه است.
• واحد و روش گزارش یکسان است.
• پارتیشن‌های سنی و جنسی مناسب‌اند.

سپس حداقل ۲۰ فرد مرجع واجد شرایط انتخاب و نمونه‌ها با روش روتین آزمایشگاه اندازه‌گیری می‌شوند. CLSI تأیید یک محدوده موجود را با تعداد محدودی مانند ۲۰ نمونه امکان‌پذیر می‌داند؛ درحالی‌که تعیین کامل محدوده جدید معمولاً به حداقل ۱۲۰ فرد در هر پارتیشن نیاز دارد. (CLSI EP28)

تفسیر نتایج تأیید محدوده مرجع

اگر صفر، یک یا دو نتیجه خارج باشد

اگر حداکثر دو نتیجه از ۲۰ نتیجه خارج از محدوده پیشنهادی قرار داشته باشند، محدوده مرجع تأیید می‌شود.

اگر سه یا چهار نتیجه خارج باشد

اگر سه یا چهار نتیجه خارج باشد، باید ۲۰ فرد مرجع جدید انتخاب و مطالعه تکرار شود.

اگر در مجموعه دوم حداکثر دو نتیجه خارج باشد، محدوده قابل پذیرش است. اگر سه نتیجه یا بیشتر در مجموعه دوم خارج باشد، محدوده تأیید نمی‌شود.

اگر پنج نتیجه یا بیشتر خارج باشد

اگر از همان مجموعه نخست پنج نتیجه یا بیشتر خارج باشد، محدوده پیشنهادی تأیید نمی‌شود و باید تفاوت‌های روش، جمعیت، شرایط پیش‌تحلیلی و طراحی مطالعه بررسی شوند. (Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)

آیا برای هر پارتیشن به ۲۰ نمونه نیاز است؟

از نظر علمی، تأیید هر پارتیشن سنی یا جنسی با نمونه‌های مرتبط، بالاترین اطمینان را ایجاد می‌کند. برای مثال، تأیید محدوده زنان با نمونه‌های مردان منطقی نیست.

بااین‌حال، تأمین ۲۰ فرد مرجع برای هر پارتیشن در گروه‌های کودکان، سالمندان یا زنان باردار ممکن است دشوار باشد. در این شرایط آزمایشگاه باید بر اساس خطر بالینی، شواهد مطالعه اصلی، شباهت روش و امکان استفاده از مطالعات چندمرکزی تصمیم‌گیری کند.

پذیرش یک پارتیشن به‌عنوان نماینده سایر پارتیشن‌ها باید مستند و از نظر زیستی توجیه‌پذیر باشد. تأیید یک گروه به‌صورت خودکار تمام گروه‌های دیگر را معتبر نمی‌کند.

کنترل کیفیت آزمایش‌های انعقادی

برای استفاده معتبر از محدوده‌های مرجع PT و APTT باید عملکرد روش، معرف، دستگاه و مواد کنترل به‌طور مستمر پایش شود.

کنترل کیفی تست‌های انعقادی؛ راهنمای جامع آزمایشگاه انعقاد

تعیین غیرمستقیم محدوده مرجع با داده‌های LIS

روش غیرمستقیم می‌تواند در آزمایشگاه‌هایی که داده‌های بزرگ و باکیفیت دارند بسیار مفید باشد. مراحل معمول این روش عبارت‌اند از:

1. مشخص کردن بازه زمانی پایدار از نظر دستگاه، معرف و کالیبراسیون
2. استخراج نتایج بر اساس سن، جنس، نوع نمونه و محل درخواست
3. حذف نتایج کنترل کیفی و نمونه‌های غیرانسانی
4. حذف نتایج تکراری یک بیمار یا انتخاب اولین نتیجه هر فرد
5. تفکیک بیماران بستری، اورژانس و سرپایی در صورت نیاز
6. حذف نتایج مرتبط با تشخیص‌ها یا آزمایش‌های همراه مشخص
7. بررسی تغییرات زمانی و تغییر لات یا دستگاه
8. انتخاب روش آماری مناسب
9. مقایسه محدوده حاصل با منابع معتبر
10. تأیید محدوده پیش از استفاده بالینی

روش‌های Hoffmann و Bhattacharya از روش‌های کلاسیک‌اند و الگوریتم‌های جدیدتری مانند refineR، kosmic یا reflimR نیز برای جداسازی بخش مرجع از داده‌های مختلط توسعه یافته‌اند. ابزارهای جدید می‌توانند تحلیل را تسهیل کنند، اما خروجی نرم‌افزار بدون بررسی بالینی، تحلیلی و آماری نباید مستقیماً وارد سیستم گزارش‌دهی شود. (PMC)

