آزمایش شکنندگی اسمزی (Osmotic Fragility Test) — اصول، روش انجام و تفسیر نتایج

آزمایش شکنندگی اسمزی (Osmotic Fragility Test – OF): مقاله جامع، پروتکل عملی و تفسیر نتایج

آزمایش شکنندگی اسمزی (Osmotic Fragility Test) معیار مقاومت گلبول‌های قرمز در برابر همولیز در محیط‌های هیپوتونیک است. این آزمون به‌ویژه در تشخیص اسفروسیتوز ارثی، افتراق تالاسمی از دیگر آنمی‌ها و بررسی یکپارچگی غشای RBC کاربرد دارد. در این مقاله پروتکل عملی، نحوه تهیه محلول‌ها، محاسبات، انکوباسیون، خوانش اسپکتروفتومتریک و نکات کیفیت و تفسیر نتایج به‌صورت کامل و مرحله‌به‌مرحله آمده است.

🚀 عضویت در کانال آموزشی تلگرام

مقدمه — معرفی آزمایش شکنندگی اسمزی

آزمایش شکنندگی اسمزی (Osmotic Fragility) آزمونی کلاسیک در هماتولوژی است که میزان مقاومت گلبول‌های قرمز (RBCs) را در برابر همولیز در محیط‌های هیپوتونیک می‌سنجد. در شرایطی که غلظت نمک (NaCl) اطراف سلول کاهش یابد، آب از محیط به داخل سلول وارد می‌شود و در نتیجه حجم سلول افزایش می‌یابد. اگر کاهش غلظت نمک زیاد باشد، غشای سلول قادر به تحمل کشش نخواهد بود و سلول دچار همولیز می‌شود. میزان مقاومت سلول در برابر این تغییرات به ساختار و انعطاف‌پذیری غشای RBC بستگی دارد. هرگونه تغییر در شکل سلول (مانند اسفروسیتوز یا تالاسمی) موجب تغییر در شکنندگی اسموتیک می‌گردد.

اصول آزمایش شکنندگی اسمزی— فیزیولوژی و مکانیزم همولیز اسموتیک

در آزمایش شکنندگی اسمزی، گلبول‌های قرمز بیمار در مجموعه‌ای از محلول‌های نمکی با غلظت‌های مختلف (معمولاً از 0.85% تا 0.10% NaCl) معلق می‌شوند. هرچه محلول رقیق‌تر باشد، محیط هیپوتونیک‌تر و احتمال همولیز بیشتر می‌شود. در غلظت‌های نزدیک به 0.85% (محیط ایزوتونیک) همولیزی رخ نمی‌دهد؛ در غلظت‌های بین 0.45% تا 0.30% همولیز تدریجاً آغاز می‌شود و در غلظت‌های کمتر از 0.30% تقریباً تمام سلول‌ها همولیز می‌شوند.

سپس میزان همولیز هر لوله با روش‌های بصری یا اسپکتروفتومتری تعیین می‌شود. نتیجه معمولاً به‌صورت منحنی شکنندگی اسموتیک گزارش می‌گردد که در محور افقی غلظت NaCl و در محور عمودی درصد همولیز رسم می‌شود.

عوامل مؤثر بر شکنندگی اسمزی — تاثیر شکل، سن و وضعیت غشا

عواملی مانند شکل RBC، نسبت سطح به حجم، وضعیت پروتئین‌های غشا، سن سلول و شرایط پیش‌تحلیلی نمونه می‌توانند بر نتایج OFT تأثیر بگذارند:

  • شکل RBC: RBCهای کروی (spherocytes) زودتر همولیز می‌شوند → شکنندگی ↑.
  • نسبت سطح به حجم: افزایش نسبت سطح به حجم (مثل سلول‌های تارگتی در تالاسمی) → شکنندگی ↓.
  • وضعیت غشا و پروتئین‌ها: ناهنجاری‌های غشایی (ارثی یا اکتسابی) → شکنندگی ↑.
  • سن RBC: سلول‌های پیر شکننده‌تر هستند و ممکن است نتایج را تغییر دهند.
  • شرایط پیش‌تحلیلی: خون مانده، همولیز مکانیکی، یا نگهداری نامناسب می‌تواند باعث نتایج کاذب شود.

