رنگ آمیزی اسید فست یک تکنیک مهم و کلیدی در میکروبیولوژی است که برای شناسایی باکتری‌هایی با ساختار دیواره سلولی خاص به کار می‌رود. این تکنیک بر پایه مقاومت این باکتری‌ها در برابر اسید و الکل (پس از رنگ‌پذیری) بنا شده است. به همین دلیل به آن‌ها باکتری‌های “اسید فست” (Acid-fast) گفته می‌شود. مهم‌ترین و شناخته‌شده‌ترین باکتری‌هایی که با این روش شناسایی می‌شوند، گونه‌های جنس مایکوباکتریوم (Mycobacterium) هستند، از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (عامل بیماری سل) و مایکوباکتریوم لپرا (عامل بیماری جذام).
اصول رنگ آمیزی اسید فست
دیواره سلولی باکتری‌های اسید فست دارای مقادیر بالایی از اسیدهای مایکولیک (Mycolic acids) است که یک لایه مومی و چرب ایجاد می‌کنند. این لایه نفوذپذیری دیواره را کاهش می‌دهد. به همین دلیل، برای رنگ‌آمیزی این باکتری‌ها از روش‌های معمول (مانند رنگ‌آمیزی گرم) نمی‌توان استفاده کرد. اصول این رنگ‌آمیزی به سه مرحله اصلی تقسیم می‌شود:
- رنگ‌آمیزی اولیه: در این مرحله، از یک رنگ پایه قوی و چربی‌دوست مانند کربول فوشین (Carbol Fuchsin) استفاده می‌شود. این رنگ با گرمادهی یا افزایش زمان تماس، به داخل دیواره مومی باکتری نفوذ کرده و سلول‌ها را به رنگ قرمز یا صورتی در می‌آورد.
- رنگ‌بری: پس از رنگ‌آمیزی، نمونه با محلول الکل-اسید (Acid-alcohol) شستشو داده می‌شود. باکتری‌های اسید فست به دلیل وجود اسیدهای مایکولیک، رنگ را به خود نگه می‌دارند (مقاوم در برابر رنگ‌بری) در حالی که باکتری‌های دیگر (غیر اسید فست) رنگ خود را از دست می‌دهند.
- رنگ‌آمیزی ثانویه: در این مرحله، از یک رنگ مکمل مانند متیلن بلو (Methylene Blue) یا مالاکیت گرین (Malachite Green) استفاده می‌شود تا باکتری‌های رنگ‌بری شده و سلول‌های زمینه را به رنگ آبی یا سبز درآورد.
روش‌ها و تکنیک‌ها
۱. روش زیل-نلسن (Ziehl-Neelsen) (روش گرم)
این روش، قدیمی‌ترین و متداول‌ترین تکنیک است و شامل مراحل زیر می‌شود:
- تهیه اسمیر: نمونه (مانند خلط) را روی لام شیشه‌ای نازک کرده و با حرارت فیکس می‌کنیم.
- رنگ‌آمیزی با کربول فوشین: لام را با کربول فوشین پوشانده و با استفاده از شعله چراغ بونزن به آرامی حرارت می‌دهیم (بخار ملایم). این کار را به مدت ۵ دقیقه انجام می‌دهیم، بدون اینکه محلول بجوشد.
- شستشو: لام را با آب مقطر می‌شوییم تا رنگ اضافی پاک شود.
- رنگ‌بری: لام را با محلول الکل-اسید (۳٪ اسید هیدروکلریک در ۹۵٪ اتانول) به مدت ۳۰ ثانیه می‌شوییم تا رنگ اضافی پاک شود.
- شستشو: مجدداً با آب مقطر می‌شوییم.
- رنگ‌آمیزی ثانویه: لام را با محلول متیلن بلو به مدت ۱ دقیقه می‌پوشانیم.
- شستشو و خشک کردن: لام را می‌شوییم، خشک می‌کنیم و زیر میکروسکوپ با عدسی ۱۰۰ (روغن ایمرژن) مشاهده می‌کنیم.
- در زیر میکروسکوپ، باکتری‌های اسید فست به صورت میله‌های نازک به رنگ قرمز یا صورتی روشن و معمولاً به صورت خوشه‌ای یا منفرد دیده می‌شوند. سلول‌ها و باکتری‌های دیگر (مانند باکتری‌های دهانی) به رنگ آبی یا سبز مشاهده می‌شوند.
رنگ آمیزی اسید فست
۲. روش کین یون (Kinyoun) (روش سرد)
این روش نیاز به حرارت ندارد و برای آزمایشگاه‌هایی که تجهیزات حرارتی ندارند مناسب است. در این روش، غلظت کربول فوشین بیشتر است تا بدون حرارت هم بتواند به دیواره نفوذ کند.
مراحل مشابه روش زیل-نلسن است با این تفاوت که به جای حرارت دادن، لام را با کربول فوشین به مدت ۱۰-۲۰ دقیقه می‌پوشانند.
