سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز (۲-۵ درصد) چیست: یک محلول آزمایشگاهی حاوی ۳ درصد( 2-5 %) گلبول قرمز در سرم فیزیولوژی است که عمدتاً در تست‌های سرولوژی و بانک خون استفاده می‌شود.
روش تهیه سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز (۲-۵ درصد) برای تست کومبس به طور خلاصه به شرح زیر است: ابتدا گلبول های قرمز را ۳–۴ بار با سالین در 1000–1200g به مدت ۲–۳ دقیقه شست وشو دهید. سپس هر ۰٫۳ میلی لیتر سلول فشرده را با نرمال سالین تا حجم ۱۰ میلی لیتر برسانید تا سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز (۲-۵ درصد) حاصل شود. این سوسپانسیون در دمای ۲–۸ درجه سانتی گراد حداکثر ۲۴ ساعت قابل نگهداری است (ترجیحاً تازه مصرف شود).
فهرست مطالب
این راهنما به صورت مرحله به مرحله روش تهیه سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد) گلبول های قرمز برای تست آنتی گلوبولین ( کومبس) را شرح می دهد. هدف، ارائه دستورالعملی دقیق، استاندارد و کاربردی برای تکنسین های آزمایشگاهی است که ضمن رعایت اصول ایمنی زیستی، از خطاهای کاذب جلوگیری کند.
چرا سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد)؟
سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز(۲-۵ درصد) به دلیل ایجاد تعادل بین حساسیت و اختصاصیت در تست های کومبس ضروری است. این غلظت:
- توده سلولی قابل مشاهده ای برای تفسیر نتایج فراهم می کند.
- از مثبت کاذب (ناشی از سوسپانسیون غلیظ) یا منفی کاذب (ناشی از سوسپانسیون رقیق) جلوگیری می کند.
تعریف ۳٪ (v/v): حجم گلبول های فشرده (packed RBCs) باید ۳٪ از حجم کل سوسپانسیون باشد. فرمول: Vcells / Vtotal = 0.03
مواد و تجهیزات موردنیاز
- نمونه خون حاوی EDTA (برای DAT) یا سلول های دهنده/بیمار (برای IAT)
- سرم فیزیولوژی ایزوتونیک ۰٫۹٪ (Normal Saline)
- لوله های آزمایش شیشه ای (۱۲×۷۵ یا ۱۰×۷۵ میلی متر)
- سمپلر کالیبره شده یا پیپت مدرج
- سانتریفیوژ زاویه ثابت/افقی با قابلیت تنظیم دور (rpm) و زمان
- واشر سلولی (اختیاری)، رک لوله، ماژیک ضدآب
- تجهیزات ایمنی فردی: دستکش، گان، شیلد/عینک
- پارافیلم برای بستن درب لوله ها
ایمنی زیستی و دفع پسماند
- تمام نمونه های خون انسانی را بالقوه عفونی در نظر بگیرید و طبق استانداردهای BSL-2 عمل کنید.
- پسماندهای مایع را با هیپوکلریت ۱٪ غیرفعال کرده و در ظرف اختصاصی جمع آوری کنید.
- اقلام نوک تیز (مانند پیپت ها) را در سیفتی باکس دفع کنید.
- از تولید آئروسل هنگام باز کردن درپوش لوله های سانتریفیوژ جلوگیری کنید.
- محیط کار را قبل و بعد از فرآیند با ضدعفونی کننده مناسب تمیز کنید.
مراحل تهیه سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز (۲-۵ درصد)
مرحله ۱: شست وشوی گلبول های قرمز
شست وشوی کامل گلبول های قرمز برای حذف پروتئین های پلاسمایی (مانند IgG آزاد) ضروری است تا از نتایج منفی کاذب جلوگیری شود.
- انتقال نمونه: ۱–۲ میلی لیتر خون حاوی EDTA را به یک لوله آزمایش منتقل کنید.
- افزودن سرم فیزیولوژی: حجم لوله را با سرم فیزیولوژی ۰٫۹٪ تا ۱۰ میلی لیتر پر کنید و به آرامی مخلوط کنید.
- سانتریفیوژ: لوله را در دور ۱۰۰۰–۱۲۰۰ g (تقریباً ۳۰۰۰ rpm بسته به شعاع روتور) به مدت ۲–۳ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
- حذف سوپرناتانت: سوپرناتانت (مایع رویی) را به طور کامل با سمپلر یا پیپت حذف کنید. رسوب سلولی را با ضربه ملایم یکنواخت کنید.
