«آزمایش ویدال»
تست ویدال یک تست سرولوژیک مبتنی بر آگلوتیناسیون برای کمک به تشخیص تب حصبه (تیفوئید) و شبهحصبه (پاراتیفوئید) است. این آزمون با سنجش آنتیبادیهای ضد آنتیژنهای O و H سالمونلا (بهویژه S. Typhi و S. Paratyphi) انجام میشود و میتواند بهصورت کیفی (روش اسلایدی) یا کمی (روش لولهای با تعیین تیتر) گزارش شود. استفاده از تفسیر بالینی مناسب، کنترل کیفی، و در نظر گرفتن سابقه واکسیناسیون برای جلوگیری از نتایج کاذب ضروری است.
فهرست مطالب
تست ویدال: راهنمای کامل روش انجام و تفسیر نتایج
تست ویدال (Widal test)، یک آزمایش سرولوژی است که برای تشخیص بیماری حصبه (تیفوئید) و شبهحصبه (پاراتیفوئید) به کار میرود. این تست با شناسایی آنتیبادیهای خاص (′O′ و ′H′) در سرم خون بیمار، که در پاسخ به عفونت باکتریهای Salmonella Typhi و Salmonella Paratyphi تولید میشوند، عمل میکند.
این تست که اولین بار در سال ۱۸۹۶ توسط Georges-Fernand Widal ابداع شد، بر اساس اصل آگلوتیناسیون (agglutination) کار میکند. آگلوتیناسیون به معنی لخته یا کُپه شدن ذرات است؛ در این مورد، باکتریها وقتی با آنتیبادیهای مربوطه مخلوط میشوند، به هم میچسبند و توده ایجاد میکنند.
اصول و مکانیسم تست ویدال
• آنتیژن ′O′ (آنتیژن سوماتیک): این آنتیژن پایدار در برابر حرارت، روی دیواره سلولی باکتری قرار دارد. آنتیبادیهای ضد آنتیژن ′O′ معمولاً اولین آنتیبادیهایی هستند که پس از عفونت در خون بیمار ظاهر میشوند.
• آنتیژن ′H′ (آنتیژن فلاژلی): این آنتیژن حساس به حرارت، روی تاژک (ساختارهای دممانندی که به حرکت باکتری کمک میکنند) باکتری قرار دارد. آنتیبادیهای ضد آنتیژن ′H′ دیرتر ظاهر میشوند اما برای مدت طولانیتری در بدن باقی میمانند.
در آزمایشگاه، سرم خون بیمار با آنتیژنهای باکتریایی (باکتریهای کشته شده سالمونلا) که به طور خاص برای این آزمایش آماده شدهاند، مخلوط میشود. اگر سرم بیمار حاوی آنتیبادیهای مربوطه باشد، باکتریها آگلوتینه (به هم میچسبند) میشوند که با چشم قابل مشاهده است. این تست با استفاده از رقتهای مختلفی از سرم بیمار انجام میشود تا تیتر (titer) آنتیبادی مشخص شود. تیتر، بالاترین رقت سرمی است که هنوز واکنش قابل مشاهدهای را نشان میدهد. تیتر بالاتر (مثلاً 1:160 یا 1:320) نشاندهنده عفونت جدیتری است.
دستورالعمل استاندارد (SOP) انجام تست ویدال
روش آگلوتیناسیون لولهای (کمی)
مواد و معرفها:
• سرم بیمار
• سوسپانسیونهای آنتیژن ویدال (معمولاً آماده و تجاری، حاوی آنتیژنهای S. Typhi O، S. Typhi H، S. Paratyphi A و S. Paratyphi B)
• لولههای آزمایش
• سمپلر و سرسمپلر استریل
• محلول سرم فیزیولوژی (سالین)
• بن ماری با دمای ۳۷°C یا ۵۰-۵۵°C
مراحل انجام:
1. تهیه رقت سریالی از سرم بیمار. در تعدادی لوله آزمایش، رقتهای مختلفی مانند 1:20، 1:40، 1:80، 1:160 و… تهیه کنید. برای مثال، ۰/۵ میلیلیتر سالین به هر لوله اضافه کنید و سپس ۰/۵ میلیلیتر سرم به لوله اول اضافه کنید. خوب مخلوط کرده و ۰/۵ میلیلیتر از آن را به لوله بعدی منتقل کنید و این فرآیند را ادامه دهید.
