استاندارد نیم مک فارلند یک روش استاندارد برای تنظیم کدورت سوسپانسیون باکتریایی (1.5 × 10⁸ CFU/ml) در آزمایش‌های حساسیت ضد میکروبی است. این استاندارد با ترکیب کلرور باریم و اسید سولفوریک تهیه شده و با اسپکتروفتومتر در 625 نانومتر کنترل می‌شود.

فهرست مطالب

• مقدمه
• هدف 
• مواد و تجهیزات مورد نیاز
• روش تهیه استاندارد نیم مک فارلند
• نگهداری محلول نیم مک فارلند
• شرایط استفاده از محلول نیم مک فارلند
• کنترل کیفی محلول نیم مک فارلند
• کاربرد محلول نیم مک فارلند در آزمایشگاه
• محدودیت‌ها و چالش‌های محلول نیم مک فارلند
• نکات کلیدی محلول نیم مک فارلند
• سوالات رایج درباره محلول نیم مک فارلند

مقدمه

در آزمایش‌های میکروب‌شناسی، تعیین حساسیت ضد میکروبی (Antimicrobial Susceptibility Testing – AST) به تلقیح باکتریایی با غلظت یکنواخت و استاندارد وابسته است. غلظت بیش از حد تلقیح می‌تواند منجر به نتایج مقاومت کاذب شود، در حالی که غلظت کمتر از حد استاندارد ممکن است حساسیت کاذب ایجاد کند. این خطاها می‌توانند به انتخاب نادرست آنتی‌بیوتیک و پیامدهای بالینی جدی مانند درمان ناموفق یا تشدید عفونت منجر شوند. استاندارد نیم مک فارلند به‌عنوان مرجع کدورت سوسپانسیون باکتری استفاده می‌شود تا از این خطاها جلوگیری کند. این استاندارد معادل تقریبی یک سوسپانسیون باکتریایی با تراکم 1.5 × 10⁸ CFU/ml (واحد تشکیل‌دهنده کلنی در هر میلی‌لیتر) است و مطابق با استانداردهای بین‌المللی مانند CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) و EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) تنظیم شده است.

هدف

تهیه و استفاده از استاندارد نیم مک فارلند به‌منظور تنظیم دقیق غلظت تلقیح باکتریایی در آزمایش‌های حساسیت ضد میکروبی برای اطمینان از نتایج قابل اعتماد.

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای استاندارد نیم مک فارلند

• کلرور باریم (BaCl₂·2H₂O)
• اسید سولفوریک (H₂SO₄)
• آب مقطر
• مزور مدرج و بالن ژوژه
• لوله آزمایش شیشه‌ای درپیچ‌دار
• اسپکتروفتومتر
• دستگاه دنسیتومتر (اختیاری برای اندازه‌گیری دقیق‌تر کدورت)
• کارت مقایسه کدورت (برای روش چشمی)

روش تهیه استاندارد نیم مک فارلند

تهیه سوسپانسیون سولفات باریم

1. مقدار 0.5 میلی‌لیتر محلول کلرور باریم (0.048 mol/L؛ معادل 1.175%) را به 99.5 میلی‌لیتر محلول اسید سولفوریک (0.36 N؛ معادل 1% v/v) اضافه کنید.
2. در اثر این واکنش، سوسپانسیون سولفات باریم (BaSO₄) تشکیل می‌شود که کدورت آن مبنای استاندارد نیم مک فارلند است.
3. محلول را به‌خوبی هم بزنید تا کدورت یکنواخت شود.

کنترل کدورت

1. جذب نوری (OD) سوسپانسیون را با اسپکتروفتومتر در طول موج 625 نانومتر و کووت با قطر نوری 1 سانتی‌متر اندازه‌گیری کنید.
2. مقدار جذب باید بین 0.08 تا 0.13 باشد. در صورت عدم تطابق، محلول را مجدداً تهیه کنید.
3. برای مقایسه چشمی، می‌توانید از کارت مقایسه کدورت (مانند کارت‌های استاندارد CLSI) در مقابل زمینه سفید-سیاه استفاده کنید.

استاندارد نیم مک فارلند

نگهداری

1. مقدار 4 تا 6 میلی‌لیتر از سوسپانسیون تهیه‌شده را در لوله‌های شیشه‌ای درپیچ‌دار بریزید.
2. درب لوله‌ها را محکم بسته و در دمای اتاق (20-25 درجه سانتی‌گراد) و در تاریکی نگهداری کنید.
3. از قرار گرفتن محلول در معرض نور مستقیم یا تغییرات دمایی شدید خودداری کنید، زیرا ممکن است باعث رسوب یا تغییر کدورت شود.