- تکرار شست وشو: مراحل ۲–۴ را حداقل ۳ بار تکرار کنید تا سوپرناتانت کاملاً شفاف شود.
نکته: در تست DAT، شست وشوی کامل برای حذف IgG آزاد حیاتی است، زیرا پروتئین های باقیمانده می توانند آنتی هیومن گلوبولین (AHG) را خنثی کنند.
مرحله ۲: تهیه سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد)
- محاسبه و مخلوط کردن:
- ۰٫۳ میلی لیتر (۳۰۰ میکرولیتر) گلبول فشرده را به لوله ای حاوی ۹٫۷ میلی لیتر سرم فیزیولوژی منتقل کنید.
- فرمول: Vcells (۰٫۳ میلی لیتر) / Vtotal (۱۰ میلی لیتر) = ۰٫۰۳ (۳٪).
- مخلوط کردن: درب لوله را با پارافیلم ببندید و چند بار به آرامی سر و ته کنید تا سوسپانسیون یکنواخت شود.
- برچسب گذاری: روی لوله برچسب بزنید و اطلاعاتی مانند تاریخ، نام تهیه کننده، و نوع نمونه را ثبت کنید.
مرحله ۳: نگهداری و استفاده
- سوسپانسیون را در دمای ۲–۸ درجه سانتی گراد نگهداری کنید و حداکثر تا ۲۴ ساعت استفاده کنید (ترجیحاً تازه مصرف شود).
- در صورت مشاهده کدورت، تغییر رنگ، یا همولیز، سوسپانسیون را دور بریزید و نمونه جدیدی تهیه کنید.
کنترل کیفیت (Quality Control)
برای اطمینان از صحت سوسپانسیون و عملکرد آن:
تأیید غلظت:
- با میکروهماتوکریت یا دستگاه شمارشگر سلولی، هماتوکریت سوسپانسیون را بررسی کنید (باید حدود ۳٪ ± ۰٫۵٪ باشد).
- روش دستی: ۵۰ میکرولیتر از سوسپانسیون را در لوله هماتوکریت سانتریفیوژ کنید و هماتوکریت را محاسبه کنید.
مستندسازی:
نتایج کنترل کیفیت را در دفترچه ثبت آزمایشگاه (Logbook) ثبت کنید.
خطاهای احتمالی و راهکارها
| خطا | علت احتمالی | راهکار |
|---|---|---|
| منفی کاذب | شست وشوی ناکافی، باقی ماندن IgG آزاد | حداقل ۳–۴ بار شست وشو با سرم فیزیولوژی و حذف کامل سوپرناتانت |
| مثبت کاذب | سوسپانسیون بیش از حد غلیظ | اندازه گیری دقیق حجم سلول ها با میکروپیپت و تأیید با هماتوکریت |
| همولیز گلبول ها | شست وشوی خشن یا سرم غیرایزوتونیک | استفاده از سرم فیزیولوژی ۰٫۹٪ و مخلوط کردن ملایم |
| نتایج غیرقابل اعتماد | نمونه قدیمی یا آلوده | استفاده از نمونه تازه (کمتر از ۲۴ ساعت) و بررسی کدورت سوسپانسیون |
شرایط خاص
گلبول های پوشش دار (Coated RBCs):
در بیماران با آنمی همولیتیک خودایمن، شست وشوی بیش از حد ممکن است آنتی بادی های سطحی را حذف کند. شست وشو را ۳ بار با سرم فیزیولوژی سرد (۴ درجه سانتی گراد) انجام دهید.
گلبول های شکننده (مانند تالاسمی یا کم خونی داسی شکل):
از سانتریفیوژ با دور کمتر (۸۰۰–۱۰۰۰ g) و زمان کوتاه تر (۱–۲ دقیقه) استفاده کنید.
نمونه های قدیمی:
نمونه های بیش از ۴۸ ساعت ممکن است کیفیت لازم را نداشته باشند. از نمونه های تازه (کمتر از ۲۴ ساعت) استفاده کنید.
روش های جایگزین (در صورت عدم دسترسی به تجهیزات)
ته نشینی طبیعی:
خون را با سرم فیزیولوژی مخلوط کنید و ۳۰–۶۰ دقیقه صبر کنید تا گلبول ها ته نشین شوند. سوپرناتانت را حذف کرده و فرآیند را ۲–۳ بار تکرار کنید.
محدودیت: زمان بر و دقت کمتر.