برای تهیه دقیق رقت سریالی از سرم بیمار در تست ویدال، مراحل زیر را با جزئیات دنبال کنید:
آمادهسازی لولهها
- تعدادی لوله آزمایش تمیز و خشک را بردارید. تعداد لولهها بستگی به این دارد که میخواهید تا چه رقتی پیش بروید (مثلاً برای رقت تا 1:320 به 5 لوله نیاز دارید).
- به هر لوله، به جز لوله اول، ۰/۵ میلیلیتر (500 میکرولیتر) محلول سرم فیزیولوژی (سالین) اضافه کنید.
- لولهها را به ترتیب از 1 تا 5 (یا بیشتر) شمارهگذاری کنید تا از اشتباه جلوگیری شود.
- لوله 1: این لوله فقط برای شروع رقیقسازی است.
- لولههای 2 تا 5 (و…): حاوی 0/5 میلیلیتر سالین هستند.
مراحل رقیقسازی دقیق
- با استفاده از یک میکروپیپت استریل، ۰/۵ میلیلیتر (500 میکرولیتر) از سرم بیمار را بردارید.
- این ۰/۵ میلیلیتر سرم را به لوله دوم که حاوی ۰/۵ میلیلیتر سالین است، اضافه کنید. با این کار، رقت 1:2 (۰/۵ میلیلیتر سرم + ۰/۵ میلیلیتر سالین) ایجاد میشود.
- سرم و سالین را با دقت و به خوبی با پیپت کردن مکرر (چندین بار کشیدن و تخلیه کردن مایع) یا با ورتکس (Vortex) مخلوط کنید. این مرحله برای اطمینان از یکنواختی رقت بسیار مهم است
- سپس، با استفاده از یک نوک پیپت استریل جدید، ۰/۵ میلیلیتر از محلول موجود در لوله دوم را برداشته و آن را به لوله سوم که حاوی سالین است، منتقل کنید. با این کار، رقت 1:4 (نصف رقت قبلی) ایجاد میشود.
- مجدداً محتویات لوله سوم را به خوبی مخلوط کنید.
- همین روند را به صورت زنجیرهای ادامه دهید:
- ۰/۵ میلیلیتر از لوله سوم را به لوله چهارم منتقل کنید (رقت 1:8).
- ۰/۵ میلیلیتر از لوله چهارم را به لوله پنجم منتقل کنید (رقت 1:16)
این فرآیند را برای لولههای بعدی نیز ادامه دهید تا به رقتهای مورد نظر (1:20، 1:40، 1:80، 1:160 و…) برسید.
نکات مهم برای رقتهای استاندارد تست ویدال:
- در روش استاندارد تست ویدال (که از نسبت ۱:۲۰ شروع میشود)، معمولاً به هر لوله ۰/۲ میلیلیتر سالین اضافه میشود و ۰/۰۵ میلیلیتر سرم به لوله اول اضافه میشود.
- برای رسیدن به رقتهای مورد نظر (1:20, 1:40 و…) معمولاً لولههای مخصوص رقتسازی استفاده میشود که حجمهای مشخصی را دارند.
- برای سهولت کار، روشی که در آن ۱/۹ میلیلیتر سالین در هر لوله ریخته شده و ۰/۱ میلیلیتر سرم به لوله اول اضافه میشود نیز رایج است. سپس از محلول به دست آمده به لولههای بعدی منتقل میشود.
این مراحل، یک راهنمای کامل برای تهیه رقتهای دقیق و استاندارد در آزمایشهای سرولوژی مانند تست ویدال است. دقت در هر مرحله، به ویژه در حجمبرداری و مخلوط کردن، برای به دست آوردن نتایج صحیح حیاتی است.
2. افزودن آنتیژن. به هر لوله در یک مجموعه، یک قطره از سوسپانسیون آنتیژن خاص (مثلاً آنتیژن ′O′) اضافه کنید. این کار را برای هر نوع آنتیژن (S. Typhi O، S. Typhi H، S. Paratyphi A، S. Paratyphi B) تکرار کنید. یک لوله کنترل حاوی فقط سالین و آنتیژن نیز باید قرار داده شود.