روش انجام آزمایش شکنندگی اسمزی (Materials & Methods) — پروتکل کلی و فهرست مواد

روش انجام آزمایش اسمزی به این شرح است که در ایتدا لوله های با غلظت های هایپوتونیک NaCl در لوله های پشت سر هم تهیه می شود و گلبول های قرمز در این لوله ها انکوبه می شوند و در انتها سانتریفیوژ شده و میزان همولیز در هر لوله با استفاده از اسپکتروفتومتری در طول موج ۵۴۰ اندازه گیری می شود.

الف) مواد و تجهیزات مورد نیاز

  • سدیم کلرید (NaCl)  یا محلول 0.9% استریل (NaCl normal saline).
  • آب دیونیزه / آب مقطر (DW) برای تهیه 100% همولیز (همولیز کامل نمونه مرجع).
  • لوله‌های تست 12×75 mm یا لوله‌های 5 mL برای هر غلظت.
  • خون کامل تازه جمع‌آوری‌شده در ضدانعقاد EDTA (تا حد امکان کمتر از 24–72 ساعت از زمان خون‌گیری).
  • پیپت‌های دقیق (P10, P20, P200, P1000) یا میکروپیپت و پیپت پاستور.
  • سانتریفیوژ با قابلیت تنظیم rpm/g.
  • اسپکتروفتومتر با طول موج حدود 540 nm (برای خوانش هموگلوبین آزاد در سوپرناتانت) یا روش بصری برای مراکز بدون اسپکتروفتومتر.
  • ظرف و تجهیزات استریل برای نگهداری محلول‌ها در صورت لزوم.

ب) انتخاب غلظت‌ها و روش‌های تهیه محلول NaCl

سری غلظت‌های متداول که معمولاً استفاده می‌شود عبارت‌اند از: 0.85%, 0.75%, 0.65%, 0.55%, 0.45%, 0.40%, 0.35%, 0.30%, 0.25%, 0.20%, 0.10%. می‌توان بازه‌های دیگری نیز استفاده کرد، اما این سری عمومیت دارد. دو روش برای تهیه محلول‌ها رایج است: (1) تهیه از نمک جامد (گرم/لیتر) و (2) رقیق‌سازی از محلول مرجع 0.9% (روش سریع و عملی).

روش ۱ — تهیه از نمک جامد (برای تهیه ولوم بالا)

درصدها به‌صورت w/v محاسبه می‌شوند (گرم در 100 mL). برای تهیه 1 لیتر از محلول، مقدار نمک (گرم) = درصد × 10. مثال: برای 0.85% → 8.5 گرم NaCl را در 1 لیتر آب حل کنید.

روش ۲ — رقیق‌سازی از محلول مرجع 0.9% (پیشنهادی برای کار آزمایشگاهی روزمره)

فرمول رقیق‌سازی: V1 = (C2/C1) × V2 که C1 = 0.9% و C2 = غلظت هدف و V2 = حجم نهایی مورد نیاز است. در جدول زیر نحوه تهیه 100 mL از هر غلظت با رقیق‌سازی از 0.9% آمده است (اعداد گردشده برای سهولت عملی).

غلظت هدف (% NaCl) حجم 0.9% لازم (mL) حجم آب مقطر برای تکمیل تا 100 mL (mL)
0.85 94.4 5.6
0.75 83.3 16.7
0.65 72.2 27.8
0.55 61.1 38.9
0.45 50.0 50.0
0.40 44.4 55.6
0.35 38.9 61.1
0.30 33.3 66.7
0.25 27.8 72.2
0.20 22.2 77.8
0.10 11.1 88.9

روش: مقدار 0.9% را پیپت کن، به بالن یا بطری منتقل کن و با آب مقطر تا 100 mL تکمیل کن؛ خوب مخلوط کن و برچسب بزن. برای حجم‌های کوچک‌تر (مثلاً هر لوله 5 mL) می‌توان همین نسبت را برای V2=5 mL به‌کار برد یا از محلول 100 mL با پیپت حجم‌های کوچکتر برداشته و در لوله‌ها پخش کرد.

