روش انجام الکتروفورز هموگلوبین | راهنمای کامل و عملی برای کارشناسان علوم آزمایشگاهی

روش انجام الکتروفورز هموگلوبین | راهنمای کامل و عملی برای کارشناسان علوم آزمایشگاهی

روش انجام الکتروفورز هموگلوبین شامل آماده‌سازی نمونه، تهیه همولیزات، آماده‌سازی نوار سلولز استات، بارگذاری دقیق نمونه، اجرای الکتروفورز در محیط قلیایی و اسیدی، رنگ‌آمیزی، رنگ زدایی، خشک‌کردن و تفسیر الگوهای مهاجرت است. این روش برای تشخیص تالاسمی‌ها، هموگلوبینوپاتی‌ها و ارزیابی هموگلوبین‌های غیرطبیعی کاربرد دارد.


جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:


https://t.me/hematology_education

🚀 عضویت در کانال تلگرام

مطالعه مقاله اصلی الکتروفورز هموگلوبین

برای درک کامل الگوها، pH ایزوالکتریک، مهاجرت هموگلوبین‌ها و تفسیر نتایج، پیشنهاد می‌شود مقاله جامع زیر را مطالعه کنید:🔗 مطالعه مقاله: الکتروفورز هموگلوبین

مقدمه روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

الکتروفورز هموگلوبین یکی از مهم‌ترین تست‌های تخصصی در هماتولوژی است که برای شناسایی انواع هموگلوبین‌های طبیعی و غیرطبیعی، بررسی تالاسمی‌ها و هموگلوبینوپاتی‌ها و افتراق میان HbS، HbC، HbE، HbD، HbG و محاسبه درصد HbA2 و HbF به‌کار می‌رود. این تست باید با دقت بسیار بالا انجام شود، زیرا خطا در مراحل پیش‌آنالیتیک یا آنالیتیک می‌تواند موجب تشخیص نادرست شود.

اصول علمی روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

هموگلوبین‌ها پروتئین‌هایی با بار الکتریکی متفاوت هستند. اساس الکتروفورز بر مبنای مهاجرت مولکول‌های باردار در میدان الکتریکی است. تفاوت بار مولکولی بر اساس pH محیط و pH ایزوالکتریک (pI) هر هموگلوبین تعیین می‌شود.

اگر pH محیط بالاتر از pI باشد، هموگلوبین بار منفی می‌گیرد و به سمت آند (+) حرکت می‌کند. اگر pH کمتر از pI باشد، بار مثبت گرفته و به سمت کاتد (−) حرکت می‌کند. این تفاوت‌ها باعث ایجاد الگوهای مهاجرتی متفاوت می‌شود.

پیش‌آنالیتیک در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

نوع نمونه: خون کامل EDTA

حجم: ۲–۳ میلی‌لیتر

شرایط نگهداری: دمای ۲–۸ درجه تا ۵ روز قابل قبول، ولی انجام در ۴۸ ساعت اول بهتر است.

موارد رد نمونه: لخته، همولیز شدید، لیپمی، آلودگی، ترانسفیوژن اخیر

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

در این بخش تمامی تجهیزات، مواد، بافرها، کنترل‌ها و لوازمی که برای انجام این تست ضروری هستند با جزئیات ارائه شده است.

  • نوار سلولز استات (Cellulose acetate strip)
  • بافر قلیایی Tris–Borate–EDTA با pH حدود ۸٫۴–۸٫۶
  • محلول همولیزکننده RBC
  • دستگاه الکتروفورز + پاورساپلای مناسب
  • کنترل هموگلوبین نرمال (HbA)
  • کنترل HbS و کنترل HbC
  • رنگ Ponceau S یا رنگ اختصاصی کیت
  • محلول دی‌رنگ: اسید استیک ۵٪
  • اپلیکاتور مخصوص بارگذاری یا میکروپیپت
  • کاغذ صافی
  • خشک‌کن یا انکوباتور ۳۷°C

روش انجام مرحله‌به‌مرحله الکتروفورز هموگلوبین

این بخش کامل‌ترین نسخه عملی و تخصصی روش انجام الکتروفورز هموگلوبین است و برای استادان، کارشناسان علوم آزمایشگاهی و نویسندگان SOP کاملاً مناسب است.