مزایای روش غیرمستقیم تعیین محدوده مرجع

• دسترسی به حجم زیاد داده
• هزینه کمتر نسبت به مطالعه مستقیم
• امکان ایجاد پارتیشن‌های سنی دقیق‌تر
• امکان بررسی مداوم محدوده‌ها
• کمک به تعیین محدوده در کودکان و سالمندان
• انعکاس بهتر جمعیت واقعی مراجعه‌کنندگان آزمایشگاه

محدودیت‌های روش غیرمستقیم

• وجود بیماران در مجموعه داده
• سوگیری ارجاع و انتخاب
• تکرار نتایج یک بیمار
• تغییر دستگاه یا کالیبراسیون
• نبود اطلاعات کافی درباره دارو و بیماری
• احتمال وجود چند جمعیت هم‌پوشان
• وابستگی شدید به الگوریتم
• خطر تولید محدوده ظاهراً دقیق اما بالینی نامعتبر

تعیین محدوده مرجع در گروه‌های خاص

محدوده مرجع کودکان

در کودکان، مقادیر بسیاری از آنالیت‌ها با رشد، بلوغ و سن تغییر می‌کنند. استفاده از یک محدوده یکسان برای تمام کودکان می‌تواند باعث طبقه‌بندی نادرست شود.

تعیین محدوده کودکان دشوار است؛ زیرا خون‌گیری از کودکان سالم با محدودیت‌های اخلاقی و عملی همراه است. استفاده از مطالعات چندمرکزی معتبر یا روش‌های غیرمستقیم همراه با تأیید محلی می‌تواند راهکار مناسب‌تری باشد.

محدوده مرجع سالمندان

انتخاب سالمندان فاقد هرگونه بیماری یا مصرف دارو دشوار است. حذف تمام افراد دارای بیماری مزمن ممکن است گروهی غیرواقعی و غیرنماینده ایجاد کند. هدف نباید انتخاب سالمند «کاملاً بدون هیچ بیماری»، بلکه تعریف جمعیتی متناسب با کاربرد بالینی آنالیت باشد. چالش تأمین افراد مرجع در گروه‌های کودکان و سالمندان در مطالعات تأیید محدوده‌های مرجع نیز مورد تأکید قرار گرفته است. (Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)

محدوده مرجع در بارداری

در بارداری، تغییرات حجم پلاسما، عملکرد کلیه، پروتئین‌های حامل، هورمون‌ها و متابولیسم می‌توانند نتایج را تغییر دهند. محدوده‌ها ممکن است بر اساس سه‌ماهه یا حتی هفته بارداری تقسیم شوند.

استفاده از محدوده زنان غیرباردار برای تمام آزمایش‌های دوران بارداری ممکن است نامناسب باشد.

آنالیت‌های وابسته به زمان

برای آنالیت‌هایی که تغییرات شبانه‌روزی، چرخه قاعدگی یا تغییرات فصلی دارند، محدوده مرجع باید به زمان یا شرایط نمونه‌گیری مرتبط باشد. گزارش یک محدوده ثابت بدون ذکر ساعت نمونه‌گیری ممکن است ارزش تفسیر را کاهش دهد.

محدودیت‌های محدوده مرجع جمعیتی

محدوده مرجع معمولاً بر اساس تفاوت‌های میان افراد محاسبه می‌شود؛ درحالی‌که تغییرات طبیعی یک آنالیت در یک فرد ممکن است بسیار کمتر از تفاوت میان افراد باشد.

در آنالیت‌هایی با فردیت زیستی بالا، نتیجه فرد می‌تواند در محدوده جمعیتی قرار داشته باشد، اما نسبت به مقدار پایه همان فرد تغییر مهمی کرده باشد. در چنین شرایطی، مقایسه با نتایج قبلی بیمار و استفاده از مقدار تغییر مرجع (Reference Change Value) می‌تواند از مقایسه صرف با محدوده جمعیتی مفیدتر باشد.

بنابراین محدوده مرجع نباید تنها ابزار تفسیر نتیجه باشد. وضعیت بالینی، نتایج قبلی، عدم قطعیت اندازه‌گیری، تغییرات زیستی و حد تصمیم‌گیری نیز باید در نظر گرفته شوند. پایگاه داده EFLM اطلاعات تغییرات زیستی و برآوردهای مربوط به بسیاری از آنالیت‌ها را ارائه می‌کند. (Biological Variation Database)

ارزیابی عملکرد روش با سیگما متریک

حتی یک محدوده مرجع معتبر نیز در صورت عملکرد تحلیلی نامناسب روش نمی‌تواند از تفسیر صحیح نتایج پشتیبانی کند. سیگما متریک امکان ارزیابی هم‌زمان خطای مجاز، بایاس و عدم دقت را فراهم می‌کند.