استفاده از سرنگ مدرج:
در صورت نبود سمپلر، از سرنگ های مدرج با دقت بالا برای اندازه گیری ۰٫۳ میلی لیتر گلبول فشرده استفاده کنید.
توصیه های آموزشی
- آموزش عملی پرسنل: تکنسین ها باید در استفاده از سمپلر، تنظیم سانتریفیوژ، و رعایت ایمنی زیستی آموزش ببینند.
- بازآموزی دوره ای: هر ۶ ماه جلسات بازآموزی برای به روزرسانی دانش پرسنل برگزار شود.
- مستندسازی: تمام مراحل و نتایج کنترل کیفیت باید در دفترچه آزمایشگاه ثبت شود.
منابع برای مطالعه بیشتر:
جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید:
نتیجه گیری
این روش با رعایت استانداردهای آزمایشگاهی، دقت و ایمنی را در تهیه سوسپانسیون ۳٪ گلبول های قرمز (۲-۵ درصد) تضمین می کند. کنترل کیفیت، توجه به شرایط خاص، و آموزش پرسنل از عوامل کلیدی در موفقیت تست های کومبس هستند. برای بهترین نتایج، همیشه از نمونه های تازه و تجهیزات کالیبره شده استفاده کنید.
سوالات رایج
۱. چرا باید از سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد) گلبول های قرمز استفاده کنیم؟
سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد) گلبول های قرمز تعادل مناسبی بین حساسیت و اختصاصیت در تست های کومبس ایجاد می کند. غلظت های بالاتر ممکن است باعث نتایج مثبت کاذب و غلظت های پایین تر ممکن است منجر به نتایج منفی کاذب شوند.
۲. آیا می توان از سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد) گلبول های قرمز برای مدت طولانی استفاده کرد؟
خیر، این سوسپانسیون حداکثر تا ۲۴ ساعت در دمای ۲–۸ درجه سانتی گراد قابل نگهداری است و ترجیحاً باید بلافاصله پس از تهیه استفاده شود.
۳. چرا شست وشوی گلبول های قرمز اینقدر مهم است؟
شست وشوی کامل برای حذف پروتئین های پلاسمایی (مانند IgG آزاد) ضروری است زیرا این پروتئین ها می توانند آنتی هیومن گلوبولین (AHG) را خنثی کرده و باعث نتایج منفی کاذب شوند.
۴. چگونه می توان از صحت غلظت ۳٪ (۲-۵ درصد) اطمینان حاصل کرد؟
با استفاده از میکروهماتوکریت یا دستگاه شمارشگر سلولی می توان هماتوکریت سوسپانسیون را بررسی کرد که باید حدود ۳٪ ± ۰٫۵٪ باشد.
۵. چه زمانی باید سوسپانسیون ۳٪ (۲-۵ درصد) گلبول های قرمز را دور بریزیم؟
در صورت مشاهده کدورت، تغییر رنگ، یا همولیز باید سوسپانسیون را دور ریخته و نمونه جدیدی تهیه کنید.
۶. آیا برای نمونه های خاص مانند تالاسمی روش متفاوتی نیاز است؟
بله، برای گلبول های شکننده مانند تالاسمی یا کم خونی داسی شکل باید از سانتریفیوژ با دور کمتر (۸۰۰–۱۰۰۰ g) و زمان کوتاه تر (۱–۲ دقیقه) استفاده کنید.
۷. چرا باید از سرم فیزیولوژی سرد برای گلبول های پوشش دار استفاده کنیم؟
در بیماران با آنمی همولیتیک خودایمن، استفاده از سرم فیزیولوژی سرد (۴ درجه سانتی گراد) از جدا شدن آنتی بادی های سطحی از گلبول های قرمز جلوگیری می کند.
۸. اگر سمپلر در دسترس نباشد چه کار می توان کرد؟
در صورت عدم دسترسی به سمپلر، می توان از سرنگ های مدرج با دقت بالا برای اندازه گیری ۰٫۳ میلی لیتر گلبول فشرده استفاده کرد.
۹. چگونه می توان از عدم تولید آئروسل اطمینان حاصل کرد؟
با باز کردن آرام درپوش لوله های سانتریفیوژ و استفاده از تجهیزات ایمنی مناسب مانند شیلد یا عینک می توان از تولید آئروسل جلوگیری کرد.
۱۰. چرا کنترل کیفیت اینقدر مهم است؟
کنترل کیفیت از صحت نتایج آزمایش اطمینان حاصل می کند و از خطاهای کاذب که می توانند منجر به تشخیص نادرست و درمان نامناسب شوند، جلوگیری می کند.