مقدمه به محیط کشت مک کانکی و کاربردهای آن

محیط کشت مک‌کانکی، که اغلب به اختصار MA نامیده می‌شود، یکی از پرکاربردترین محیط‌های کشت انتخابی و تمایزی در میکروبیولوژی است. این محیط جامد برای جداسازی و شناسایی باکتری‌های گرم‌منفی، به ویژه خانواده انتروباکتریاسه یا همان کلی‌فرم‌ها طراحی شده است. اصل کار آن بر پایه مهار رشد باکتری‌های گرم‌مثبت و تمایز باکتری‌ها بر اساس توانایی فرمنتاسیون لاکتوز استوار است. باکتری‌های گرم‌منفی مقاوم به نمک‌های صفراوی می‌توانند روی این محیط رشد کنند، در حالی که گرم‌مثبت‌ها عمدتاً مهار می‌شوند. این محیط در تشخیص پاتوژن‌های روده‌ای مانند اشریشیا کلی، سالمونلا و شیگلا نقش کلیدی دارد و در نمونه‌های بالینی مانند ادرار، مدفوع، خون و حتی کنترل کیفیت آب و غذا استفاده می‌شود. رنگ کلنی‌ها روی این محیط نشان‌دهنده نوع باکتری است: کلنی‌های صورتی یا قرمز نشان‌دهنده فرمنت‌کننده‌های لاکتوز هستند، در حالی که کلنی‌های بی‌رنگ یا شفاف به غیرفرمنت‌کننده‌ها تعلق دارند.

تاریخچه

تاریخچه توسعه محیط کشت مک‌کانکی به اوایل قرن بیستم بازمی‌گردد. این محیط توسط آلفرد تئودور مک‌کانکی، باکتری‌شناس بریتانیایی، در سال ۱۹۰۰ در مؤسسه لیستر لندن ابداع شد. هدف اولیه او جداسازی باسیلوس تیفوزوس (که امروزه به عنوان سالمونلا تیفی شناخته می‌شود) از نمونه‌های مدفوع بیماران مبتلا به تیفوئید بود، بدون اینکه باکتری‌های گرم‌مثبت آلوده‌کننده رشد کنند. نسخه اولیه شامل صفرای گاوی و لاکتوز بود تا رشد گرم‌مثبت‌ها را مهار کند و فرمنتاسیون را نشان دهد. در سال ۱۹۰۵، مک‌کانکی کریستال ویولت را اضافه کرد تا انتخابی بودن محیط افزایش یابد و مهار گرم‌مثبت‌ها قوی‌تر شود. در دهه ۱۹۲۰، نشانگر pH نوترال رد جایگزین لیتموس شد تا تشخیص رنگ دقیق‌تر باشد. با گذشت زمان، این محیط توسط سازمان‌هایی مانند سازمان جهانی بهداشت (WHO)، سازمان غذا و دارو (FDA) و انجمن استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI) استانداردسازی شد. امروزه نسخه‌های مختلفی از آن وجود دارد، مانند مک‌کانکی با سوربیتول برای تشخیص سویه‌های خاص اشریشیا کلی مانند O157:H7، یا نسخه بدون کریستال ویولت برای باکتری‌های حساس‌تر. این پیشرفت‌ها مک‌کانکی را به یک ابزار استاندارد در میکروبیولوژی بالینی و تحقیقاتی تبدیل کرده است.

ترکیبات محیط کشت مک کانکی

ترکیبات محیط کشت مک‌کانکی با دقت انتخاب شده‌اند تا هم انتخابی بودن و هم تمایزی بودن را تضمین کنند. در هر لیتر آب مقطر، حدود ۱۷ گرم پپتون (که از هیدرولیز پانکراتیک ژلاتین به دست می‌آید) به عنوان منبع اصلی نیتروژن، کربن و ویتامین‌ها اضافه می‌شود. ۳ گرم پروتئوز پپتون منبع اضافی نیتروژن فراهم می‌کند تا رشد باکتری‌ها حمایت شود. ۱۰ گرم لاکتوز مونوهیدرات به عنوان منبع کربوهیدرات اصلی عمل می‌کند و برای تمایز فرمنت‌کننده‌ها از غیرفرمنت‌کننده‌ها ضروری است. ۱.۵ گرم نمک‌های صفراوی (بایل سالتز) نقش مهارکننده دارند و غشای سلولی باکتری‌های گرم‌مثبت را مختل می‌کنند، زیرا این باکتری‌ها فاقد لایه لیپوپلی‌ساکارید خارجی هستند. ۵ گرم سدیم کلراید برای حفظ تعادل اسموتیک محیط اضافه می‌شود. ۰.۰۰۱ گرم کریستال ویولت به عنوان یک اینترکالاتور DNA عمل می‌کند و رشد باکتری‌هایی مانند استرپتوکوکوس، استافیلوکوکوس و انتروکوکوس را بیشتر مهار می‌کند. ۰.۰۳ گرم نوترال رد به عنوان نشانگر pH کار می‌کند؛ این ماده در pH خنثی قرمز است و در محیط اسیدی (کمتر از ۶.۸) به رنگ زرد یا صورتی تغییر می‌کند. در نهایت، ۱۳.۵ گرم آگار به عنوان جامدکننده اضافه می‌شود تا محیط ژل‌مانند شود و دمای ذوب آن حدود ۸۵ درجه سانتی‌گراد باشد. pH نهایی محیط باید حدود ۷.۱ ± ۰.۲ در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد باشد تا عملکرد بهینه داشته باشد. این ترکیبات با هم محیطی ایجاد می‌کنند که فقط باکتری‌های گرم‌منفی مقاوم به صفرا مانند انتروباکتریاسه و گاهی سودوموناس بتوانند رشد کنند.