سیگما متریک در آزمایشگاه؛ از مفاهیم پایه تا کاربرد عملی در کنترل کیفیت

چه زمانی محدوده مرجع باید بازبینی شود؟

محدوده مرجع نباید برای مدت نامحدود و بدون ارزیابی مجدد استفاده شود. بازبینی در شرایط زیر ضروری است:

• تغییر دستگاه
• تغییر روش اندازه‌گیری
• تغییر کالیبراسیون یا قابلیت ردیابی
• تغییر مهم در معرف
• تغییر نوع نمونه یا ضدانعقاد
• تغییر واحد گزارش
• تغییر شرایط پیش‌تحلیلی
• تغییر قابل‌توجه جمعیت بیماران
• انتشار راهنماهای بالینی جدید
• مشاهده افزایش یا کاهش غیرمنتظره نتایج خارج از محدوده
• ناسازگاری با نتایج مطالعات کنترل کیفیت یا مقایسه روش
• ایجاد پارتیشن جدید سنی یا جنسی

استاندارد ISO 15189:2022 بر بازبینی دوره‌ای محدوده‌های مرجع و حدود تصمیم‌گیری بالینی تأکید دارد. همچنین در صورت تغییر روش آزمایش یا فرایند پیش‌تحلیلی، اثر تغییر بر محدوده مرجع باید بررسی و تغییرات مرتبط به استفاده‌کنندگان اطلاع داده شود. (MDPI)

پایش مستمر تغییرات عملکرد روش

نمودار لوی جنینگ و قوانین وستگارد به شناسایی جابه‌جایی، روند و خطاهای تحلیلی کمک می‌کنند و می‌توانند نیاز به بررسی مجدد محدوده مرجع را آشکار کنند.

نمودار لوی جنینگ چیست؟ آموزش رسم و تفسیر نمودار Levey-Jennings
قوانین وستگارد چیست؟ راهنمای کامل کنترل کیفی داخلی
رسم نمودار لوی جنینگ در اکسل؛ آموزش کامل کنترل کیفی

خطاهای رایج در تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

استفاده مستقیم از بروشور سازنده

محدوده شرکت سازنده بدون بررسی جمعیت، روش، نوع نمونه و شرایط آزمایشگاه نباید به‌طور خودکار پذیرفته شود.

استفاده از میانگین ± دو انحراف معیار برای تمام داده‌ها

این روش تنها در صورت توزیع مناسب داده‌ها قابل استفاده است. در توزیع‌های چوله، ممکن است حد پایین غیرممکن یا حد بالا غیرواقعی ایجاد شود.

تعیین محدوده با تعداد بسیار کم نمونه

۲۰ نمونه برای تأیید یک محدوده مناسب است، نه برای تعیین کامل یک محدوده جدید.

حذف بیش‌ازحد داده‌های پرت

حذف داده‌ها فقط به دلیل نامناسب بودن نتیجه نهایی، اعتبار مطالعه را از بین می‌برد.

ترکیب گروه‌های متفاوت

ترکیب کودکان و بزرگسالان یا زنان و مردان بدون بررسی زیستی و آماری می‌تواند محدوده‌ای ایجاد کند که برای هیچ‌کدام مناسب نباشد.

استفاده از داده‌های بیماران بدون پاک‌سازی

ورود نتایج بستری‌ها، نمونه‌های تکراری و بیماران دارای بیماری مشخص می‌تواند محدوده غیرمستقیم را جابه‌جا کند.

اشتباه گرفتن محدوده مرجع با حد تصمیم‌گیری

برای آزمایش‌هایی که حد تصمیم‌گیری معتبر دارند، ایجاد محدوده مرجع محلی ممکن است موجب تعارض با راهنماهای بالینی شود.

گرد کردن نامناسب حدود

تعداد ارقام اعشار محدوده مرجع باید با دقت و عدم قطعیت روش متناسب باشد. گزارش ارقام بیش از حد، دقتی غیرواقعی القا می‌کند.

نمونه عملی تأیید محدوده مرجع در آزمایشگاه

فرض کنید آزمایشگاه قصد دارد محدوده مرجع پیشنهادی شرکت سازنده را برای یک آنالیت تأیید کند.

ابتدا روش، دستگاه، نوع نمونه، واحد، شرایط نمونه‌گیری و جمعیت مطالعه شرکت بررسی می‌شود. سپس ۲۰ فرد مرجع مطابق معیارهای ورود و خروج انتخاب می‌شوند.

اگر نتایج به شکل زیر باشند:

• ۱۹ نتیجه داخل محدوده
• یک نتیجه خارج از محدوده

چون فقط یک نتیجه خارج است، محدوده تأیید می‌شود.

