مقدمه: اهمیت و مبانی کنترل کیفی لوپ های کالیبره

لوپ‌های کالیبره (Calibrated Loops)، ابزارهای حیاتی و دقیق در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی هستند که برای انتقال حجم‌های ثابت و مشخصی از مایع، عموماً ۱ میکرولیتر (µL) یا ۱۰ میکرولیتر (µL)، مورد استفاده قرار می‌گیرند. دقت این لوپ‌ها مستقیماً بر نتایج تست‌های کمی و نیمه‌کمی مانند شمارش کلنی (Colony Count)، کشت‌های کمی ادرار و تست‌های تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) تأثیر می‌گذارد. خطا در حجم انتقالی می‌تواند منجر به نتایج کاذب بالا (Positive) یا کاذب پایین (Negative) شود و تفسیر نتایج آزمایشگاهی را به خطر بیندازد. بر اساس استانداردهای بین‌المللی مانند CLSI (مؤسسه استانداردسازی بالینی و آزمایشگاهی) و مراجع ملی، لوپ‌های کالیبره باید توانایی انتقال حجمی با خطای حداکثر ±۲۰٪ نسبت به حجم اسمی خود را داشته باشند. این محدوده خطا، نشان‌دهنده لزوم اجرای منظم و مستندسازی کنترل کیفی لوپ های مورد استفاده است.

روش رنگ‌سنجی با استفاده از محلول آبی ایوانس (Evans Blue Dye)، یک تکنیک اسپکتروفتومتری دقیق، قابل تکرار و مقرون‌به‌صرفه است که به عنوان یکی از روش‌های مرجع برای ارزیابی عملکرد حجمی لوپ‌ها و کنترل کیفی لوپ به شمار می‌رود. این روش بر پایه قانون بیر-لامبرت (Beer-Lambert Law) استوار است که رابطه خطی بین جذب نوری (Absorbance) یک محلول و غلظت ماده رنگی موجود در آن را توصیف می‌کند.

بخش ۱: شناخت انواع لوپ و ملاحظات فنی پیش از استفاده

انواع لوپ‌ها:

1. لوپ‌های فلزی (چندبارمصرف):
   • جنس: این لوپ‌ها معمولاً از آلیاژ پلاتین-ایریدیوم (Platinum-Iridium) یا نیکروم (Nichrome) ساخته می‌شوند. آلیاژ پلاتین-ایریدیوم به دلیل مقاومت بالا در برابر خوردگی، انعطاف‌پذیری و حفظ شکل حلقه در دماهای بالا، گزینه ایده‌آلی است. لوپ‌های نیکروم نیز به دلیل قیمت مناسب‌تر کاربرد دارند اما ممکن است در اثر استفاده مکرر، تغییر شکل دهند.
   • ملاحظات کاربردی: این لوپ‌ها باید قبل و بعد از هر بار استفاده به طور کامل توسط شعله استریل شوند. توجه به این نکته ضروری است که شعله‌دهی بیش از حد یا عدم کنترل دما می‌تواند باعث تغییر شکل حلقه و در نتیجه تغییر حجم انتقالی شود.

کنترل کیفی لوپ

1. لوپ‌های پلاستیکی (یکبارمصرف):
   • مزایا: این لوپ‌ها نیازی به استریل‌سازی مجدد ندارند و خطر آلودگی متقاطع (Cross-contamination) را به حداقل می‌رسانند.
   • محدودیت‌ها: دقت حجم انتقالی در لوپ‌های پلاستیکی می‌تواند از یک سری ساخت (Batch) به سری دیگر متفاوت باشد. به همین دلیل، انجام کنترل کیفیت برای هر سری ساخت جدید از اهمیت بالایی برخوردار است.

نکات مهم و عملی قبل از کنترل کیفیت:

• بازرسی بصری: همواره لوپ را از نظر وجود هرگونه خمش، فرورفتگی، تغییر شکل یا آلودگی بررسی کنید. برای لوپ‌های فلزی، حلقه باید کاملاً گرد و بدون نقص باشد. برای لوپ‌های پلاستیکی، از سالم بودن و عدم شکستگی اطمینان حاصل کنید.
• ظرف حاوی مایع: برای به حداقل رساندن اثر کشش سطحی (Surface Tension)، نمونه مایع را در یک ظرف با قطر حداقل ۱ سانتی‌متر بریزید.
• تکنیک برداشت:
  • لوپ را به صورت کاملاً عمودی و به آرامی در سطح مایع فرو ببرید.
  • یک لحظه مکث کنید تا مایع به طور کامل وارد حلقه لوپ شود.
  • لوپ را به آرامی و به صورت عمودی از مایع خارج کنید. خروج سریع یا زاویه‌دار می‌تواند باعث ایجاد حباب و یا کاهش حجم مایع انتقالی شود.
• جلوگیری از تشکیل حباب: تشکیل حباب هوا در حلقه لوپ، مهم‌ترین عامل خطای حجمی است. حباب‌ها فضای مربوط به مایع را اشغال کرده و باعث برداشت حجم کمتر از مقدار اسمی می‌شوند.