3. انکوباسیون. لولهها را در دمای مناسب (معمولاً ۳۷°C برای آنتیژنهای ′H′ و ۵۰-۵۵°C برای آنتیژنهای ‘O’) به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوبه کنید.
4. خواندن نتایج. پس از انکوباسیون، لولهها را از نظر آگلوتیناسیون بررسی کنید. بالاترین رقتی که آگلوتیناسیون قابل مشاهدهای را نشان میدهد، تیتر محسوب میشود. نتیجه زمانی مثبت در نظر گرفته میشود که تیتر ≥ 1:80 یا 1:160 باشد، که این مقدار بسته به منطقه جغرافیایی و سابقه بالینی بیمار متفاوت است.
روش آگلوتیناسیون اسلایدی (کیفی)
مواد و معرفها:
• سرم بیمار
• سوسپانسیونهای آنتیژن ویدال
• اسلاید شیشهای مخصوص آزمایش
• میکروپیپت
مراحل انجام:
1. قرار دادن قطرات سرم. یک قطره از سرم رقیق نشده بیمار به همراه نمونه های کنترل مثبت و منفی را روی بخشهای مختلفی از اسلاید قرار دهید.
2. افزودن آنتیژن. یک قطره از هر سوسپانسیون آنتیژن (مثلاً آنتیژن ′O′) را به یک قطره جداگانه از سرم اضافه کنید.
3. مخلوط کردن و مشاهده. با استفاده از یک اپلیکاتور استریل، سرم و آنتیژن را مخلوط کرده و اسلاید را به آرامی برای حدود یک دقیقه بچرخانید.
4. خواندن نتایج. به دنبال لخته شدن فوری باشید. وجود آگلوتیناسیون یک نتیجه مثبت است و نشاندهنده وجود آنتیبادی است. اگر نتیجه مثبت مشاهده شد، برای تعیین تیتر دقیق باید آزمایش کمی (روش لولهای) انجام شود.
کنترل کیفی
• کنترلهای مثبت و منفی: هر سری از آزمایش باید شامل یک سرم کنترل مثبت (حاوی آنتیبادیهای شناختهشده با تیتر مشخص) و یک سرم کنترل منفی (بدون آنتیبادی) باشد.
o کنترل مثبت: باید در تیتر مورد انتظار، آگلوتیناسیون نشان دهد. اگر نتیجه آگلوتیناسیون کمتر یا بیشتر از تیتر مورد انتظار باشد، معرفها یا روش آزمایش مشکل دارند.
o کنترل منفی: نباید در هیچ یک از رقتها آگلوتیناسیون نشان دهد. هرگونه آگلوتیناسیون در این کنترل نشاندهنده آلودگی یا خرابی معرفها است.
• کنترل آنتیژن: یک لوله یا اسلاید کنترل باید حاوی آنتیژن و سالین (بدون سرم) باشد تا از آگلوتیناسیون خودبهخودی آنتیژن اطمینان حاصل شود. این کنترل نباید هیچگونه آگلوتیناسیونی داشته باشد.
• شرایط نگهداری: معرفها (آنتیژنها و سرمهای کنترل) باید طبق دستورالعمل سازنده در دمای مناسب (معمولاً ۲ تا ۸°C) و دور از نور نگهداری شوند.
• تاریخ انقضا: از تاریخ انقضای معرفها اطمینان حاصل کنید و هرگز از معرفهای منقضی شده استفاده نکنید.
• دمای انکوباتور و زمان انکوباسیون: اطمینان حاصل کنید که دمای حمام آب یا انکوباتور در محدوده صحیح بوده و زمان انکوباسیون به دقت رعایت شود.
تفسیر نتایج
• تیتر: یک آزمایش ویدال با تیتر پایین (مثلاً < 1:80) به تنهایی قطعی نیست. افزایش چهار برابری تیتر در نمونه دوم که یک هفته پس از نمونه اول گرفته میشود، شاخص بسیار قویتری برای عفونت فعال است.
• سابقه واکسیناسیون: افرادی که علیه حصبه واکسینه شدهاند یا سابقه عفونت قبلی دارند، ممکن است سطح آنتیبادی پایه داشته باشند که منجر به نتیجه مثبت کاذب شود.