اگر نتایج شامل ۱۶ نتیجه داخل و چهار نتیجه خارج باشند، باید ۲۰ فرد جدید بررسی شوند.

اگر در مرحله دوم:

• ۱۸ یا بیشتر داخل محدوده باشند، محدوده تأیید می‌شود.
• سه نتیجه یا بیشتر خارج باشند، محدوده تأیید نمی‌شود.

این مثال صرفاً روش شمارش را نشان می‌دهد و جایگزین بررسی داده پرت، صحت روش و صلاحیت افراد مرجع نیست.

مستندات مورد نیاز مطالعه تعیین محدوده مرجع

گزارش نهایی بهتر است حداقل شامل موارد زیر باشد:

• نام آنالیت
• هدف مطالعه
• روش و اصل اندازه‌گیری
• نام دستگاه و معرف
• نوع نمونه و لوله
• واحد گزارش
• جمعیت هدف
• معیارهای ورود و خروج
• تعداد افراد
• سن و جنس افراد
• شرایط نمونه‌گیری و نگهداری
• نتایج کنترل کیفیت
• روش شناسایی داده‌های پرت
• تعداد داده‌های حذف‌شده و دلیل حذف
• روش آماری
• محدوده نهایی
• فاصله اطمینان حدود
• پارتیشن‌ها
• منبع محدوده انتقال‌یافته
• نتیجه تأیید یا رد
• تاریخ اجرا
• نام و تأیید مسئول فنی
• برنامه بازبینی دوره‌ای

الگوریتم پیشنهادی برای تعیین یا تأیید محدوده مرجع

برای هر آزمایش ابتدا مشخص کنید که آیا حد تصمیم‌گیری بالینی معتبر وجود دارد یا خیر. اگر وجود دارد، دقت و قابلیت ردیابی روش را بررسی کرده و همان حد معتبر را به کار ببرید.

اگر محدوده مرجع معتبر از سازنده یا یک مطالعه قابل اعتماد موجود است، شباهت روش و جمعیت را ارزیابی کنید و سپس محدوده را با حداقل ۲۰ فرد مرجع تأیید کنید.

اگر محدوده موجود تأیید نشد، ابتدا خطاهای تحلیلی، تفاوت جمعیت، شرایط پیش‌تحلیلی و اختلاف روش را بررسی کنید. در صورت باقی ماندن اختلاف، محدوده جدید را با حداقل ۱۲۰ فرد در هر پارتیشن یا با یک روش غیرمستقیم معتبر و تأییدشده تعیین کنید.

جمع‌بندی تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

تعیین محدوده مرجع یکی از اجزای اساسی اعتبار نتایج آزمایشگاهی است. محدوده مرجع معتبر باید از جمعیت مناسب، شرایط پیش‌تحلیلی کنترل‌شده، روش اندازه‌گیری پایدار و تحلیل آماری صحیح به دست آمده باشد.

برای تعیین مستقیم محدوده مرجع به روش ناپارامتریک، حداقل ۱۲۰ فرد مرجع در هر پارتیشن توصیه می‌شود. بااین‌حال، در اغلب آزمایشگاه‌ها انتقال و تأیید یک محدوده معتبر با ۲۰ فرد مرجع، راهکار عملی‌تر و منطقی‌تری است.

هیچ محدوده‌ای نباید صرفاً به دلیل درج در بروشور دستگاه یا استفاده در یک آزمایشگاه دیگر پذیرفته شود. محدوده مرجع باید با جمعیت، روش، نوع نمونه و شرایط آزمایشگاه سازگار باشد و در صورت تغییر روش یا شرایط، مورد بازبینی قرار گیرد.

مهم‌تر از همه، محدوده مرجع نباید با حد تصمیم‌گیری بالینی اشتباه گرفته شود. نتیجه بیمار باید همراه با سابقه بالینی، نتایج قبلی، تغییرات زیستی، عدم قطعیت اندازه‌گیری و سایر اطلاعات تشخیصی تفسیر شود.

سؤالات رایج درباره تعیین محدوده مرجع در آزمایشگاه

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر درباره محدوده مرجع

سایر مقالات آموزشی و کنترل کیفی هموستیکا

مطالب زیر ارتباط مستقیم کمتری با محاسبه محدوده مرجع دارند، اما برای تکمیل نظام مدیریت کیفیت، کنترل تجهیزات و کنترل تخصصی بخش‌های مختلف آزمایشگاه مفید هستند.

کنترل کیفی هماتولوژی

کنترل کیفی بیوشیمی

کنترل کیفی میکروب‌شناسی

کنترل کیفی آزمایش ادرار

کنترل کیفی اتوکلاو

کنترل کیفی آب مقطر در آزمایشگاه؛ مقاله جامع و SOP اجرایی