گام ۱: تهیه همولیزات (Hemolysate) برای روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

تهیه همولیزات یکی از حساس‌ترین مراحل کار است، زیرا کیفیت همولیزات مستقیماً روی باندها و تفسیر نتایج اثر می‌گذارد.

  • ۲۰ تا ۵۰ میکرولیتر خون EDTA را داخل لوله اپندورف بریزید.
  • مقدار ۱ میلی‌لیتر از محلول همولیزکننده را اضافه کنید.
  • به‌آرامی ۳–۴ بار واژگون کنید (از تکان شدید خودداری کنید).
  • ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار دهید.
  • در صورت نیاز ۲۰ ثانیه سانتریفیوژ کنید تا debris ته‌نشین شود.
  • سوپرناتانت شفاف را برای بارگذاری استفاده کنید.

نکته مهم: اگر همولیزات بیش از حد غلیظ باشد، باندها پهن، نامشخص و تیره می‌شوند. اگر خیلی رقیق باشد، باندها دیده نمی‌شوند.

گام ۲: آماده‌سازی نوار سلولز استات

  • نواری با اندازه مناسب (بسته به دستگاه) ببرید.
  • نوار را ۳ تا ۵ دقیقه در بافر قلیایی قرار دهید.
  • نوار را خارج کرده و فقط رطوبت اضافی آن را با دستمال بگیرید.
  • نوار نباید خشک شود، نباید خیلی خیس باشد.
  • نوار را روی پل دستگاه قرار دهید به‌طوری‌که دو انتهای آن با بافر تماس داشته باشند.

هشدار مهم: خشکی نوار → توقف مهاجرت. خیسی بیش از حد → پخش‌شدن باند.

گام ۳: بارگذاری نمونه‌ها روی نوار

  • اپلیکاتور را به همولیزات آغشته کنید.
  • خط بارگذاری باید مستقیم و باریک باشد.
  • بارگذاری زیاد باعث ایجاد streak می‌شود.
  • برای هر نمونه فاصله ۵ تا ۷ میلی‌متری رعایت کنید.
  • کنترل HbA، HbS و HbC باید در اولین خطوط قرار گیرند.

گام ۴: اجرای الکتروفورز

پارامترهای استاندارد:

  • ولتاژ: ۳۵۰ تا ۴۰۰ ولت
  • زمان: ۲۰ تا ۳۰ دقیقه
  • دمای مناسب: ۲۰ تا ۲۵ درجه
  • جهت مهاجرت: از کاتد به سمت آند

در حین کار از ایجاد حباب، داغ شدن نوار و تماس نامناسب با بافر جلوگیری کنید.

نکته کلیدی: اگر نوار موج‌دار شد یا باندها خم شدند، مشکل معمولاً از دمای زیاد یا تشکیل حباب است.

گام ۵: رنگ‌آمیزی نوار در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

رنگ‌آمیزی صحیح یکی از مراحل بسیار مهم در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین است، زیرا شدت و وضوح باندها به کیفیت رنگ‌آمیزی بستگی دارد.

  • نوار را بلافاصله بعد از پایان مهاجرت از دستگاه خارج کنید.
  • نوار را به مدت ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در محلول رنگ (Ponceau S یا رنگ اختصاصی کیت) قرار دهید.
  • به آرامی نوار را تکان دهید تا رنگ به‌طور یکنواخت جذب شود.
  • اگر رنگ بیش از حد بماند، باندها بیش از حد پررنگ یا پخش‌شده دیده می‌شوند.

نکته مهم: رنگ‌آمیزی بیش از حد باعث پخش شدن باندها و کاهش دقت تفسیر می‌شود. زمان باید دقیق رعایت شود.

گام ۶: رنگ زدایی (Destaining)

پس از رنگ‌آمیزی، باید رنگ‌های زمینه حذف شوند تا باندهای هموگلوبین واضح دیده شوند. این مرحله با اسید استیک رقیق انجام می‌شود.

  • نوار را در محلول اسید استیک ۵٪ قرار دهید.
  • ۳ تا ۴ بار محلول را تعویض کنید تا زمینه کاملاً سفید و شفاف شود.
  • تکان آرام نوار به یکسان شدن دی‌رنگ کمک می‌کند.
  • اگر رنگ زدایی بیش از حد طول بکشد، باندها خیلی کم‌رنگ یا محو می‌شوند.

هشدار مهم: نوار را نباید به شدت تکان داد؛ این کار باعث جابه‌جایی باندها و ایجاد artifact می‌شود.

