الکتروفورز پروتئین سرم یکی از آزمون‌های کلیدی در تشخیص‌های آزمایشگاهی است که امکان جداسازی و تحلیل اجزای مختلف پروتئین‌های سرم را فراهم می‌کند. اهمیت این آزمون از آنجاست که بسیاری از بیماری‌های سیستمیک—شامل اختلالات ایمنی، بیماری‌های کلیوی، کبدی، نئوپلاسم‌های سلول‌های پلاسما و فرآیندهای التهابی—الگوی مشخصی در این تست ایجاد می‌کنند. آشنایی با مبانی فیزیکوشیمیایی، اصول عملی انجام تست و تفسیر سیستماتیک الگوها، برای متخصصان آزمایشگاه و دانشجویان علوم آزمایشگاهی ضروری است.

1. اساس الکتروفورز

الکتروفورز فرآیندی مبتنی بر حرکت مولکول‌های باردار در میدان الکتریکی است. سرعت و جهت حرکت هر مولکول به خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن بستگی دارد. مولکول‌هایی با بار منفی به سمت آند و مولکول‌های دارای بار مثبت به سمت کاتد حرکت می‌کنند. پروتئین‌های سرم به دلیل ترکیب اسیدآمینه‌ای خود در pH قلیایی دارای بار منفی شده و همگی در یک جهت حرکت می‌کنند، اما سرعت مهاجرت آنها متفاوت است.

2. نقش نقطه ایزوالکتریک (pI) در الکتروفورز پروتئین

پروتئین‌ها در pH ایزوالکتریک، بار خالص صفر دارند. اگر محیط قلیایی‌تر از pI باشد، پروتئین بار منفی می‌گیرد و بالعکس. در الکتروفورز پروتئین سرم از بافر باربیتال با pH برابر 8.6 استفاده می‌شود که تقریباً برای تمامی پروتئین‌های سرم بالاتر از pI آنهاست؛ بنابراین همگی باردار شده و در یک جهت حرکت می‌کنند، اما سرعت مهاجرت آنها متفاوت است.

3. عوامل مؤثر بر سرعت مهاجرت

حرکت پروتئین‌ها در ژل تحت تأثیر مجموعه‌ای از پارامترهاست:

• الف. بار الکتریکی — هرچه بار منفی بیشتر باشد، مولکول سریع‌تر حرکت می‌کند.
• ب. اندازه و وزن مولکولی — پروتئین‌های بزرگ‌تر مقاومت بیشتری در ماتریس ژل دارند و کندتر حرکت می‌کنند.
• ج. ساختار سه‌بعدی — پروتئین‌های کمپاکت سریع‌تر از پروتئین‌های کشیده مهاجرت می‌کنند.
• د. ویژگی‌های محیطی — غلظت یونی بافر، ویسکوزیته، شدت میدان الکتریکی.

1. مواد و تجهیزات مورد نیاز برای الکتروفورز پروتئین

– دستگاه الکتروفورز افقی
– ژل آگاروز یا استات سلولز
– بافر باربیتال (pH 8.6)
– نمونه سرم غیرهمولیز
– کنترل‌های نرمال و بیمار
– رنگ‌های اختصاصی پروتئین (آمیدو بلک، کوماسی بلو، Ponceau S)
– سیستم رنگ‌زدایی
– آون خشک‌کن
– دنسیتومتر و نرم‌افزار تحلیل باند

2. آماده‌سازی نمونه

– نمونه طی ۲۴ ساعت در ۲–۸°C قابل استفاده است.
– برای نگهداری طولانی، فریز کردن در −20°C توصیه می‌شود.
– نمونه همولیز، لیپمیک یا ایکتریک موجب ایجاد باندهای غیرواقعی می‌شود.
– کلوت کامل و جدا کردن سریع سرم ضرورت دارد.

3. آماده‌سازی ژل

ژل آگاروز 1% در بافر گرم‌شده حل می‌شود و روی لام شیشه‌ای ریخته می‌شود. پس از سفت شدن، با کامب نمونه‌گذاری، چاهک‌ها ایجاد می‌شوند. ضخامت یکنواخت ژل برای مهاجرت مناسب ضروری است.

4. بارگذاری نمونه‌ها

معمولاً 3–5 µL از هر نمونه در چاهک قرار داده می‌شود. حجم بیش از حد باعث broadening باندها و سختی تفسیر می‌شود.

5. اجرای الکتروفورز

– ولتاژ: 100–150 ولت
– جریان: 40–50 mA
– زمان: حدود 30–45 دقیقه
باید دامنه دما کنترل شود؛ گرمای بیش از حد سبب پخش باندها می‌شود.

