روش رنگ آمیزی رایت گیمسا (Wright-Giemsa Staining Method): آموزش کامل مراحل، نکات و کنترل کیفی
روش رنگ آمیزی رایت گیمسا به این شرح است که ابتدا لام خون محیطی با متانول فیکس میشود، سپس رنگ آماده Wright-Giemsa روی آن ریخته و پس از چند دقیقه با بافر pH 6.8 ترکیب می‌گردد. پس از واکنش رنگ و شستشو با آب مقطر، سلولهای خونی زیر میکروسکوپ با وضوح بالا مشاهده می‌شوند. این روش استانداردترین روش رنگآمیزی در هماتولوژی است که برای بررسی مورفولوژی گلبول‌های قرمز، سفید و پلاکت‌ها به کار می‌رود.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education
فهرست مطالب
مقدمه و اهمیت رنگ آمیزی در هماتولوژی
در آزمایشگاه هماتولوژی، مشاهده‌ی دقیق سلولهای خونی یکی از ارکان اصلی تشخیص است. بدون رنگآمیزی مناسب، تفکیک سلولهای مختلف خون مانند نوتروفیل، لنفوسیت و منوسیت ممکن نیست. رنگآمیزی Wright-Giemsa از خانواده رنگ‌های Romanowsky بوده و به دلیل وضوح بالا و ثبات رنگی، به‌عنوان استاندارد طلایی برای رنگآمیزی لام خون محیطی و مغز استخوان استفاده میشود. هدف این روش، نمایش دقیق ساختار هسته، سیتوپلاسم و گرانول‌های سلولی برای تشخیص بیماری‌های خونی است.
اصول علمی روش رنگ آمیزی رایت گیمسا
رنگ Wright-Giemsa ترکیبی از دو رنگ بازی (Azure B و Methylene Blue) و یک رنگ اسیدی (Eosin Y) است. رنگ‌های بازی اجزای اسیدی سلول مانند DNA و RNA را آبی تا بنفش می‌کنند، در حالی که رنگ‌های اسیدی اجزای بازی مانند پروتئین‌های سیتوپلاسم را صورتی تا نارنجی می‌کنند. در pH حدود 6.8 هر دو رنگ فعال بوده و تضاد رنگی مطلوب بین هسته و سیتوپلاسم ایجاد میشود. تغییر در pH یا زمان تماس، باعث تغییر تون رنگ و افت کیفیت می‌گردد.
مواد و وسایل مورد نیاز در روش رنگ آمیزی رایت گیمسا
- رنگ آماده Wright-Giemsa (Ready-to-use commercial stain)
- بافر فسفات با pH = 6.8 ± 0.1
- متانول خالص (برای فیکس کردن)
- آب مقطر تازه
- لام شیشه‌ای تمیز و خشک
- تایمر، پیپت، ظرف رنگ و فیلتر رنگ (در صورت ته‌نشینی)
- میکروسکوپ نوری با عدسی 100× و روغن ایمرسیون
آماده‌سازی نمونه و لام در روش رنگآمیزی رایت گیمسا
برای دستیابی به نتیجه‌ای دقیق و قابل تفسیر، آماده‌سازی صحیح لام اهمیت زیادی دارد:
- از خون تازه حاوی EDTA استفاده کنید تا از ایجاد آرتیفکت جلوگیری شود.
- اسمیر نازک، یکنواخت و بدون خط یا حباب تهیه کنید.
- لام را در هوای آزاد خشک کنید و از حرارت مستقیم خودداری نمایید.
- پس از خشک شدن کامل، لام برای فیکساسیون آماده است.
لام باید نازک و گرادیانی باشد تا پس‌زمینه رنگآمیزی یکنواخت و بدون تجمع رنگ مشاهده شود.
مراحل انجام رنگآمیزی Wright-Giemsa (گام به گام)
- فیکساسیون: لام را در متانول خالص به مدت 1 تا 3 دقیقه غوطه‌ور کنید و سپس در هوا خشک کنید.
- افزودن رنگ آماده: لام افقی را روی سطح صاف قرار دهید و سطح اسمیر را به‌طور کامل با رنگ Wright-Giemsa بپوشانید.
- زمان رنگآمیزی: حدود 3 تا 5 دقیقه (مطابق دستور کارخانه).
- افزودن بافر: حجم مساوی از بافر pH 6.8 را به رنگ اضافه کنید و 5 تا 7 دقیقه اجازه دهید تا واکنش رنگآمیزی کامل شود.
- شستشو: لام را با جریان ملایم آب مقطر شستشو دهید تا رنگ اضافی حذف شود و زمینه شفاف گردد.
