مقدمه در مورد روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

کلیدواژه‌ها: روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر، آموزش اسپکتروفتومتر، Spectrophotometer Tutorial، قانون بیر-لامبرت، راهنمای عملی.

دستگاه اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) یکی از ابزارهای اساسی در آزمایشگاه‌های بیوشیمی، هماتولوژی و مولکولی است. وظیفه‌ی اصلی آن اندازه‌گیری میزان جذب یا عبور نور توسط یک محلول در طول‌موج مشخص است. بر اساس قانون بیر–لامبرت (Beer–Lambert Law)، جذب نور توسط یک ماده با غلظت ماده و طول مسیر نوری رابطه مستقیم دارد. به‌بیان ساده‌تر، هرچه محلول غلیظ‌تر باشد، نور کمتری از آن عبور می‌کند. این قانون پایه‌ی بسیاری از روش‌های کمی در آزمایشگاه است، مانند اندازه‌گیری غلظت گلوکز، پروتئین، آنزیم‌ها و رنگ‌سنجی DNA.

اصول کار اسپکتروفتومتر (Spectrophotometry Basics)

کلیدواژه‌ها: جذب (Absorbance)، ترانسمیتانس (Transmittance)، تکفام‌ساز، دیتکتور، طول‌موج.

در اسپکتروفتومتر، نور تولیدشده از منبع نوری ابتدا از تکفام‌ساز (Monochromator) عبور می‌کند تا فقط یک طول‌موج خاص از آن انتخاب شود. سپس نور به محلول داخل کووت (Cuvette) تابانده می‌شود. بخشی از این نور توسط ماده‌ی موجود در محلول جذب شده و باقی‌مانده از آن عبور می‌کند. دیتکتور (Detector) میزان نور عبوری را اندازه می‌گیرد و دستگاه بر اساس آن مقدار جذب (Absorbance) یا عبور (Transmittance) را نمایش می‌دهد.

اصول کار اسپکتروفتومتر

A = log ( I₀ / I )

اجزای اصلی اسپکتروفتومتر (Components)

کلیدواژه‌ها: منبع نور تنگستن/دوتریم، مونکروماتور، کووت کوارتز/شیشه، فتودیود/PMT.

1. منبع نور: برای مرئی از لامپ تنگستن و برای UV از لامپ دوتریم استفاده می‌شود.
2. مونکروماتور: منشور یا شبکه پراش برای انتخاب طول‌موج.
3. کووت (Cuvette): شیشه‌ای برای مرئی و کوارتز برای UV (حجم متداول ~۱ میلی‌لیتر).
4. دیتکتور: فتودیود یا فتومولتی‌پلایر برای دریافت نور عبوری.
5. نمایشگر/پردازش: نمایش عدد جذب/ترانسمیتانس و اتصال به رایانه در مدل‌های جدید.

آماده‌سازی پیش از استفاده (Preparation & Warm-up)

کلیدواژه‌ها: گرم‌شدن لامپ، انتخاب طول‌موج، تمیزی کووت، بلانک.

1. روشن کردن دستگاه: ۱۰–۱۵ دقیقه برای پایداری منبع نور.
2. انتخاب طول‌موج: بر اساس تست (مثل 540nm هموگلوبین یا 280nm پروتئین‌ها).
3. تمیز کردن کووت: شستشو با آب مقطر، خشک‌کردن با دستمال بدون پرز؛ بدون لکه و اثر انگشت.
4. کالیبراسیون با بلانک: کووت حاوی بلانک را قرار داده و عدد جذب را صفر کنید.

مراحل عملی روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر + مثال واقعی (Biuret)

کلیدواژه‌ها: پروتئین تام سرم، طول‌موج 540nm، استاندارد/نمونه، محاسبه غلظت.

مثال: تعیین غلظت پروتئین به روش بیورت (Biuret Method)

هدف: اندازه‌گیری غلظت پروتئین در نمونه سرم.

وسایل: اسپکتروفتومتر، کووت تمیز، معرف بیورت، سرم نمونه، بلانک (آب مقطر)، استاندارد پروتئین.

1. تنظیم طول‌موج روی 540 nm.
2. در لوله‌ها ۳ میلی‌لیتر معرف بیورت بریزید.
3. به هر لوله 0.1 میلی‌لیتر استاندارد یا نمونه بیفزایید.
4. مخلوط و ۱۰ دقیقه در دمای اتاق صبر کنید تا رنگ بنفش تشکیل شود.
5. دستگاه را با بلانک صفر کنید.
6. جذب استاندارد را بخوانید (مثلاً 0.45).
7. جذب نمونه را بخوانید (مثلاً 0.36).
8. محاسبه:
   Sample Conc = (Abs_sample / Abs_std) × Std Conc = (0.36 / 0.45) × 6 = 4.8 g/dl

نحوه رسم منحنی استاندارد (Calibration Curve)

کلیدواژه‌ها: جذب در برابر غلظت، استانداردهای پلکانی، تخمین نمونه ناشناخته.

چند محلول استاندارد با غلظت‌های ۲، ۴، ۶، ۸ و ۱۰ g/dl بسازید؛ جذب هرکدام را در طول‌موج مشخص اندازه بگیرید و منحنی جذب برحسب غلظت رسم کنید. سپس غلظت نمونه‌های ناشناخته را از روی این منحنی استخراج نمایید.