• واکنش متقاطع (Cross-reactivity): آنتیبادیهای ضد سایر سروتیپهای سالمونلا یا حتی سایر عفونتهای باکتریایی (مانند مالاریا) گاهی اوقات به دلیل واکنش متقاطع، باعث مثبت شدن آزمایش ویدال میشوند.
• وضعیت بالینی: نتایج تست ویدال همیشه باید در بستر علائم بالینی بیمار (تب، سردرد، درد شکمی) و سایر آزمایشهای آزمایشگاهی تفسیر شود.
با وجود اینکه تست ویدال سالهاست به عنوان ابزاری ارزشمند شناخته میشود، حساسیت و اختصاصی بودن آن ایدهآل نیست. قابلیت اطمینان این تست تحت تأثیر عواملی مانند مرحله عفونت، مصرف قبلی آنتیبیوتیک، و وجود آنتیبادیهای متقاطع قرار دارد. بنابراین، تشخیصهای مدرن اغلب بر روشهای دقیقتر و حساستری مانند کشت خون (که استاندارد طلایی تشخیص است) یا تستهای مبتنی بر PCR تکیه میکنند. با این حال، تست ویدال به دلیل هزینه پایین و سادگی، همچنان در مناطق با منابع محدود به طور گستردهای استفاده میشود.
پرسشهای رایج در مورد تست ویدال
o آزمایش ویدال یک تست سرولوژی برای تشخیص بیماریهای حصبه و شبهحصبه است که با اندازهگیری آنتیبادیهای ضد باکتری سالمونلا در خون انجام میشود.
2. چه زمانی باید این آزمایش را انجام داد؟
o این آزمایش معمولاً در صورت وجود علائم بالینی مشکوک به حصبه مانند تب بالا و مداوم، سردرد شدید و درد شکمی، توسط پزشک تجویز میشود.
3. تیتر مثبت در تست ویدال به چه معناست؟
o تیتر مثبت به معنای وجود آنتیبادی در سطح بالا در خون است که میتواند نشاندهنده عفونت فعال باکتریایی باشد.
4. آیا نتیجه منفی به معنای عدم وجود حصبه است؟
o خیر، در مراحل اولیه عفونت ممکن است تیتر آنتیبادی هنوز به حد کافی نرسیده باشد. برای تأیید، ممکن است نیاز به تکرار آزمایش در هفته بعد باشد.
5. چرا باید دو نوع آنتیبادی (′O′ و ′H′) بررسی شود؟
o آنتیبادی ‘O’ زودتر ظاهر شده و نشاندهنده عفونت فعال است، در حالی که آنتیبادی ‘H’ دیرتر ظاهر شده و نشاندهنده عفونت قبلی یا فعلی طولانیمدت است. بررسی هر دو به تشخیص دقیقتر کمک میکند.
6. آیا واکسن حصبه میتواند نتیجه آزمایش را مثبت کند؟
o بله، واکسیناسیون قبلی میتواند منجر به وجود آنتیبادی در خون و در نتیجه تیتر مثبت در آزمایش شود.
7. آیا آنتیبیوتیک روی نتیجه تست تأثیر میگذارد؟
o بله، مصرف آنتیبیوتیک قبل از انجام آزمایش میتواند تولید آنتیبادی را مهار کرده و منجر به نتیجه منفی کاذب شود.
8. آیا تست ویدال ۱۰۰% دقیق است؟
o خیر، تست ویدال ممکن است دارای نتایج مثبت یا منفی کاذب باشد. به همین دلیل، پزشکان اغلب آن را همراه با سایر روشهای تشخیصی مانند کشت خون در نظر میگیرند.
9. چگونه برای آزمایش ویدال آماده شوم؟
o این آزمایش نیاز به آمادگی خاصی مانند ناشتا بودن ندارد. با این حال، باید پزشک خود را از هرگونه داروی مصرفی، به ویژه آنتیبیوتیکها، مطلع کنید.
10. بهترین روش برای تشخیص حصبه چیست؟
o استاندارد طلایی برای تشخیص حصبه، کشت خون است که در آن باکتری سالمونلا به طور مستقیم در نمونه خون شناسایی میشود.