جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education
فهرست مطالب مقاله آزمایش PYR
۱. مقدمه و کاربرد آزمایش PYR در میکروبشناسی
در دنیای میکروبشناسی بالینی، سرعت و دقت در تشخیص افتراقی باکتریها نقشی حیاتی در مدیریت درمان بیماران ایفا میکند. آزمایش PYR (ال-پیرولیدونیل آریلآمیداز) یکی از کاربردیترین تستهای بیوشیمیایی است که به دلیل حساسیت و ویژگی بالایی که دارد، جایگزین بسیاری از روشهای زمانبر قدیمی شده است.
تست PYR یک آزمایش کیفی سریع برای شناسایی آنزیم L-pyrrolidonyl arylamidase است. این آزمایش بهطور اختصاصی برای تفکیک گونههای خاصی از باکتریهای گرم مثبت کاتالاز منفی (Catalase-negative) استفاده میشود. کاربرد اصلی آن در دو مورد زیر خلاصه میشود:
- شناسایی قطعی استرپتوکوک پیوژنز (Streptococcus pyogenes یا Group A Strep).
- شناسایی گونههای انتروکوک (Enterococcus spp. یا Group D Enterococci).
برای درک بهتر جایگاه تست PYR در الگوریتمهای تشخیصی، مطالعه راهنمای جامع رنگآمیزی گرم توصیه میشود:
۲. تاریخچه و تحول تست ال-پیرولیدونیل آریلآمیداز
این آزمایش اولین بار در دهه ۱۹۸۰ به عنوان روشی جایگزین برای تستهای طولانی مانند هیدرولیز اسکولین در حضور صفرا (Bile Esculin) یا تست مقاومت به باسیتراسین (Bacitracin susceptibility) معرفی شد. پیش از این، شناسایی استرپتوکوک گروه A حدود ۲۴ ساعت زمان میبرد، اما با ابداع روش PYR، این زمان به کمتر از ۱۰ دقیقه کاهش یافت.
۳. اصول بیوشیمیایی آزمایش PYR (Principle)
اساس این آزمایش بر پایه هیدرولیز سوبسترای اختصاصی L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide توسط آنزیم ال-پیرولیدونیل آریلآمیداز است.
- آنزیم باکتری، سوبسترا را تجزیه کرده و محصولی به نام L-pyrrolidone و Beta-naphthylamine آزاد میکند.
- با افزودن معرف آشکارساز (PYR Reagent یا cinnamaldehyde)، این ماده با بتا-نفتیلآمین ترکیب شده و یک کمپلکس قرمز/صورتی ایجاد میکند.
در کنار تست PYR، تست کاتالاز اولین قدم در تشخیص استرپتوکوکها است. راهنمای کنترل کیفی آن را اینجا بخوانید:
۴. مواد و تجهیزات مورد نیاز جهت انجام آزمایش PYR
- دیسک یا نوار PYR: آغشته به سوبسترای L-pyrrolidonyl-β-naphthylamide.
- معرف رنگزا (Reagent): محلول p-dimethylaminocinnamaldehyde.
- اپلیکاتور یا لوپ آنست (Inoculating Loop).
- آب مقطر استریل یا سرم فیزیولوژی.
- سمپلر (Micropipette) جهت برداشت دقیق مایعات.
دقت در نتایج میکروبشناسی به کالیبراسیون ابزار بستگی دارد. دستورالعمل لوپهای میکروبی را بررسی کنید:
۵. روش انجام آزمایش (Procedure) به صورت گامبهگام
این آزمایش معمولاً به روش دیسک (Disk Method) انجام میشود که مراحل آن به شرح زیر است:
- یک دیسک PYR را روی یک لام تمیز یا پتریدیش قرار دهید.
- با استفاده از یک سمپلر، دیسک را با مقدار بسیار کمی آب مقطر استریل مرطوب کنید (خیس نکنید، فقط مرطوب شود).
- با استفاده از لوپ، مقدار کافی از کلونیهای (Colonies) تازه (۱۸ تا ۲۴ ساعته) را از روی محیط کشت (ترجیحاً بلاد آگار) برداشته و روی دیسک بمالید.
- به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق (یا طبق دستورالعمل سازنده) صبر کنید تا واکنش آنزیمی رخ دهد.
- یک قطره از معرف PYR را روی دیسک بریزید و نتیجه را در عرض ۱ دقیقه مشاهده کنید.
۶. تفسیر نتایج آزمایش PYR و تشخیص افتراقی
تفسیر نتایج بر اساس تغییر رنگ در محل حضور کلونیها انجام میشود:
- نتیجه مثبت (Positive): ظهور رنگ صورتی تیره تا قرمز گیلاسی (Cherry Red) در محل تلقیح باکتری.
- نتیجه منفی (Negative): عدم تغییر رنگ یا ایجاد رنگ زرد/نارنجی (مربوط به رنگ خود معرف).