اصول کار محیط کشت مک کانکی

اصول کار محیط کشت مک‌کانکی بر دو مکانیسم اصلی استوار است: انتخابی بودن و تمایزی بودن. انتخابی بودن از طریق نمک‌های صفراوی و کریستال ویولت حاصل می‌شود. نمک‌های صفراوی به عنوان سورفکتانت‌های آنیونی عمل می‌کنند و غشای سلولی باکتری‌های گرم‌مثبت را لیز می‌کنند، زیرا این باکتری‌ها لایه محافظ خارجی ندارند. کریستال ویولت نیز با اتصال به DNA، تکثیر این باکتری‌ها را مختل می‌کند. در نتیجه، فقط باکتری‌های گرم‌منفی مانند کلی‌فرم‌ها می‌توانند رشد کنند. تمایزی بودن بر پایه فرمنتاسیون لاکتوز است. باکتری‌های فرمنت‌کننده لاکتوز (مانند اشریشیا کلی و کلبسیلا) لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تجزیه می‌کنند و سپس این قندها را به اسیدهای آلی مانند اسید لاکتیک و فرمیک تبدیل می‌کنند. این اسیدها pH محیط اطراف کلنی را کاهش می‌دهند (کمتر از ۶.۸)، که باعث می‌شود نوترال رد پروتون‌دار شود و رنگ صورتی یا قرمز ایجاد کند. علاوه بر این، اسید با نمک‌های صفراوی واکنش داده و رسوب صفراوی تشکیل می‌دهد که هاله‌ای اطراف کلنی ایجاد می‌کند. در مقابل، باکتری‌های غیرفرمنت‌کننده لاکتوز (مانند سالمونلا، شیگلا و پروتئوس) لاکتوز را مصرف نمی‌کنند، بنابراین pH خنثی باقی می‌ماند و کلنی‌ها بی‌رنگ یا شفاف ظاهر می‌شوند. برخی فرمنت‌کننده‌های قوی مانند اشریشیا کلی کلنی‌های مرطوب و موکوئیدی با هاله پررنگ تولید می‌کنند، در حالی که فرمنت‌کننده‌های ضعیف مانند انتروباکتر کلنی‌های کوچک و خشک دارند. این مکانیسم‌ها اجازه می‌دهند تا با یک نگاه ساده، باکتری‌ها تمایز داده شوند.

روش تهیه گام‌به‌گام محیط کشت مک کانکی

روش تهیه محیط کشت مک‌کانکی نسبتاً ساده است و می‌تواند در آزمایشگاه‌های استاندارد انجام شود. ابتدا ۵۰ گرم پودر تجاری آماده (که شامل تمام ترکیبات است) را در ۱۰۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر معلق کنید. محیط را با حرارت ملایم و هم‌زدن مداوم گرم کنید تا کاملاً حل شود، اما از جوشاندن اجتناب کنید زیرا ممکن است آگار تخریب شود یا نشانگرها آسیب ببینند. سپس، محیط را در اتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید. پس از اتوکلاو، محیط را تا دمای ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد خنک کنید تا از آسیب به نشانگرها جلوگیری شود. در این مرحله، محیط را در پلیت‌های پتری استریل بریزید (حدود ۱۵-۲۰ میلی‌لیتر در هر پلیت) و اجازه دهید سفت شود. پلیت‌ها را در یخچال ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید، جایی که تا ۴ هفته پایدار هستند. برای نسخه مایع (براث)، آگار را حذف کنید. نکات مهم شامل تنظیم دقیق pH قبل از اتوکلاو و جلوگیری از قرار گرفتن در معرض نور مستقیم است، زیرا ممکن است کریستال ویولت تجزیه شود. در صورت تهیه دستی، تمام مواد را با دقت وزن کنید تا تعادل حفظ شود.