گام ۷: خشک‌کردن نوار

  • نوار را روی سطح صاف و تمیز (شیشه یا مقوا) قرار دهید.
  • برای بهترین نتیجه از انکوباتور ۳۷ درجه استفاده کنید.
  • از قرار دادن نوار در نور مستقیم آفتاب خودداری کنید.
  • نوار باید کاملاً خشک شود تا باندها قابل آرشیو و اسکن باشند.

خشک‌کردن صحیح نوار یکی از شروط اساسی برای داشتن باندهایی با وضوح بالا و جلوگیری از smear شدن است.

روش انجام الکتروفورز هموگلوبین در محیط اسیدی (Citrate Agar)

الکتروفورز سیترات آگار جهت افتراق هموگلوبین‌هایی استفاده می‌شود که در محیط قلیایی هم‌مهاجرت هستند، مانند S از D/G و C از E. این روش مکمل الکتروفورز قلیایی است.

مراحل کار:

  • آماده‌سازی ژل طبق دستور کیت
  • ایجاد چاهک‌ها برای بارگذاری
  • بارگذاری همولیزات
  • اجرای الکتروفورز با ولتاژ ۹۰–۱۰۰ ولت برای ۴۵–۶۰ دقیقه
  • رنگ‌آمیزی مشابه روش قلیایی
  • رنگ زدایی با اسید استیک
  • خشک‌کردن و تفسیر باندها

نکته کلیدی: HbS در محیط اسیدی از HbD و HbG جدا می‌شود، بنابراین برای تایید HbS تست اسیدی ضروری است.

خطاهای رایج در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

۱. خطاهای پیش‌آنالیتیک

  • نمونه لخته → ایجاد باندهای ناقص
  • همولیز شدید → پخش‌شدن باندها
  • نمونه قدیمی → باندهای شبحی
  • ترانسفیوژن اخیر → الگوی ترکیبی HbA و HbS

۲. خطاهای هنگام بارگذاری

  • بارگذاری زیاد → باند پهن
  • بارگذاری کم → باند محو
  • خط کج → مهاجرت نامنظم

۳. خطاهای دستگاهی

  • ولتاژ بیش از حد → خمیدگی باندها
  • ولتاژ کم → عدم مهاجرت
  • حباب زیر نوار → موج‌دار شدن باند

۴. خطاهای رنگ‌آمیزی و دی‌رنگ

  • رنگ زیاد → پخش شدن باند
  • دی‌رنگ زیاد → کم‌رنگ شدن باند
  • رنگ زدایی کم → زمینه قرمز و مخدوش

    کنترل کیفیت (QC) در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

    کنترل کیفیت یکی از حیاتی‌ترین بخش‌های روش انجام الکتروفورز هموگلوبین است. دقت الکتروفورز وابسته به اجرای درست کنترل‌ها و مقایسه صحیح موقعیت باندها با کنترل‌های استاندارد می‌باشد.

    روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

    الگوی حرکتی هموگلوبین ها طی الکتروفورز هموگلوبین

    ۱. کنترل داخلی (IQC)

    • کنترل HbA استاندارد
    • کنترل HbS
    • کنترل HbC
    • مهاجرت کنترل‌ها باید دقیقاً در موقعیت مناسب باشد

    ۲. کنترل خارجی (EQA)

    • برنامه‌های ارزیابی خارجی کیفیت
    • معمولاً سالی ۲ تا ۳ بار
    • نمونه‌ها باید مانند نمونه بیمار پردازش شوند

    ۳. شاخص‌های کنترل کیفیت

    • موقعیت صحیح باندهای کنترل
    • شدت و وضوح باند
    • عدم وجود smear یا streak
    • درصد HbA2 و HbF در محدوده کیفی ثابت

    نکته طلایی: اگر کنترل‌ها در جای مناسب مهاجرت نکنند، کل تست—even اگر باندهای بیمار طبیعی به‌نظر برسند—باید تکرار شود.

    تفسیر نتایج در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

    تفسیر نتایج الکتروفورز نیازمند شناخت کامل الگوهای مهاجرتی در محیط قلیایی و اسیدی است. در ادامه الگوهای مهم آورده شده است.