شرایط استفاده

1. قبل از هر بار استفاده، لوله استاندارد را به‌خوبی تکان دهید تا کدورت یکنواخت شود.
2. وجود ذرات درشت یا رسوب غیر یکنواخت نشانه فساد محلول است. در این صورت، استاندارد جدید جایگزین کنید.
3. مقایسه کدورت سوسپانسیون باکتری با استاندارد می‌تواند به‌صورت چشمی (در مقابل زمینه سفید-سیاه) یا با دستگاه دنسیتومتر انجام شود.
4. در صورت کدر بودن بیش از حد سوسپانسیون باکتری، آن را با سرم فیزیولوژی رقیق کنید؛ در صورت شفاف بودن، با افزودن کلنی‌های بیشتر غلیظ‌تر کنید.

کنترل کیفی استاندارد نیم مک فارلند

کنترل کیفی استاندارد نیم مک فارلند برای اطمینان از دقت و قابلیت اعتماد نتایج آزمایش‌ها ضروری است. مراحل زیر باید به‌طور منظم انجام شوند:

1. کنترل ماهانه جذب نوری: جذب نوری استاندارد را ماهانه با اسپکتروفتومتر در طول موج 625 نانومتر بررسی کنید. مقدار جذب باید در محدوده 0.08 تا 0.13 باشد. در صورت خروج از این محدوده، محلول را تعویض کنید.
2. بررسی بصری: قبل از هر استفاده، لوله استاندارد را از نظر وجود رسوبات درشت یا تغییر رنگ بررسی کنید. هرگونه ناهمگونی نشانه فساد محلول است.
3. مقایسه با سویه‌های کنترل: برای اطمینان از عملکرد صحیح استاندارد، می‌توانید سوسپانسیون WITH باکتریایی سویه‌های کنترل کیفی (مانند Escherichia coli ATCC 25922 یا Staphylococcus aureus ATCC 25923) را با استاندارد تهیه شده تنظیم کرده و نتایج آنتی‌بیوگرام را با مقادیر مرجع CLSI یا EUCAST مقایسه کنید.
4. تعویض دوره‌ای: حتی در شرایط نگهداری مناسب، محلول نیم مک فارلند باید حداکثر هر شش ماه تعویض شود تا از تغییرات شیمیایی یا رسوب جلوگیری شود.
5. کالیبراسیون تجهیزات: اسپکتروفتومتر یا دنسیتومتر مورد استفاده باید به‌طور دوره‌ای کالیبره شوند تا از دقت اندازه‌گیری اطمینان حاصل شود.

کاربرد استاندارد نیم مک فارلند در آزمایشگاه

1. پیش از انجام آزمایش آنتی‌بیوگرام (روش دیسک دیفیوژن یا MIC)، سوسپانسیون باکتریایی تهیه‌شده با سرم فیزیولوژی یا محیط مناسب از نظر کدورت با استاندارد نیم مک فارلند مقایسه می‌شود.
2. این استاندارد در آزمایش‌هایی مانند تست کربی-بائر، E-test، یا تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC) استفاده می‌شود.
3. استفاده از دستگاه‌های نوری مانند دنسیتومتر دقت بیشتری نسبت به روش چشمی فراهم می‌کند، به‌ویژه در آزمایشگاه‌های پیشرفته.

محدودیت‌ها و چالش‌ها

1. روش چشمی: مقایسه چشمی کدورت ممکن است به دلیل خطای انسانی یا شرایط نوری نامناسب دقت کمتری داشته باشد. استفاده از دنسیتومتر یا دستگاه‌های خودکار توصیه می‌شود.
2. کیفیت مواد اولیه: تغییرات در خلوص کلرور باریم یا اسید سولفوریک می‌تواند بر کدورت سوسپانسیون تأثیر بگذارد. استفاده از مواد با کیفیت آزمایشگاهی ضروری است.
3. روش‌های جایگزین: در آزمایشگاه‌های مدرن، دستگاه‌های خودکار مانند VITEK یا Phoenix می‌توانند غلظت باکتریایی را مستقیماً تنظیم کنند، که ممکن است نیاز به استاندارد نیم مک فارلند را کاهش دهد. با این حال، این استاندارد همچنان به‌عنوان روشی مقرون‌به‌صرفه و قابل اعتماد پرکاربرد است.

نکات کلیدی

• محلول نیم مک فارلند معادل تراکم تقریبی 1.5 × 10⁸ CFU/ml است.
• کنترل کیفی این استاندارد همیشه در طول موج 625 نانومتر انجام می‌شود.
• عدم رعایت این استاندارد می‌تواند منجر به خطاهای بالینی جدی، مانند تجویز آنتی‌بیوتیک نامناسب یا شکست درمان، شود.
• استفاده از دستگاه‌های نوری (دنسیتومتر) دقت بیشتری نسبت به روش چشمی دارد و در آزمایشگاه‌های پیشرفته توصیه می‌شود.
• محلول نیم مک فارلند با استانداردهای CLSI و EUCAST هم‌خوانی دارد و به‌طور گسترده در آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی سراسر جهان استفاده می‌شود.

سوالات رایج