- خشک کردن: لام را به حالت مایل در محیط تمیز قرار دهید تا در هوا خشک شود.
- مشاهده: با عدسی 100× و روغن ایمرسیون، مورفولوژی سلولهای خونی را بررسی کنید.
رنگ آماده باید قبل از استفاده کاملاً هم زده شود و در صورت مشاهده ته‌نشینی، از صافی عبور داده شود.
نکات فنی و علمی هر مرحله از روش رنگآمیزی رایت گیمسا
- فیکساسیون: متانول باعث دناتوراسیون پروتئین‌ها و تثبیت ساختار سلول‌ها میشود. فیکس نکردن یا فیکس بیش از حد، تغییر شکل هسته یا تخریب غشاء را در پی دارد.
- بافر: pH عامل تعیین‌کننده است. در pH بالای 7، سلول‌ها بیش از حد آبی، و در pH پایین‌تر از 6.6، سیتوپلاسم قرمز دیده میشود.
- زمان رنگآمیزی: کوتاه بودن باعث کم‌رنگی، و زیاد بودن سبب تیرگی بیش از حد میشود.
- شستشو: باید یکنواخت و سریع باشد تا رنگ اضافی حذف شود و لکه باقی نماند.
- خشک‌کردن: در محیط خشک و بدون گرد و غبار انجام شود تا لکه‌های آب روی لام ایجاد نشود.
لام رنگ امیزی شده با رایت گیمسا
کنترل کیفی روش رنگ آمیزی رایت گیمسا
برای اطمینان از صحت عملکرد رنگ و کیفیت لام‌ها، کنترل کیفی دقیق الزامی است:
- استفاده از لام کنترل مثبت با رنگآمیزی مطلوب برای مقایسه نتایج هر روز.
- بررسی و ثبت pH بافر پیش از هر نوبت رنگآمیزی.
- استفاده از رنگ تازه و فیلترشده برای جلوگیری از رسوب و ذرات معلق.
- ثبت دقیق زمان تماس رنگ و بافر با لام.
- در صورت مشاهده‌ی تغییر در شدت رنگ یا پس‌زمینه، علت باید بررسی و اصلاح شود.
تغییرات جزئی در رنگ پس‌زمینه یا تیرگی هسته‌ها اغلب ناشی از تغییر pH یا زمان رنگآمیزی است و باید پیش از تکرار نمونه برطرف شود.
خطاهای رایج در روش رنگآمیزی رایت گیمسا و روش اصلاح آنها
| مشاهده میکروسکوپی | علت احتمالی | راه‌حل |
|---|---|---|
| RBC آبی یا خاکستری | pH بافر بالا یا زمان رنگ زیاد | تنظیم pH به 6.8 و کاهش زمان رنگآمیزی |
| RBC قرمز تیره | pH پایین یا شستشوی ناکافی | تنظیم pH و افزایش مدت تماس با بافر |
| هسته کم‌رنگ یا محو | رنگ کهنه یا زمان کوتاه | استفاده از رنگ تازه و افزایش زمان رنگآمیزی |
| پس‌زمینه بنفش یا کدر | شستشوی ناکافی یا خشک‌کردن نادرست | شستشوی مجدد با آب مقطر تمیز |
| لکه‌های رنگ یا دانه‌های آبی | ته‌نشینی رنگ یا تکان دادن شدید | فیلتر کردن رنگ و تکان ملایم قبل از استفاده |
| لکه‌های آب | خشک‌کردن در محیط مرطوب | خشک‌کردن در محیط خشک و تمیز |
ارزیابی کیفیت رنگآمیزی زیر میکروسکوپ
رنگآمیزی صحیح Wright-Giemsa ویژگی‌های مشخصی دارد که باید در تمام نمونه‌ها یکسان باشد:
- گلبول‌های قرمز: صورتی مایل به نارنجی با مرکز روشن.
- نوتروفیل: هسته بنفش تیره، سیتوپلاسم صورتی با گرانول‌های بنفش کم‌رنگ.
- لنفوسیت: هسته بنفش یکنواخت، سیتوپلاسم آبی روشن.
- ائوزینوفیل: سیتوپلاسم دارای گرانول‌های نارنجی–قرمز.
- بازوفیل: گرانول‌های بنفش تیره که ممکن است هسته را بپوشانند.
- پلاکت‌ها: آبی روشن با نقاط بنفش تیره.
کنترل کیفی داخلی و خارجی
- هر هفته یک اسمیر از خون تازه را رنگآمیزی کرده و با لام کنترل مقایسه کنید.