    ۱. الگوی مهاجرت در محیط قلیایی (Cellulose Acetate)

    • HbA: سریع‌ترین مهاجر
    • HbF: کندتر از HbA
    • HbA2: در نزدیکی HbF
    • HbS/D/G: هم‌مهاجرت
    • HbC/E/O: نزدیک مبدأ

    ۲. الگوی مهاجرت در محیط اسیدی (Citrate Agar)

    • HbS ← جدا از HbD و HbG
    • HbC ← جدا از HbE
    • HbF رفتار مهاجرتی خاص دارد

    ۳. تفسیر بیماری‌ها

    بتا تالاسمی مینور (Minor)

    • HbA2 ↑ بالای ۳٫۵٪
    • HbF ↑ خفیف
    • MCV ↓
    • RBC ↑

    بتا تالاسمی ماژور (Major)

    • HbF ↑↑↑ (خیلی بالا)
    • HbA کم یا صفر

    HbSS (Sickle Cell Disease)

    • HbS باند غالب
    • HbA وجود ندارد
    • HbF کمی افزایش دارد

    HbAS (Sickle Trait)

    • HbA ~ ۶۰٪
    • HbS ~ ۴۰٪

    HbH Disease

    • ظاهر گلف‌بال (Golf-ball)
    • Bart’s در نوزادان

    گزارش‌دهی استاندارد در روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

    نمونه گزارش نرمال:

    • HbA: ۹۶٪
    • HbA2: ۲٫۵ تا ۳٫۵٪
    • HbF: کمتر از ۱٪
    • هیچ هموگلوبین غیرطبیعی مشاهده نشد.

    نمونه گزارش بتا تالاسمی مینور:

    • HbA: ۹۲٪
    • HbA2: ۵٫۴٪
    • HbF: ۱٫۵٪
    • تفسیر: سازگار با β-Thalassemia trait

سوالات متداول درباره روش انجام الکتروفورز هموگلوبین

۱. روش انجام الکتروفورز هموگلوبین در چه مواردی درخواست می‌شود؟

برای تشخیص تالاسمی، هموگلوبینوپاتی‌ها (HbS, HbC, HbE, HbD، و غیره)، بررسی HbA2 و HbF و بررسی اختلالات ساختاری هموگلوبین انجام می‌شود.

۲. بهترین زمان برای انجام تست پس از نمونه‌گیری چقدر است؟

بهترین زمان ۴۸ ساعت اول است و در دمای ۲ تا ۸ درجه تا ۵–۷ روز قابل قبول است.

۳. چرا HbS در محیط قلیایی از HbD و HbG قابل افتراق نیست؟

به دلیل مشابهت بار الکتریکی در pH قلیایی، این هموگلوبین‌ها هم‌مهاجرت‌اند. در محیط اسیدی از هم جدا می‌شوند.

۴. افزایش فیک HbA2 در چه مواردی دیده می‌شود؟

در کمبود آهن، مصرف داروهای ضدرتروویروس، هموگلوبین S trait و موارد تکنیکی اشتباه ممکن است HbA2 اشتباها افزایش یابد.

۵. آیا ترانسفیوژن روی نتیجه الکتروفورز اثر می‌گذارد؟

بله. ممکن است الگوی ترکیبی HbA فرد اهداکننده و Hb بیمار دیده شود. بهتر است تست حداقل ۳ ماه بعد از ترانسفیوژن انجام شود.

۶. کدام روش دقیق‌تر است: HPLC یا الکتروفورز؟

HPLC برای تعیین درصد HbA2 و HbF دقیق‌تر است، اما الکتروفورز برای تشخیص ساختار و مهاجرت باندها همچنان ضروری است.

۷. آیا HbH با الکتروفورز قلیایی قابل مشاهده است؟

بله، ولی به‌صورت لکه‌لکه (Golf-ball appearance) دیده می‌شود و تفسیر آن نیاز به تجربه دارد.

۸. چرا کنترل HbA باید همیشه در هر سری تست انجام شود؟

زیرا هرگونه تغییر در مهاجرت باند HbA نشان‌دهنده مشکل در بافر، نوار، ولتاژ یا دستگاه است.

۹. بهترین روش خشک‌کردن نوار چیست؟

استفاده از انکوباتور ۳۷°C، زیرا خشک‌کردن سریع‌تر و یکنواخت‌تر انجام می‌شود.

۱۰. آیا با الکتروفورز می‌توان صددرصد HbS را تشخیص داد؟

تشخیص اولیه بله، اما تایید قطعی HbS نیازمند تست اسیدی و گاهی تست حلالیت است.




دیدگاهتان را بنویسید