۳. روش فلورسنت (Auramine-Rhodamine)
در برخی آزمایشگاه‌ها از رنگ‌های فلورسنت مانند اورامین O یا رودامین B استفاده می‌شود. مشاهده با میکروسکوپ فلورسنت سریع‌تر و حساس‌تر است. باکتری‌های اسید فست به رنگ زرد یا نارنجی فلورسنت دیده می‌شوند.
کنترل کیفی رنگ آمیزی اسید فست و تفسیر نتایج
- کنترل مثبت: برای اطمینان از عملکرد صحیح رنگ‌ها، همیشه باید از یک نمونه باکتری اسید فست شناخته‌شده (مانند مایکوباکتریوم سمگما تیس) به عنوان کنترل مثبت استفاده کرد. این نمونه باید به رنگ قرمز یا صورتی دیده شود.
- کنترل منفی: از نمونه باکتری غیر اسید فست (مانند اشرشیا کلی) به عنوان کنترل منفی استفاده می‌شود. این نمونه باید به رنگ آبی یا سبز (رنگ ثانویه) دیده شود.
- تفسیر نتایج: در زیر میکروسکوپ، باکتری‌های اسید فست به صورت میله‌های نازک به رنگ قرمز یا صورتی روشن و معمولاً به صورت خوشه‌ای یا منفرد دیده می‌شوند. سلول‌ها و باکتری‌های دیگر (مانند باکتری‌های دهانی) به رنگ آبی یا سبز مشاهده می‌شوند.
جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی میکروبیولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:
کنترل کیفی میکروب شناسی: اصول، روش‌ها و استانداردهای عملکردی
کاربردهای رنگ آمیزی اسید فست
رنگ آمیزی اسید فست یکی از مهم‌ترین تست‌های تشخیصی برای بیماری‌های زیر است:
- سل (TB): از این روش برای تشخیص سریع و اولیه باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در نمونه‌های خلط استفاده می‌شود. این روش به عنوان یک ابزار غربالگری سریع بسیار کارآمد است.
- جذام: تشخیص باکتری مایکوباکتریوم لپرا در نمونه‌های بیوپسی پوست.
- تشخیص عفونت‌های ناشی از مایکوباکتریوم‌های غیرتوبرکلوزیس (NTM): این باکتری‌ها می‌توانند باعث عفونت‌های ریوی و سایر بیماری‌ها شوند.
- نظارت بر درمان: می‌توان از این روش برای ارزیابی کاهش تعداد باکتری‌ها در طول درمان استفاده کرد.
تهیه محلول‌ها
- محلول کربول فوشین: کربول فوشین پایه: فوشین بازی (basic fuchsin) + اتانول. محلول نهایی: کربول فوشین پایه + محلول فنل در آب مقطر.
- محلول الکل-اسید: ۳ میلی‌لیتر اسید هیدروکلریک غلیظ + ۹۷ میلی‌لیتر اتانول ۹۵٪.
- محلول متیلن بلو: متیلن بلو + آب مقطر.
نکات ایمنی: هنگام کار با این محلول‌ها، به ویژه فنل و اسید، حتماً از دستکش و عینک ایمنی استفاده کنید. همچنین، فیکس کردن نمونه با حرارت باید با دقت و در مکانی با تهویه مناسب انجام شود تا از انتشار باکتری‌ها جلوگیری شود.
محدودیت‌ها
- این روش نسبت به روش‌های مولکولی (PCR) و کشت حساسیت کمتری دارد و نیاز به حداقل ۱۰⁴ باکتری در هر میلی‌لیتر خلط برای مثبت شدن دارد.
- برخی باکتری‌های غیر بیماری‌زا مانند Nocardia نیز ممکن است اسید فست ضعیف باشند و منجر به مثبت کاذب شوند.
- منفی بودن رنگ‌آمیزی اسید فست همیشه به معنی排سل بودن بیمار نیست.
اهمیت نمونه‌گیری صحیح
- بهترین نمونه برای تشخیص سل: خلط صبحگاهی ناشتا است.
- حداقل ۲ تا ۳ نمونه در روزهای متوالی باید بررسی شود.
- نمونه باید در ظروف استریل جمع‌آوری و سریعاً به آزمایشگاه منتقل شود.
نکات کلیدی برای یادگیری
- باکتری‌های اسید فست = قرمز/صورتی؛ سایر سلول‌ها = آبی/سبز.
- روش زیل–نلسن = با حرارت؛ روش کین‌یون = بدون حرارت.
- روش فلورسنت = سریع‌تر و حساس‌تر.
- حداقل تعداد لازم برای مشاهده مثبت: ۱۰⁴ باکتری در هر میلی‌لیتر.
نتیجه‌گیری
رنگ آمیزی اسید فست یک ابزار حیاتی و مقرون به صرفه برای تشخیص سریع بیماری‌های مهمی مانند سل و جذام است. درک صحیح اصول، روش‌ها و کنترل کیفی آن برای هر متخصص آزمایشگاهی ضروری است. با اینکه روش‌های جدید مولکولی برای تشخیص سریع‌تر در دسترس هستند، اما رنگ آمیزی اسید فست همچنان به عنوان یک روش تشخیصی اولیه و مهم در بسیاری از نقاط جهان به ویژه در آزمایشگاه‌های با منابع محدود، کاربرد گسترده‌ای دارد.