پ) چیدمان لوله‌ها و نسبت خون به محلول در آزمایش شکنندگی اسمزی

در هر لوله معمولاً 3–5 mL از محلول NaCl ریخته می‌شود (بسته به اندازه لوله؛ 5 mL متداول است). به هر لوله 50 µL (0.05 mL) خون کامل (EDTA) اضافه کنید — این مقدار روی پروتکل‌های مرجع رایج است (نسبت حدود 1:100). برخی پروتکل‌ها «چند قطره خون» نوشته‌اند؛ اما برای روش اسپکتروفتومتریک از حجم دقیق 50 µL استفاده کنید تا مقایسه‌پذیری برقرار شود.

هر نمونه را حداقل در دو تکرار (duplicates) انجام دهید و یک مجموعه کنترل نرمال و یک کنترل مثبت (نمونهٔ شناخته‌شده با افزایش شکنندگی مثل نمونهٔ اسفروسیت) همراه داشته باشید.

ت) انکوباسیون، سانتریفیوژ و خوانش

پس از اضافه کردن خون، لوله‌ها را آرام (با برگشتِ پیپت یا چرخش دستی) مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق (22–25°C) قرار دهید (برای OF کلاسیک). سپس سانتریفیوژ کنید. برخی پروتکل‌ها زمان انکوباسیون 15–30 دقیقه را گزارش می‌کنند؛ انتخاب دقیق بستگی به استاندارد آزمایشگاه دارد.

سانتریفیوژ: معمولاً 10 دقیقه با RPM بستگی به دستگاه (معمولاً معادل ~1000–1500 × g) — بسیاری از منابع محدوده‌ای بین 1500–3000 rpm را ذکر می‌کنند؛ بهتر است با استفاده از جدول یا معادلهٔ rpm↔g دستگاه محاسبه شود. بعد از سانتریفیوژ، سوپرناتانت شفاف خواهد شد.

کنترل 100% همولیز و بلانک

کنترل 100% همولیز: برای تعیین OD مربوط به همولیز کامل، مقدار معینی از خون (مثلاً همان 50 µL) را در آب مقطر بریزید، مخلوط کنید تا همولیز کامل رخ دهد، سپس سانتریفیوژ و سوپرناتانت را به‌عنوان مرجع 100% استفاده کنید.
بلانک صفر: برای صفرسازی اسپکتروفتومتر از محلول 0.9% NaCl (یا همان NaCl ایزوتونیک) استفاده کنید.

خوانش اسپکتروفتومتریک نمونه ها در آزمایش شکنندگی اسمزی

اندازه‌گیری جذب (OD) سوپرناتانت در طول موج ~540 nm (یا 539 nm) برای تعیین هموگلوبین آزاد انجام می‌شود. مراکز بدون اسپکتروفتومتر می‌توانند از قضاوت بصری رنگ سوپرناتانت‌ها استفاده کنند، اما روش اسپکتروفتومتریک کمّی‌تر و قابل تکرارتر است.

ث) محاسبه درصد همولیز و نمودارسازی

محاسبه درصد همولیز برای هر لوله معمولاً به‌صورت زیر انجام می‌شود:

٪ Hemolysis = ((ODsample – ODblank)/(OD100% – ODblank)) × 100

اگر ODblank≈0 باشد (پس از صفرسازی) فرمول ساده‌تر می‌شود. نتایج را مقابل غلظت NaCl رسم کنید (محور x = % NaCl، محور y = % همولیز). از این منحنی می‌توان پارامتر H₅₀ (غلظتی که 50% همولیز می‌دهد) را بدست آورد؛ این پارامتر برای مقایسه کمی بین نمونه‌ها مفید است (میان‌یابی خطی بین دو نقطهٔ اطراف 50% یا فیت کردن منحنی sigmoid).

 پارامترMCF (میانگین شکنندگی اسمزی؛ Mean corpuscular fragility) غلظتی از محلول هایپوتونیک  NaClاست که در آن 50 درصد گلبول‌ها لیز می‌شوند که معمولاً برای گلبول‌های قرمز نرمال 4 در هزار است ولی در گلبول‌های اسفروسیت که تحمل ورود آب اضافی را ندارند این عدد معمولاً 7 در هزار است. منحنی شکنندگی اسمزی در حالت نرمال، اسفروسیتوز ارثی و تالاسمی را در شکل زیر مشاهده ی می کنید. منحنی سمت راست مربوط به تالاسمی، منحنی میانی مربوط به حالت نرمال و منحنی سمت چپ مربوط به اسفروسیتوز ارثی است