نکات مهم در کار با اسپکتروفتومتر (Important Tips)

• بلانک را قبل از هر سری آزمایش مجدداً چک کنید.
• از کووت مشابه و تمیز برای همه نمونه‌ها استفاده کنید.
• محلول‌ها را قبل از قرائت، به‌آرامی هم بزنید.
• اگر جذب > 2 بود، نمونه را رقیق کنید تا در محدوده خطی قرار گیرد.
• وجود حباب یا تفاوت دما باعث خطا می‌شود.

کنترل کیفی اسپکتروفتومتر (Quality Control)

کلیدواژه‌ها: صحت طول‌موج، صحت جذب، پایداری نوری، درستی بلانک.

• صحت طول‌موج: محلول پتاسیم دی‌کرومات و بررسی قله‌ها در طول‌موج‌های مرجع.
• دقت جذب: با محلول‌های استاندارد نیکل سولفات/کبالت کلراید.
• پایداری نوری: رصد تغییرات جذب در بازه زمانی مشخص.
• بلانک: کنترل صفر در فواصل منظم.

راهنمای تکمیلی: کنترل کیفی اسپکتروفتومتر

کاربردهای اسپکتروفتومتر (Laboratory Applications)

کلیدواژه‌ها: هموگلوبین، بیلی‌روبین، گلوکز، اوره، کراتینین، فعالیت آنزیم‌ها، خلوص DNA/RNA.

• تعیین غلظت هموگلوبین، پروتئین، بیلی‌روبین، گلوکز، اوره، کراتینین.
• سنجش فعالیت آنزیمی در بیوشیمی.
• بررسی خلوص DNA/RNA در آزمایشگاه‌های مولکولی.
• کنترل کیفی محصولات دارویی/غذایی از نظر پایداری رنگ و محلول‌ها.

خطاهای رایج (Common Errors) در روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

کلیدواژه‌ها: کووت کثیف/تر، طول‌موج اشتباه، خطای بلانک، حباب، تفاوت دما.

• استفاده از کووت کثیف یا خیس.
• انتخاب نادرست طول‌موج.
• بلانک نامناسب نسبت به معرف.
• وجود حباب در کووت.
• تفاوت دما بین بلانک و نمونه.

نگهداری و سرویس (Maintenance)

کلیدواژه‌ها: تمیزکاری روزانه، شست‌وشوی کووت، محیط خشک و بدون گردوغبار، کالیبراسیون ماهانه.

• تمیز کردن مسیر نوری با پارچه نرم و بدون پرز هر روز.
• شست‌وشوی فوری کووت‌ها پس از استفاده و خشک‌کردن کامل.
• نگهداری دستگاه در محیط خشک، بدون لرزش و گردوغبار.
• کالیبراسیون دوره‌ای توسط سرویس‌دهنده معتبر (پیشنهاد: ماهانه/فصلی).

جمع‌بندی روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومتر ابزاری کلیدی برای اندازه‌گیری دقیق غلظت مواد است. با رعایت اصول آماده‌سازی، استفاده از بلانک، انتخاب طول‌موج صحیح و اجرای کنترل کیفی منظم، می‌توان داده‌هایی دقیق و قابل‌اعتماد به‌دست آورد. در این راهنما، روش کار از اصول تا مثال عملی بیورت، رسم منحنی استاندارد، نکات مهم، کنترل کیفی، خطاهای رایج و نگهداری مرور شد.

سؤالات متداول (FAQ) در مورد روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

1) بهترین طول‌موج برای سنجش پروتئین چیست؟

بسته به روش: بیورت معمولاً 540nm، لاوری/برادفورد حدود 595nm، و پروتئین‌های آروماتیک در 280nm.

2) چرا باید بلانک را هر سری آزمایش صفر کنم؟

برای حذف جذب زمینه ناشی از معرف/حلال و تثبیت خط پایه.

3) اگر جذب از 2 بیشتر شد چه کنم؟

نمونه را با حلال مناسب رقیق کنید تا در محدوده خطی دستگاه قرار گیرد.

4) کووت شیشه‌ای یا کوارتز؟

برای محدوده مرئی از شیشه و برای UV از کوارتز استفاده کنید.

5) حباب‌ها چطور خطا ایجاد می‌کنند؟

حباب‌ها مسیر نور را مسدود می‌کنند و جذب را غیرواقعی افزایش می‌دهند.

6) چگونه از صحت طول‌موج مطمئن شوم؟

با محلول‌های مرجع (مثلاً K2Cr2O7) قله‌های استاندارد را بررسی کنید.

7) تفاوت Absorbance و Transmittance چیست؟

Abs بر حسب لگاریتم نسبت I0/I و T درصد نور عبوری از نمونه است.

8) چرا نمونه و بلانک باید هم‌دما باشند؟

تفاوت دما تغییر ضریب جذب و چگالی را سبب می‌شود.

9) برای اتصال به رایانه چه نکاتی مهم است؟

نصب درایور سازگار، نرم‌افزار کالیبراسیون و ثبت خودکار داده‌ها.

10) دوره سرویس دستگاه چقدر است؟

بسته به کاربری، پیشنهاد می‌شود ماهانه بررسی داخلی و هر فصل سرویس تخصصی انجام شود.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر در مورد روش کار با دستگاه اسپکتروفتومتر

• کنترل کیفی آزمایشگاه تشخیص طبی (Heamostica)
• کنترل کیفی هماتولوژی
• کنترل کیفی تست‌های انعقادی
• کنترل کیفی بیوشیمی
• کنترل کیفی میکروب‌شناسی
• کنترل کیفی آزمایش ادرار
  
• NCBI
• NIST — Reference Materials