6. مراحل پس از الکتروفورز

الف. رنگ‌آمیزی: ژل در رنگ پروتئین قرار داده می‌شود تا باندها آشکار شوند.
ب. رنگ‌بری: به‌تدریج زمینه ژل پاک و باندها واضح می‌شوند.
ج. خشک‌کردن: در آون 50–60°C خشک می‌شود تا امکان اسکن داشته باشد.
د. اسکن و تحلیل: دنسیتومتر شدت نوری هر باند را اندازه می‌گیرد و مساحت زیر منحنی درصد هر فراکسیون را تعیین می‌کند.

به‌طور کلاسیک، پنج ناحیه اصلی دیده می‌شود:

1. آلبومین

– بزرگ‌ترین فراکسیون سرم (۵۵–۶۰٪)
– باندی باریک و قوی
– مسئول حفظ فشار انکوتیک
– کاهش آن اغلب نشانه بیماری سیستمیک است

2. آلفا-1 گلوبولین

– ۲–۴٪
– شامل آلفا-1 آنتی‌تریپسین و آلفا-1 اسید گلیکوپروتئین
– افزایش در التهاب حاد
– کاهش در کمبود آلفا-1 آنتی‌تریپسین

3. آلفا-2 گلوبولین

– ۶–۸٪
– شامل هاپتوگلوبین، آلفا-2 ماکروگلوبولین، سرولوپلاسمین
– افزایش مشخص در سندرم نفروتیک

4. بتا گلوبولین

– ۹–۱۳٪
– شامل ترانسفرین، کمپلمان C3، بتا-لیپوپروتئین
– ناحیه‌ای که ممکن است باندهای مونوکلونال پنهان در آن ظاهر شوند

5. گاما گلوبولین

– ۱۱–۱۸٪
– عمدتاً متشکل از IgG, IgA, IgM
– الگوی طبیعی پلی‌کلونال است

الکتروفورز پروتئین

1. الگوی مونوکلونال (M-Spike)

مشخصه آن وجود یک باند باریک، تیز و واضح است. مکان ظهور باند می‌تواند در گاما، بتا یا حتی آلفا-2 باشد.

بیماری‌های مرتبط:
– مولتیپل میلوما
– MGUS
– ماکروگلوبولینمی والدنشتروم
– آمیلوئیدوز AL
– برخی لوسمی‌های لنفویید

2. افزایش پلی‌کلونال گاما

باند پهن و منتشر به علت تحریک ایمنی گسترده.

بیماری‌های مرتبط:
– عفونت‌های مزمن
– بیماری‌های خودایمنی
– بیماری‌های کبدی
– سارکوئیدوز

3. الگوی سندرم نفروتیک

– کاهش شدید آلبومین
– افزایش آلفا-2
– کاهش گاما
علت آن از دست دادن آلبومین از کلیه و افزایش جبرانی آلفا-2 ماکروگلوبولین است.

4. الگوی سیروز کبدی

– آلبومین پایین
– افزایش گاما
– تشکیل پل بین بتا و گاما (Beta-Gamma Bridging)
– کاهش آلفا-1 و آلفا-2

5. الگوی التهاب حاد

– کاهش آلبومین
– افزایش آلفا-1 و آلفا-2
– افزایش پروتئین‌های فاز حاد مانند CRP

کنترل کیفیت

– استفاده از کنترل‌های نرمال و پاتولوژیک در هر ران
– رسم نمودارهای QC و تحلیل روندها
– پایش ولتاژ، بافر، ژل و زمان اجرا

نکات مهم پیش‌تحلیلی

– نمونه‌گیری غیرناشتا می‌تواند لیپمی ایجاد کند.
– تأخیر در جدا کردن سرم باندهای کاذب ایجاد می‌کند.
– همولیز باعث باند هموگلوبین می‌شود و تفسیر را مختل می‌کند.

محدودیت‌های روش

– تشخیص باندهای مونوکلونال کوچک با حساسیت پایین
– عدم توانایی در تعیین نوع زنجیره‌های سنگین و سبک
– وابستگی به تجربه متخصص تفسیرکننده
– حساسیت پایین‌تر در مقایسه با IFE

1. ایمونوفیکساسیون (IFE)

استاندارد طلایی برای تشخیص و تایپ پروتئین‌های مونوکلونال — تعیین زنجیره سنگین و سبک — حساس‌تر از الکتروفورز معمولی.

2. سنجش کاپا/لامبدا آزاد

برای پایش پاسخ به درمان در مولتیپل میلوما ضروری است، به‌ویژه در بیماران با میلوماهای زنجیره سبک.

نکته عملی و مدیریتی

توجه به کنترل کیفیت، ملاحظات پیش‌تحلیلی و استفاده به موقع از روش‌های تأییدی، دقت و صحت نتایج این آزمایش مهم را تضمین می‌کند.