آزمایش شکنندگی اسمزی

آزمایش شکنندگی اسمزی

ج) نسخهٔ انکوبه‌شده (Incubated Osmotic Fragility Test)

برای حساس‌سازی تشخیص اسفروسیتوز خفیف: نمونهٔ خون را 24 ساعت در 37°C انکوبه کنید و سپس آزمایش را به‌صورت معمولی تکرار کنید (Incubated OF). این روش حساسیت OF را برای تشخیص موارد خفیف HS افزایش می‌دهد و در منابع بالینی مرجع توصیه شده است.

چ) نکات عملی و کنترل کیفیت مقدماتی آزمایش شکنندگی اسمزی

• اجرای کنترل‌های روزانه: کنترل نرمال و کنترل مثبت (نمونهٔ شناخته‌شده).
• انجام دو تکرار از هر نمونه و گزارش تکرارپذیری.
• نمونه‌های همولیز شده، نمونه‌های پس از خون‌ریزی یا ترانسفوزیون اخیر و نمونه‌هایی با رتیکولوسیتوز بالا ممکن است نتایج را مخدوش کنند.
• محلول‌های از پیش تهیه‌شده را برچسب و تاریخ‌گذاری کنید؛ از محلول‌های استریل در صورت نیاز استفاده کنید.
• برای استانداردسازی بیشتر و افزایش دقت، روش‌های مدرن مانند Flow-cytometric OF یا ektacytometry در دسترس و با حساسیت بالاتر هستند.

کنترل کیفی آزمایش شکنندگی اسموزی (کنترل کیفی آزمایش OF) — استانداردها برای آزمایش شکنندگی اسموتیک

کنترل کیفیت آزمایش شکنندگی اسموتیک (کنترل کیفی آزمایش OF) ضروری است تا قابلیت اطمینان و تکرارپذیری نتایج تضمین شود. کنترل کیفی شامل کنترل‌های روزانه، کنترل‌های دوره‌ای، کالیبراسیون تجهیزات، و ثبت و مانیتورینگ نتایج می‌باشد. در ادامه یک چک‌لیست و فلوچارت ساده برای کاربرد در لابراتوار آورده شده است.

چک‌لیست کنترل کیفی روزانه و دوره‌ای

  • کنترل‌های روزانه: اجرای کنترل نرمال و کنترل مثبت (نمونه با شکنندگی شناخته‌شده) در شروع هر شیفت.
  • کالیبراسیون اسپکتروفتومتر: بررسی خطی بودن پاسخ دستگاه با استانداردهای رنگ/هموگلوبین به‌صورت هفتگی یا ماهانه.
  • بررسی محلول‌ها: کنترل غلظت NaCl، pH (7.2–7.4) و تاریخ تهیه؛ محلول‌های آماده بیش از ۷ روز در دمای اتاق نگهداری نشوند مگر استریلیزه و بسته‌بندی مناسب باشند.
  • کنترل نمونه: ثبت زمان خون‌گیری، ضدانعقاد مصرفی، زمان نگهداری و دما؛ نمونه‌های بیش از 72 ساعت را ارزیابی جداگانه کنید.
  • تکرارپذیری: انجام حداقل duplicate برای هر نمونه و محاسبه CV بین تکرارها (CV ≤ 10% مطلوب است).
  • کنترل مستندات: ثبت روزانه نتایج کنترل‌ها، اتفاقات غیرطبیعی و اقدامات اصلاحی در لاگ QC.

جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی در بخش هماتولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی هماتولوژی (Levey-Jennings + قوانین Westgard): راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

فلوچارت عملی برای تکنسین (Checklist مرحله‌ای)

  1. بررسی برچسب نمونه (نام، تاریخ/زمان خون‌گیری، ضدانعقاد).
  2. آماده‌سازی محلول‌های NaCl مطابق جدول و برچسب‌گذاری دقیق.
  3. پیپت کردن 5 mL محلول هر غلظت در لوله مشخص و اضافه کردن 50 µL خون.
  4. مخلوط کردن آرام و انکوباسیون 30 دقیقه در دمای اتاق (یا 24 ساعت @37°C برای نسخه انکوبه‌شده).
  5. سانتریفیوژ طبق پروتکل (مثلاً 10 دقیقه @1000–1500×g یا معادل rpm دستگاه).
  6. جمع‌آوری سوپرناتانت و خوانش OD در 540 nm؛ ثبت نتایج و محاسبه درصد همولیز.
  7. اجرای کنترل‌های روزانه و مقایسه با محدوده مرجع؛ در صورت انحراف، اقدامات اصلاحی را ثبت کن.