- تمام مشخصات شامل زمان، شماره رنگ، شماره بافر و وضعیت رنگآمیزی ثبت شود.
- در صورت استفاده از رنگ جدید، ابتدا روی لام کنترل تست انجام دهید.
- در برنامه‌های کنترل کیفی حارجی شرکت کنید تا تطابق رنگآمیزی بررسی شود.
رعایت کنترل کیفی منظم باعث پایداری نتایج مورفولوژیک و افزایش اعتماد به تفسیر نتایج هماتولوژیک میشود.
مقایسه رنگ Wright، Giemsa و Wright-Giemsa
| ویژگی | Wright | Giemsa | Wright-Giemsa |
|---|---|---|---|
| زمان رنگآمیزی | ۳–۵ دقیقه | ۱۰–۲۰ دقیقه | ۸–۱۰ دقیقه |
| وضوح هسته | متوسط | زیاد | بسیار زیاد |
| کاربرد اصلی | لام خون محیطی | انگل‌شناسی | کاربرد عمومی (خون و مغز استخوان) |
| رنگ سیتوپلاسم | صورتی | آبی–بنفش | متعادل طبیعی |
جمع‌بندی و نکات کلیدی در روش رنگ آمیزی رایت گیمسا
- pH بافر 6.8 مهم‌ترین عامل در کیفیت رنگآمیزی است.
- متانول خالص برای فیکساسیون ضروری است.
- از رنگ تازه و فیلترشده استفاده کنید.
- زمان تماس رنگ و بافر باید دقیق کنترل شود.
- خشک‌کردن لام در محیط تمیز و خشک انجام شود.
- تمام مراحل باید طبق دستورالعمل استاندارد انجام شود.
تسلط بر روش رنگآمیزی Wright-Giemsa از مهارت‌های پایه در هماتولوژی تشخیصی است و رعایت جزئیات کوچک در کیفیت نهایی تأثیر چشمگیری دارد.
مطالب مرتبط با کنترل کیفی آزمایشگاه
به منظور مطالعه‌ی جامع در مورد کنترل کیفی در بخش‌های مختلف آزمایشگاه به لینک‌های زیر مراجعه کنید:
سوالات متداول درباره روش رنگ آمیزی رایت گیمسا
۱. هدف از رنگآمیزی رایت گیمسا چیست؟
هدف اصلی این روش، مشاهده و تشخیص دقیق ساختارهای سلولهای خونی مانند هسته، سیتوپلاسم و گرانول‌هاست.
۲. چرا از pH 6.8 برای بافر استفاده میشود؟
در این pH، تعادل بین رنگ‌های اسیدی و بازی برقرار است و بهترین تضاد رنگی بین اجزای سلول ایجاد میشود.
۳. تفاوت رنگ Wright و Giemsa چیست؟
رنگ Wright زمان کوتاه‌تری دارد، در حالی که رنگ Giemsa وضوح بالاتری برای هسته‌ها فراهم میکند. ترکیب آنها مزایای هر دو را دارد.
۴. چگونه می‌توان کیفیت رنگآمیزی را بررسی کرد؟
با مشاهده RBCها و WBCها در میکروسکوپ و مقایسه با لام کنترل می‌توان کیفیت رنگ را سنجید.
۵. شایعترین خطا در این روش چیست؟
تغییر pH بافر از محدوده استاندارد (6.8) و استفاده از رنگ کهنه از خطاهای متداول است.
۶. چه عواملی موجب ایجاد لکه در لام میشود؟
عدم فیلتر رنگ، خشک کردن در محیط مرطوب یا تکان دادن شدید لام.
۷. چه زمانی باید رنگ را تعویض کرد؟
هر سه ماه یک‌بار یا هنگام تغییر رنگ و ته‌نشینی قابل مشاهده.
۸. تفاوت رنگآمیزی در مغز استخوان و خون محیطی چیست؟
در مغز استخوان معمولاً زمان تماس رنگ بیشتر و شستشو ملایم‌تر است تا هسته‌ها واضح‌تر دیده شوند.
۹. چرا باید از متانول خالص استفاده کرد؟
متانول ساختار سلولی را تثبیت میکند و مانع از لیز شدن سلول‌ها میشود.
۱۰. آیا دمای محیط در رنگآمیزی تأثیر دارد؟
بله، دمای بالا سرعت واکنش را زیاد و خطر تیرگی رنگ را افزایش می‌دهد. بهترین دما حدود ۲۵ درجه سانتی‌گراد است.
منابع معتبر برای مطالعه بیشتر