بخش ۲: کنترل کیفیت به روش رنگ‌سنجی با آبی ایوانس

این روش با مقایسه جذب نوری حجم انتقالی توسط لوپ با جذب نوری یک استاندارد با غلظت مشخص، دقت لوپ را ارزیابی می‌کند.

الف: تهیه محلول‌ها و منحنی کالیبراسیون

1. محلول ذخیره (Stock Solution) آبی ایوانس:
   • فرمولاسیون: ۰.۷۵ گرم از پودر آبی ایوانس را با دقت بالا وزن کرده و در یک بشر تمیز و خشک بریزید.
   • به تدریج ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر یا دیونیزه شده با کیفیت بالا به آن اضافه کنید و به آرامی هم بزنید تا پودر کاملاً حل شود.
   • برای اطمینان از حذف ذرات معلق، محلول را با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره ۴ (Whatman No. 4) یا فیلتر غشایی با منافذ ۰.۴۵ میکرومتر، فیلتر کنید.
   • نگهداری: محلول ذخیره را در یک بطری تیره یا پوشیده از فویل آلومینیومی در دمای اتاق و دور از نور مستقیم نگهداری کنید. این محلول به مدت ۶ ماه پایدار است. حتماً برچسب شامل نام محلول، غلظت، تاریخ تهیه و تاریخ انقضا را روی بطری بچسبانید.
2. تهیه رقت‌های استاندارد و منحنی کالیبراسیون:
   • برای تأیید دقت اسپکتروفتومتر و ایجاد یک منحنی مرجع، رقت‌های سریال از محلول ذخیره تهیه کنید. برای لوپ ۱۰ میکرولیتر، رقت‌های ۱:۵۰۰، ۱:۱۰۰۰، ۱:۲۰۰۰ و ۱:۴۰۰۰ مناسب هستند.
     1. رقت ۱:۵۰۰:
        • ۲۰ میکرولیتر از محلول ذخیره (۰.۷۵ گرم/۱۰۰ میلی‌لیتر) را به ۹.۹۸ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
        • حجم نهایی: ۱۰ میلی‌لیتر.
        • غلظت نهایی: رقت ۱:۵۰۰.
     2. رقت ۱:۱۰۰۰:
        • ۵ میلی‌لیتر از رقت ۱:۵۰۰ را به ۵ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
        • حجم نهایی: ۱۰ میلی‌لیتر.
        • غلظت نهایی: رقت ۱:۱۰۰۰.
     3. رقت ۱:۲۰۰۰:
        • ۵ میلی‌لیتر از رقت ۱:۱۰۰۰ را به ۵ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
        • حجم نهایی: ۱۰ میلی‌لیتر.
        • غلظت نهایی: رقت ۱:۲۰۰۰.
     4. رقت ۱:۴۰۰۰:
        • ۵ میلی‌لیتر از رقت ۱:۲۰۰۰ را به ۵ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
        • حجم نهایی: ۱۰ میلی‌لیتر.
        • غلظت نهایی: رقت ۱:۴۰۰۰.
   • جذب نوری هر یک از این رقت‌ها را در طول موج ۶۲۰ نانومتر (نقطه حداکثر جذب آبی ایوانس) با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری کنید. برای کالیبراسیون، از آب مقطر به عنوان بلانک (Blank) استفاده کنید.
   • منحنی کالیبراسیون را با رسم جذب نوری در مقابل غلظت یا رقت تهیه شده رسم کنید.

ب: روش اجرای کنترل کیفی لوپ ۱۰ میکرولیتر

1. آماده‌سازی نمونه آزمون:
   • یک ظرف تمیز حاوی ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر آماده کنید. این آب به عنوان رقیق‌کننده نهایی عمل می‌کند.
   • لوپ ۱۰ میکرولیتر مورد آزمون را برداشته و با دقت، ۱۰ بار از محلول ذخیره آبی ایوانس بردارید. هر بار، مایع را به طور کامل در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر رها کنید.
   • پس از اتمام ۱۰ بار برداشت، محلول حاصل را به طور کامل مخلوط کرده تا رنگ به صورت یکنواخت توزیع شود.
   • جذب نوری این محلول را در طول موج ۶۲۰ نانومتر اندازه‌گیری کنید. برای اطمینان بیشتر، این اندازه‌گیری را سه بار تکرار کرده و میانگین جذب‌ها را محاسبه کنید.
2. محاسبات و تفسیر نتایج:
   • حجم اسمی ۱۰ میکرولیتر از محلول ذخیره، در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر، رقت نهایی ۱:۱۰۰۰ (یعنی ۱۰۰ µL در ۱۰۰ mL) ایجاد می‌کند. بنابراین، جذب نوری نمونه آزمون باید با جذب نوری رقت استاندارد ۱:۱۰۰۰ مقایسه شود.
   • فرمول محاسبه درصد عدم صحت (Percent Inaccuracy):

     درصد عدم صحت = ((میانگین جذب نمونه - جذب رقت استاندارد ۱:۱۰۰۰) / جذب رقت استاندارد ۱:۱۰۰۰) × ۱۰۰

   • معیار پذیرش: اگر درصد عدم صحت در محدوده ±۲۰٪ باشد، لوپ مورد تأیید است. لوپ‌هایی که درصد عدم صحت آن‌ها خارج از این محدوده باشد، باید از رده خارج یا اصلاح شوند.