شاخص‌های کیفیت و معیارهای هشدار در آزمایش شکنندگی اسمزی

  • تکرارپذیری (Duplicates): CV ≤ 10% معیار قابل قبول.
  • کنترل روزانه: مقادیر کنترل در ±2SD محدوده مرجع قرار گیرند.
  • اختلاف بین H₅₀های متوالی: تغییر بیش از ±0.02% NaCl نیاز به بررسی کالیبراسیون و محلول‌ها دارد.
  • وجود همولیز در نمونه اولیه: نمونه تکرار یا اخطار جهت جمع‌آوری مجدد.

کاربردهای بالینی آزمایش OF

آزمایش شکنندگی اسمزی اهمیت تشخیصی و کمّی در موارد متعددی دارد. در این بخش کاربردها را همراه با توضیحات بالینی، نحوه تفسیر و توصیه‌های تکمیلی ارائه کرده‌ام. برای هر مورد، همچنین تست‌های جایگزین یا مکمل نیز ذکر شده‌اند.

۱) Hereditary Spherocytosis (اسفروسیتوز ارثی) — تشخیص و مانیتورینگ

در اسفروسیتوز ارثی (Hereditary Spherocytosis) که به اختلالات پروتئین‌های غشایی RBC (مانند spectrin, ankyrin, band 3) مرتبط است، سلول‌ها کروی می‌شوند و نسبت سطح به حجم کاهش می‌یابد؛ بنابراین شکنندگی اسموتیک افزایش می‌یابد (یعنی همولیز در غلظت‌های بالاتر NaCl رخ می‌دهد). OFT به‌ویژه در موارد کلاسیک مفید است؛ در موارد خفیف، نسخهٔ انکوبه‌شده حساسیت را افزایش می‌دهد. تست‌های تکمیلی: EMA-binding (flow cytometry)، ektacytometry، و تحلیل مولکولی پروتئین‌های غشایی.

۲) Autoimmune Hemolytic Anemia (همولیز ایمنی) — تداخلات و تمایز

در برخی فرم‌های همولیز ایمنی (AIHA) به ویژه نوع گرم، تولید آنتی‌بادی‌ها و عمل فاگوسیتوز گلبول‌های پوشش‌خورده می‌تواند منجر به ظهور اسفروسیت‌ها و افزایش شکنندگی شود. OFT ممکن است افزایش شکنندگی را نشان دهد اما برای تمایز از HS نیاز به Coombs test (DAT) و ارزیابی بالینی است.

۳) Thalassemia (تالاسمی) و دیگر آنمی‌های میکروسیتیک — کاهش شکنندگی و توضیح مکانیزمی

در اغلب موارد تالاسمی (Thalassemia major/minor) و نیز در برخی موارد فقر آهن، به دلیل تغییرات در نسبت سطح به حجم و وجود سلول‌های تارگتی، مقاومت اسموتیک گلبول‌ها افزایش می‌یابد (شکنندگی کاهش می‌یابد). این پدیده می‌تواند در تمایز بین فقر آهن و تالاسمی کمک‌کننده باشد اما قضاوت باید همراه با MCV, MCHC، هموگلوبین الکتروفورز و اسمیر خون انجام شود.

۴) نوزادان و همولیز نوزادی — کاربرد بالینی و محدودیت‌ها

در نوزادان با همولیز نوزادی (Hemolytic disease of the newborn) یا با شک به اختلالات غشایی مادرزادی، OFT می‌تواند اطلاعات مفیدی ارائه دهد، اما به علت تغییرات طبیعی RBCهای نوزادی و تفاوت‌های فیزیولوژیک لازم است با احتیاط تفسیر شود و از تست‌های تکمیلی استفاده شود.