کاربرد های محیط مک کانکی

کاربردهای محیط کشت مک‌کانکی بسیار گسترده است و آن را به یک ابزار ضروری در زمینه‌های مختلف تبدیل کرده است. در میکروبیولوژی بالینی، از آن برای تشخیص عفونت‌های دستگاه ادراری (UTI) استفاده می‌شود، جایی که اشریشیا کلی اغلب عامل اصلی است و کلنی‌های صورتی آن به راحتی شناسایی می‌شود. در بررسی نمونه‌های مدفوع، برای جداسازی پاتوژن‌های روده‌ای مانند سالمونلا و شیگلا (که کلنی‌های بی‌رنگ تولید می‌کنند) کاربرد دارد. همچنین در نمونه‌های خون، زخم، مایع مغزی-نخاعی و حتی ترشحات تنفسی برای شناسایی گرم‌منفی‌ها مفید است. در بهداشت عمومی، این محیط برای کنترل کیفیت آب و غذا استفاده می‌شود؛ کلی‌فرم‌ها به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی در آب آشامیدنی طبق استانداردهای WHO بررسی می‌شوند. در صنایع غذایی، برای تشخیص آلودگی در شیر، گوشت و محصولات لبنی به کار می‌رود. در تحقیقات، از آن برای مطالعات میکروبیوم روده، بررسی مقاومت آنتی‌بیوتیکی و حتی جداسازی سویه‌های خاص مانند ویبریو استفاده می‌شود. نسخه‌های تخصصی مانند مک‌کانکی با سوربیتول (SMAC) برای تشخیص اشریشیا کلی O157:H7 (که غیرفرمنت‌کننده سوربیتول است و کلنی بی‌رنگ تولید می‌کند) یا مک‌کانکی با MUG (برای تشخیص فلورسانس اشریشیا کلی تحت UV) توسعه یافته‌اند. این کاربردها حساسیت بالای ۹۵-۹۹ درصدی محیط را نشان می‌دهند.

تفسیر نتایج دقیق روی محیط کشت مک کانکی

تفسیر نتایج روی محیط کشت مک‌کانکی نیاز به دقت دارد و معمولاً پس از انکوباسیون هوازی در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸-۲۴ ساعت انجام می‌شود. کلنی‌های صورتی یا قرمز خشک و کوچک اغلب به فرمنت‌کننده‌های ضعیف لاکتوز مانند انتروباکتر یا سیتروباکتر تعلق دارند. کلنی‌های صورتی یا قرمز مرطوب، بزرگ و موکوئیدی با هاله رسوبی معمولاً نشان‌دهنده فرمنت‌کننده‌های قوی مانند اشریشیا کلی یا کلبسیلا هستند. کلنی‌های بی‌رنگ یا شفاف، صاف یا ناهموار، به غیرفرمنت‌کننده‌ها مانند سالمونلا، شیگلا یا پروتئوس اشاره دارند. در مورد پروتئوس، کلنی‌ها ممکن است پخش‌شونده (سوارمینگ) باشند به دلیل تحرک بالا. اگر رشدی مشاهده نشود، احتمالاً نمونه فاقد باکتری‌های گرم‌منفی هدف است یا باکتری‌ها حساس به مهارکننده‌ها هستند. در نسخه‌های با تیوسولفات، برخی باکتری‌ها مانند سالمونلا ممکن است کلنی‌های سیاه با H2S تولید کنند. تفسیر همیشه باید با تست‌های بیوشیمیایی اضافی مانند IMViC یا TSI تأیید شود، زیرا ظاهر کلنی تنها کافی نیست.

مزایای استفاده از محیط کشت مک کانکی

مزایای محیط کشت مک‌کانکی آن را به انتخاب اول بسیاری از آزمایشگاه‌ها تبدیل کرده است. انتخابی بودن قوی آن برای گرم‌منفی‌های روده‌ای اجازه می‌دهد تا نمونه‌های آلوده را به راحتی پردازش کنیم. تمایز بصری ساده با رنگ کلنی‌ها نیاز به تجهیزات پیشرفته را کاهش می‌دهد و تشخیص سریع ممکن می‌سازد. این محیط ارزان، پایدار و به صورت تجاری آماده در دسترس است، که کار را آسان می‌کند. حساسیت بالا و سادگی استفاده آن را برای آزمایشگاه‌های کوچک و بزرگ مناسب می‌سازد.