ج: روش جایگزین با محلول ۰.۲ گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر برای کنترل کیفی لوپ

اگر به جای محلول ذخیره ۰.۷۵ گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر، از محلول با غلظت کمتر (۰.۲ گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر) استفاده می‌کنید، باید رقت‌های استاندارد و محاسبات را متناسب با آن تغییر دهید.

• رقت‌های استاندارد: رقت‌های ۱:۱۰۰، ۱:۲۰۰، ۱:۴۰۰ و ۱:۸۰۰ از محلول جدید تهیه کنید.
• نحوه محاسبه: پس از ۱۰ بار برداشت از محلول جدید و انتقال آن به ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر، رقت نهایی ۱:۵۰۰ خواهد بود (یعنی ۲۰ µL از محلول ذخیره در ۱۰۰ mL آب). با این حال، برای مقایسه، از جذب نوری رقت استاندارد ۱:۱۰۰ استفاده می‌شود.

بخش ۳: اقدامات اصلاحی و عیب‌یابی (Troubleshooting)

در صورت رد شدن کنترل کیفی لوپ در آزمون کنترل کیفیت، اقدامات زیر باید به صورت گام به گام انجام شوند:

1. بازبینی تکنیک کاربر:
   • اطمینان حاصل کنید که لوپ به صورت عمودی و با سرعت مناسب در مایع فرو برده شده و خارج شده است.
   • وجود حباب در حلقه لوپ را بررسی کنید.
   • مطمئن شوید که از یک ظرف با قطر مناسب استفاده کرده‌اید.
2. بررسی لوپ:
   • برای لوپ‌های فلزی: حلقه لوپ را از نظر تغییر شکل، فرورفتگی یا آسیب بررسی کنید. در صورت نیاز، لوپ را به آرامی با ابزار مناسب به شکل اولیه خود بازگردانید.
   • برای لوپ‌های پلاستیکی: با توجه به یکبارمصرف بودن این لوپ‌ها، در صورت رد شدن، کل سری ساخت (Lot Number) باید از رده خارج شده و از سری ساخت جدید استفاده شود.
3. مستندسازی: تمامی نتایج کنترل کیفیت، اقدامات اصلاحی و تاریخ انجام آن‌ها را به دقت ثبت کنید. این مستندات بخشی از سیستم مدیریت کیفیت آزمایشگاه (LIMS) هستند.

بخش ۴: محدودیت‌ها و بهترین شیوه‌های کاربردی

• اثرات کشش سطحی: کشش سطحی مایع می‌تواند باعث جذب حجم نامناسب توسط لوپ شود. استفاده از ظروف با دهانه عریض و اطمینان از تمیز بودن سطح لوپ این اثر را کاهش می‌دهد.
• دقت تجهیزات: دقت ترازو برای وزن کردن پودر، پیپت‌ها برای تهیه رقت‌ها و اسپکتروفتومتر برای اندازه‌گیری جذب، همگی بر نتیجه نهایی تأثیرگذار هستند.
• بهترین شیوه‌ها (Best Practices):
  • زمان‌بندی: برای لوپ‌های فلزی، آزمون QC را به صورت ماهانه یا پس از تعمیر و نگهداری لوپ انجام دهید. برای لوپ‌های پلاستیکی، این آزمون باید برای هر سری ساخت جدید انجام شود.
  • ثبت و نگهداری: تمامی سوابق کنترل کیفیت باید به صورت دقیق و منظم ثبت و برای بازرسی‌های آتی در دسترس باشند.
  • استفاده از محلول تازه: همواره از محلول‌های تازه و استاندارد تهیه شده برای آزمون استفاده کنید.

نتیجه‌گیری:

اجرای منظم و صحیح کنترل کیفیت لوپ‌های کالیبره با استفاده از روش اسپکتروفتومتری آبی ایوانس، یک گام ضروری در تضمین دقت و قابلیت اطمینان نتایج آزمایشگاهی است. این فرآیند، ضمن افزایش کیفیت کار، الزامات استانداردهای بین‌المللی را برآورده کرده و اطمینان از صحت گزارش‌های نهایی را برای کارشناسان آزمایشگاه فراهم می‌کند.