۵) سموم، سوختگی، مالاریا و آسیب غشایی — کاربرد تحقیقاتی و پیگیری آسیب غشا

در شرایطی که غشاهای RBC آسیب می‌بینند (مثل مسمومیت‌ها، سوختگی شدید یا عفونت‌های سلولی مانند مالاریا)، شکنندگی اسموتیک می‌تواند افزایش یابد و برای پایش آسیب غشا در مطالعات بالینی و پژوهشی کاربرد داشته باشد. در این زمینه OFT بیشتر یک شاخص کیفی از آسیب غشا است تا یک تست اختصاصی تشخیصی.

۶) کاربردهای تشخیصی ترکیبی — الگوریتم تشخیصی پیشنهادی

الگوریتم پیشنهادی (خلاصه):

  1. اگر OFT افزایش شکنندگی نشان داد → بررسی اسمیر برای اسفروسیت‌ها → انجام DAT (Coombs) → اگر DAT منفی → انجام EMA-binding / ektacytometry برای تأیید HS.
  2. اگر OFT کاهش شکنندگی نشان داد و MCV کم بود → ارزیابی هموگلوبین الکتروفورز برای تالاسمی و اندازه‌گیری فریتین/آهن برای فقر آهن.
  3. در موارد مشکوک به ترکیب اختلالات (مثلاً هم‌زمانی تالاسمی و HS) از ترکیب تست‌ها و مشاوره هماتولوژی استفاده شود.

محدودیت‌ها و نکات تفسیر — نکات احتیاطی برای آزمایش شکنندگی اسمزی

  • OFT یک تست نسبی و حساس به شرایط پیش‌تحلیلی است؛ لذا نمونه‌های نگهداری‌شده یا همولیز شده می‌توانند نتایج را مخدوش کنند.
  • حساسیت و اختصاصیت OFT برای HS در مقایسه با تست‌های مدرن کمتر است؛ در موارد شک به HS، تست EMA-binding و ektacytometry اولویت دارند.
  • تغییرات MCHC، حضور رتیکولوسیت‌های زیاد یا ترانسفوزیون اخیر می‌تواند نتیجه را جابه‌جا کند.
  • در موارد بالینی پیچیده، تفسیر نتایج OFT باید در کنار یافته‌های بالینی، اسمیر خون و سایر تست‌های پاراکلینیکی باشد.

خلاصه و جمع‌بندی

آزمایش شکنندگی اسموتیک (OFT) همچنان به‌عنوان یک تست ساده، اقتصادی و آموزنده برای بررسی یکپارچگی غشای گلبول قرمز و نسبت سطح به حجم کاربرد دارد. با این حال برای تشخیص قطعی بسیاری از بیماری‌های غشایی و همولیتیک، باید با روش‌های پیشرفته‌تر تکمیل شود. رعایت کنترل کیفی دقیق، استانداردسازی تهیه محلول‌ها و ثبت مستندات، کلید دستیابی به نتایج قابل اعتماد است.

سؤالات رایج (FAQ) درباره آزمایش شکنندگی اسمزی — پاسخ‌ها به‌صورت مستقیم

سؤال ۱: آزمایش شکنندگی اسموتیک دقیقاً چه چیزی را می‌سنجد؟ (What does Osmotic Fragility Test measure?)

پاسخ: این آزمایش مقاومت یا شکنندگی گلبول‌های قرمز را در برابر همولیز هنگامی که در محیط‌های هیپوتونیک قرار می‌گیرند، می‌سنجد. به‌عبارت دیگر نشان می‌دهد که در چه غلظت از NaCl درصد مشخصی از سلول‌ها (مثلاً 50%) همولیز می‌شوند؛ این مقدار به سلامت غشا و نسبت سطح به حجم سلول‌ها وابسته است.

سؤال ۲: چه شرایط نمونه‌گیری‌ای برای OFT مناسب است؟

پاسخ: خون کامل در لوله با EDTA، ترجیحاً کمتر از 24–72 ساعت از زمان خون‌گیری مورد استفاده قرار گیرد. نمونه نباید شدیداً همولیز شده باشد یا دمای نگهداری نامناسب داشته باشد. اطلاعات زمان خون‌گیری، مصرف داروی اخیر و تاریخچه ترانسفوزیون باید ثبت شود.