محدودیت‌ها و مشکلات

با وجود مزایا، محیط کشت مک‌کانکی محدودیت‌هایی دارد که باید در نظر گرفته شود. مهار گرم‌مثبت‌ها ناکامل است و برخی سویه‌های مقاوم مانند انتروکوکوس یا استافیلوکوکوس ممکن است رشد کنند و نتایج را مختل کنند. برخی باکتری‌های گرم‌منفی حساس مانند یرسینیا یا ویبریو ممکن است مهار شوند و نیاز به محیط‌های جایگزین مانند TCBS داشته باشند. تمایز همیشه دقیق نیست؛ برخی غیرفرمنت‌کننده‌ها ممکن است اسید از پپتون تولید کنند و کلنی‌های کم‌رنگ ایجاد کنند. در نمونه‌های heavily contaminated، بیش‌رشد فرمنت‌کننده‌ها ممکن است غیرفرمنت‌کننده‌ها را ماسک کند. علاوه بر این، برای شناسایی دقیق گونه، تست‌های اضافی ضروری است و محیط برای تشخیص ویبریو کلرا مناسب نیست زیرا نیاز به pH قلیایی دارد. مشکلات عملی مانند رشد ضعیف ممکن است به دلیل pH نامناسب یا اتوکلاو بیش از حد رخ دهد.

تغییرات و محیط‌های مرتبط با مک کانکی

در نهایت، تغییرات و محیط‌های مرتبط با مک‌کانکی گزینه‌های بیشتری فراهم می‌کنند. مثلاً مک‌کانکی براث برای غنی‌سازی مایع، CLED آگار برای UTI با مهار کمتر پروتئوس، XLD آگار برای سالمونلا و شیگلا، یا EMB آگار با ائوزین و متیلن بلو برای تمایز مشابه. نکات عملی شامل اتوکلاو پسماند برای ایمنی، استفاده از دستکش و نگهداری دور از نور است. این محیط همچنان استاندارد طلایی برای انتروباکتریاسه باقی مانده و نقش حیاتی در تشخیص و تحقیق دارد.

نکات عملی و عیب‌یابی

نکات عملی و عیب‌یابی در استفاده از محیط کشت مک کانکی شامل موارد زیر است: رشد ضعیف ممکن است به دلیل pH نامناسب، اتوکلاو بیش از حد باشد. کلنی‌های غیرمعمول ممکن است ناشی از آلودگی یا انکوباسیون طولانی باشد. نگهداری باید دور از نور و با رطوبت کم انجام شود. ایمنی شامل اتوکلاو پسماند و استفاده از دستکش است.

جهت مطالعه ی جامع در مورد کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی: راهنمای آموزشی کامل برای کارشناسان آزمایشگاه

سوالات متداول درباره محیط کشت مک کانکی

محیط کشت مک کانکی چیست؟

محیط کشت مک کانکی یک محیط انتخابی و تمایزی برای باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای است که رشد گرم‌مثبت‌ها را مهار می‌کند.

ترکیبات اصلی محیط کشت مک کانکی کدامند؟

ترکیبات شامل پپتون، لاکتوز، نمک‌های صفراوی، کریستال ویولت، نوترال رد و آگار است.

اصول کار محیط مک کانکی چگونه است؟

مهار گرم‌مثبت‌ها با نمک‌های صفراوی و کریستال ویولت، و تمایز بر اساس فرمنتاسیون لاکتوز با تغییر رنگ.

چگونه محیط مک کانکی تهیه می‌شود؟

پودر را در آب حل کنید، اتوکلاو کنید، خنک کنید و در پلیت بریزید.

کاربردهای محیط مک کانکی چیست؟

تشخیص عفونت‌های ادراری، بررسی مدفوع، کنترل کیفیت آب و غذا.

چگونه نتایج روی محیط مک کانکی تفسیر می‌شود؟

کلنی‌های صورتی: فرمنت‌کننده لاکتوز؛ بی‌رنگ: غیرفرمنت‌کننده.

مزایای محیط مک کانکی چیست؟

انتخابی قوی، تمایز آسان، ارزان و ساده.

محدودیت‌های محیط کشت مک کانکی کدامند؟

مهار ناکامل برخی باکتری‌ها، نیاز به تأیید بیشتر.

انواع محیط مک کانکی چیست؟

مانند مک کانکی با سوربیتول یا براث.

نکات ایمنی در استفاده از محیط مک کانکی چیست؟

اتوکلاو پسماند، استفاده از دستکش، نگهداری مناسب.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32491326/

https://asm.org/asm/media/protocol-images/macconkey-agar-plates-protocols.pdf