جدول تشخیص افتراقی با تست PYR:
| نام میکروارگانیسم | نتیجه تست PYR |
|---|---|
| Streptococcus pyogenes (GAS) | مثبت (+) |
| Enterococcus spp. | مثبت (+) |
| Streptococcus agalactiae (GBS) | منفی (-) |
| Streptococcus bovis group | منفی (-) |
برای تشخیص دقیقتر باکتریهای گرم مثبت، مطالعه تست کواگولاز نیز ضروری است:
۷. کنترل کیفی (Quality Control) آزمایش PYR
برای اطمینان از صحت عملکرد دیسک و معرف در آزمایشگاه، استفاده از سویههای استاندارد (ATCC) الزامی است:
- کنترل مثبت (Positive Control): استفاده از باکتری Enterococcus faecalis (ATCC 29212) – ایجاد رنگ قرمز.
- کنترل منفی (Negative Control): استفاده از باکتری E. coli (ATCC 25922) – عدم تغییر رنگ.
مباحث کنترل کیفی در میکروبشناسی فراتر از یک تست ساده است. این مقاله جامع را از دست ندهید:
۸. نکات مهم و محدودیتهای آزمایشگاهی در تست PYR
- خالص بودن کشت: تست باید حتماً روی کلونیهای خالص انجام شود؛ آلودگی با سایر باکتریها نتایج گمراهکننده ایجاد میکند.
- رطوبت دیسک: اگر دیسک با استفاده از سمپلر بیش از حد خیس شود، غلظت محصول نهایی واکنش کاهش یافته و ممکن است نتیجه منفی کاذب (False Negative) شود.
- تفسیر رنگ: رنگهای نارنجی، زرد یا صورتی بسیار کمرنگ باید منفی تلقی شوند. فقط رنگ قرمز واضح نشاندهنده واکنش مثبت است.
- باکتریهای کاتالاز مثبت: برخی از استافیلوکوکها (مانند S. lugdunensis) نیز PYR مثبت هستند؛ بنابراین این تست فقط برای باکتریهای کاتالاز منفی ارزش تشخیصی در پروتکل استرپتوکوکها را دارد.
- محیط کشت: استفاده از کلونیهایی که روی محیطهای حاوی قند بالا رشد کردهاند، ممکن است باعث تداخل در واکنش شیمیایی شود.
تست اکسیداز یکی دیگر از آزمایشهای سریع و حیاتی در کنار PYR است. راهنمای آن را اینجا بخوانید:
۹. سوالات متداول درباره آزمایش PYR
۱. آزمایش PYR چقدر زمان میبرد؟
این آزمایش بسیار سریع است؛ زمان انکوباسیون دیسک حدود ۲ دقیقه و ظهور رنگ پس از افزودن معرف کمتر از ۱ دقیقه زمان میبرد.
۲. آیا میتوان از تست PYR برای تشخیص استرپتوکوک گروه B استفاده کرد؟
خیر، استرپتوکوک گروه B (S. agalactiae) در این آزمایش منفی است و این تست دقیقاً برای تفکیک آن از گروه A استفاده میشود.
۳. چرا برای مرطوب کردن دیسک باید از سمپلر استفاده کرد؟
استفاده از سمپلر باعث میشود حجم آب اضافه شده کاملاً کنترل شده باشد تا از اشباع شدن دیسک و منفی کاذب جلوگیری شود.
۴. اگر رنگ دیسک نارنجی شد، نتیجه چیست؟
رنگ نارنجی یا زرد کمرنگ ناشی از خودِ معرف بوده و نتیجه آزمایش “منفی” گزارش میشود.
۵. سوبسترای اصلی در دیسک PYR چیست؟
سوبسترای اصلی L-pyrrolidonyl-beta-naphthylamide است.
۶. کدام سویه برای کنترل مثبت تست PYR توصیه میشود؟
سویه استاندارد Enterococcus faecalis (ATCC 29212) مناسبترین گزینه است.
۷. آیا باکتریهای کاتالاز مثبت هم میتوانند PYR مثبت باشند؟
بله، برخی گونههای استافیلوکوک مانند S. lugdunensis مثبت هستند، لذا تست حتماً باید روی کاتالاز منفیها انجام شود.
۸. چرا استفاده از کلونیهای تازه (۱۸-۲۴ ساعته) مهم است؟
زیرا فعالیت آنزیمی در باکتریهای جوان در حداکثر میزان خود قرار دارد و دقت تست بالا میرود.
۹. نام معرف آشکارساز در آزمایش PYR چیست؟
معرف حاوی p-dimethylaminocinnamaldehyde است.
۱۰. آیا این تست جایگزین تست باسیتراسین شده است؟
بله، در بسیاری از آزمایشگاههای مرجع به دلیل سرعت و اختصاصیت بالاتر، جایگزین دیسک باسیتراسین شده است.