سؤال ۳: آیا OFT قابل‌اعتمادتر است یا تست‌های مدرن‌تر مثل EMA-binding؟

پاسخ: OFT تستی قدیمی، ارزان و آموزنده است اما حساسیت و اختصاصیت آن کمتر از تست‌های مدرن مانند EMA-binding (flow cytometry) و ektacytometry است. برای تشخیص قطعی اسفروسیتوز ارثی، تست‌های مدرن‌تر توصیه می‌شوند.

سؤال ۴: چگونه باید محلول‌های NaCl را تهیه کنم تا خطا به حداقل برسد؟

پاسخ: بهترین روش تهیه، رقیق‌سازی از محلول مرجع 0.9% با فرمول V1 = (C2/C1)×V2 است یا محاسبه مستقیم g/L برای تهیه از نمک جامد. محلول‌ها را با دقت پیپت کنید، برچسب بزنید و تاریخ تهیه را درج کنید. pH را در محدوده 7.2–7.4 نگه دارید و محلول‌های آماده را بیش از چند روز در دمای اتاق نگهداری نکنید مگر شرایط استریلیته و نگهداری مناسب را فراهم کرده باشید.

سؤال ۵: چه تفاوتی بین OFT کلاسیک و Incubated OFT وجود دارد؟

پاسخ: در نسخهٔ کلاسیک، نمونه‌ها برای مدت کوتاهی (۱۵–۳۰ دقیقه) در دمای اتاق در محلول‌های NaCl قرار می‌گیرند. در نسخهٔ انکوبه‌شده، نمونه‌ها پیش از آزمون به مدت 24 ساعت در 37°C انکوبه می‌شوند تا حساسیت آزمون برای تشخیص اسفروسیتوز خفیف افزایش یابد.

سؤال ۶: آیا وجود رتیکولوسیت بالا یا ترانسفوزیون اخیر بر نتیجه تأثیر می‌گذارد؟

پاسخ: بله. رتیکولوسیتوز می‌تواند باعث تغییر در شکنندگی شود و ترانسفوزیون اخیر می‌تواند جمعیت RBC را تغییر داده و تفسیر نتایج را پیچیده کند. این موارد باید در هنگام تفسیر در نظر گرفته شوند.

سؤال ۷: محدوده مرجع معمول برای شروع همولیز و همولیز کامل چیست؟

پاسخ: در حالت نرمال شروع همولیز معمولاً در حدود 0.45–0.50% NaCl و همولیز کامل در حدود 0.30–0.33% NaCl رخ می‌دهد. تغییرات جزیی بسته به روش دقیق و استانداردهای هر آزمایشگاه ممکن است متفاوت باشد.

سؤال ۸: آیا می‌توان از OFT برای پیگیری درمان استفاده کرد؟

پاسخ: به‌طور عمومی OFT برای پیگیری کوتاه‌مدت درمان کاربرد محدود دارد؛ اگر هدف پایش تغییرات غشایی باشد (مثلاً پس از درمان‌های خاص یا جراحی طحال)، OFT می‌تواند بخشی از پنل پیگیری باشد اما معمولاً تست‌های بالینی و پارامترهای همولیتیک دیگر نیز لازم است.

سؤال ۹: بهترین روش برای گزارش نتایج OFT چیست؟

پاسخ: گزارش باید شامل جدول درصد همولیز برای هر غلظت NaCl، منحنی شکنندگی (نمودار)، مقدار H₅₀ (غلظتی که 50% همولیز ایجاد می‌کند)، وضعیت کنترل‌ها و تفسیر بالینی مختصر باشد. همچنین اطلاعات پیش‌تحلیلی (زمان خون‌گیری، ضدانعقاد، زمان انکوباسیون) را درج کنید.

سؤال ۱۰: آیا OFT جایگزینی برای روش‌های مولکولی و ایمونوفلورسانس است؟

پاسخ: خیر. OFT یک تست فیزیولوژیک مفید و ارزان است اما جایگزین تست‌های مولکولی، ایمونوفلورسانس یا flow cytometry (مثل EMA-binding) نیست. این تست باید به‌عنوان بخشی از یک الگوریتم تشخیصی ترکیبی استفاده شود.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

جهت مطالعه ی بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28103644/

دیدگاهتان را بنویسید