رنگ‌ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) یک روش استاندارد در بافت‌شناسی است که برای مشاهده ساختارهای بافتی به کار می‌رود. روش رنگ آمیزی رنگ‌ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (روش رنگ آمیزی رنگ‌آمیزی H&E) شامل مراحل آماده‌سازی بافت، رنگ‌آمیزی و آبگیری است. دستورالعمل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین(دستورالعمل رنگ آمیزی H&E) به این شرح است که ، ابتدا بخش‌های بافتی با هماتوکسیلین که یک رنگ بازی است، رنگ می‌شوند تا هسته سلول‌ها به رنگ آبی-بنفش درآید. سپس از ائوزین، که یک رنگ اسیدی است، استفاده می‌شود تا سیتوپلاسم و ماتریکس خارج سلولی به رنگ صورتی تا قرمز درآیند. این کنتراست رنگی امکان تشخیص دقیق و آسان سلول‌ها و بافت‌ها را برای تشخیص‌های پزشکی، به‌ویژه در نمونه‌های سرطانی، فراهم می‌کند.

مقدمه

رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (Hematoxylin and Eosin، اختصاراً H&E) یکی از رایج‌ترین و اساسی‌ترین روش‌های رنگ‌آمیزی در هیستولوژی و پاتولوژی است. این روش برای بررسی ساختار بافت‌ها در سطح میکروسکوپی استفاده می‌شود و به عنوان استاندارد طلایی در تشخیص‌های پزشکی، به ویژه در بررسی بیوپسی‌های سرطانی، شناخته می‌شود. H&E با ایجاد کنتراست بالا بین هسته سلول‌ها (آبی-بنفش) و سیتوپلاسم و ماتریکس خارج سلولی (صورتی) امکان شناسایی الگوهای سلولی و بافتی را فراهم می‌کند. این روش ساده، ارزان و قابل تکرار است و در آزمایشگاه‌های پاتولوژی سراسر جهان کاربرد دارد. در این مقاله، به بررسی اصول، مواد لازم، مراحل انجام (شامل روش‌های پیشرونده و پسرونده)، کاربردها و نکات کلیدی برای کارشناسان آزمایشگاه می‌پردازیم.

اصول رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (اصول رنگ‌آمیزی H&E)

هماتوکسیلین یک رنگ پایه‌ای است که هسته سلول‌ها را به رنگ آبی-بنفش رنگ می‌کند. این رنگ با اکسید شدن به هماتئین تبدیل شده و با یک mordant (مانند آلومینیوم آلوم) ترکیب می‌شود تا به DNA و پروتئین‌های کروماتین بچسبد. مکانیسم دقیق ممکن است شامل پیوندهای کوئوردینانسی با گروه‌های کربوکسیل پروتئین‌ها و DNA باشد. ائوزین، یک رنگ اسیدی آنیونی، ساختارهای ائوزینوفیلیک (مانند پروتئین‌های سیتوپلاسمی، کلاژن و میتوکندری) را به رنگ‌های صورتی تا قرمز رنگ می‌کند. این ترکیب دوگانه اجازه می‌دهد تا ساختارهای بافتی مانند هسته، سیتوپلاسم، غشای پایه و فیبرهای کلاژن به وضوح تمایز یابند. H&E بر اساس تمایل انتخابی بافت‌ها به رنگ‌ها عمل می‌کند و برای بافت‌های ثابت‌شده با فرمالین و جاسازی‌شده در پارافین (FFPE) ایده‌آل است، اما می‌تواند برای بخش‌های منجمد نیز استفاده شود.

مواد لازم

برای انجام رنگ‌آمیزی H&E، مواد و تجهیزات زیر مورد نیاز است:

• محلول هماتوکسیلین: اغلب حاوی mordant مانند آلومینیوم آلوم (مانند Harris یا Mayer hematoxylin).
• محلول ائوزین: معمولاً ائوزین Y (1% در آب یا الکل).
• محلول اسید ضعیف برای تمایز (differentiation): مانند اسید استیک 1% یا اسید هیدروکلریک 0.1%.
• آب قلیایی ملایم برای آبی کردن (bluing): مانند آب آمونیاک یا آب کربنات لیتیم.
• حلال‌ها برای depaffinization و هیدراتاسیون: مانند زایلن، اتانول (در غلظت‌های 100%، 95% و 70%) و آب مقطر.
• تجهیزات: اسلایدها، میکروتوم یا کریوستات، حمام آب، و کاوراسلیپ برای mounting.
• مواد ایمنی: دستکش، عینک و تهویه مناسب برای کار با مواد شیمیایی.

توجه: کیفیت مواد باید بالا باشد و محلول‌ها به طور منظم تعویض شوند تا نتایج تکرارپذیر حاصل شود.

روش تهیه رنگ ائوزین

رنگ ائوزین یک رنگ اسیدی است که معمولاً به صورت پودر تجاری در دسترس است و برای رنگ‌آمیزی اجزای سیتوپلاسمی و ماتریکس خارج سلولی در روش هماتوکسیلین-ائوزین استفاده می‌شود. ائوزین Y (زرد مایل به سبز) رایج‌ترین نوع ائوزین است که به دلیل خاصیت فلورسانس و رنگ‌دهی قوی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ادامه، مراحل تهیه محلول رنگ ائوزین شرح داده شده است:

مواد لازم:

• پودر ائوزین Y (محلول در آب)
• اتانول 70 درصد یا آب مقطر (بسته به نوع محلول مورد نظر)
• اسید استیک (در صورت نیاز برای تنظیم pH)

مراحل تهیه:

1. وزن کردن پودر ائوزین: مقدار 1 تا 2 گرم پودر ائوزین Y را با دقت وزن کنید.
2. حل کردن در حلال: پودر را در 100 میلی‌لیتر اتانول 70 درصد یا آب مقطر حل کنید. برای محلول‌های الکلی، اتانول ترجیح داده می‌شود زیرا پایداری بیشتری به رنگ می‌دهد.
3. هم زدن: محلول را با استفاده از همزن مغناطیسی یا به صورت دستی کاملاً مخلوط کنید تا پودر به طور کامل حل شود.
4. تنظیم pH (اختیاری): در صورت نیاز، چند قطره اسید استیک به محلول اضافه کنید تا pH به حدود 4.5 تا 5 برسد. این کار باعث بهبود رنگ‌آمیزی اجزای اسیدی بافت می‌شود.
5. فیلتر کردن: محلول را از یک کاغذ صافی عبور دهید تا ذرات حل‌نشده حذف شوند.
6. نگهداری: محلول آماده‌شده را در یک بطری تیره‌رنگ در دمای اتاق و دور از نور مستقیم خورشید نگهداری کنید.

نکات:

• محلول ائوزین باید هر چند ماه یک‌بار تعویض شود تا از کاهش کیفیت رنگ‌آمیزی جلوگیری شود.
• برای رنگ‌آمیزی دقیق‌تر، می‌توان از ترکیب ائوزین Y با ائوزین B استفاده کرد.

روش تهیه رنگ هماتوکسیلین

هماتوکسیلین یک رنگ قلیایی است که از عصاره چوب درخت Haematoxylum campechianum استخراج می‌شود و برای رنگ‌آمیزی هسته‌های سلولی در روش H&E استفاده می‌شود. این رنگ به صورت اکسید شده (هماتین) با یون‌های فلزی مانند آلومینیوم یا آهن ترکیب می‌شود تا خاصیت رنگ‌دهی بهتری پیدا کند. در زیر، روش تهیه محلول هماتوکسیلین مایر (Mayer’s Hematoxylin)، یکی از رایج‌ترین انواع آن، شرح داده شده است:

مواد لازم:

• پودر هماتوکسیلین
• پتاسیم آلوم (آلومینیوم پتاسیم سولفات)
• آب مقطر
• کلرات سدیم یا پراکسید هیدروژن (برای اکسیداسیون)
• گلیسرول (اختیاری، برای پایداری)
• اسید استیک یا اسید سیتریک (برای تنظیم pH)

مراحل تهیه:

1. حل کردن آلوم: 50 گرم پتاسیم آلوم را در 1000 میلی‌لیتر آب مقطر گرم (حدود 50 درجه سانتی‌گراد) حل کنید.
2. افزودن هماتوکسیلین: 1 گرم پودر هماتوکسیلین را به محلول اضافه کنید و به آرامی هم بزنید تا کاملاً حل شود.
3. اکسیداسیون: 0.2 گرم کلرات سدیم یا مقدار کمی پراکسید هیدروژن به محلول اضافه کنید تا هماتوکسیلین به هماتین اکسید شود. این مرحله برای فعال شدن خاصیت رنگ‌دهی ضروری است.
4. تنظیم pH: با افزودن مقدار کمی اسید استیک یا اسید سیتریک، pH محلول را به حدود 2.5 تا 3 تنظیم کنید.
5. فیلتر کردن: محلول را از کاغذ صافی عبور دهید تا ناخالصی‌ها حذف شوند.
6. افزودن گلیسرول (اختیاری): برای افزایش پایداری، 50 میلی‌لیتر گلیسرول به محلول اضافه کنید.
7. نگهداری: محلول را در ظرف تیره‌رنگ و در دمای خنک (4 درجه سانتی‌گراد) نگهداری کنید.

نکات:

• محلول هماتوکسیلین باید قبل از استفاده به مدت 1 تا 2 هفته بالغ شود تا به حداکثر کارایی برسد.
• برای جلوگیری از رسوب، محلول را به طور دوره‌ای فیلتر کنید.
• هماتوکسیلین‌های تجاری مانند هماتوکسیلین هریس یا هماتوکسیلین Ehrlich ممکن است روش‌های تهیه متفاوتی داشته باشند.

مراحل انجام رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (مراحل انجام رنگ‌آمیزی H&E)

رنگ‌آمیزی H&E می‌تواند به دو روش پیشرونده (progressive) یا پسرونده (regressive) انجام شود. هر دو روش شامل مراحل آماده‌سازی بافت، رنگ‌آمیزی، تمایز و mounting هستند. مراحل کلی برای بافت‌های FFPE به شرح زیر است:

آماده‌سازی بافت

1. بافت را ثابت کنید (معمولاً با فرمالین 10%).
2. بافت را dehydrate کرده، در پارافین جاسازی کنید و با میکروتوم به ضخامت 4-6 میکرومتر برش دهید.
3. اسلایدها را در زایلن قرار دهید تا پارافین حذف شود (depaffinization، 2-5 دقیقه).
4. اسلایدها را در اتانول با غلظت‌های کاهشی (100%، 95%، 70%) هیدراته کنید (هر کدام 2 دقیقه).
5. در آب مقطر بشویید.

برای سکشن های منجمد (frozen sections)، بافت را در کریوستات برش دهید، در الکل ثابت کنید و مستقیماً به رنگ‌آمیزی بروید.

روش پیشرونده رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (Progressive)

در این روش، بافت به تدریج رنگ می‌گیرد تا به شدت مطلوب برسد. این روش تکرارپذیرتر است و برای آزمایشگاه‌های شلوغ مناسب‌تر.

1. اسلایدها را در محلول هماتوکسیلین (حاوی mordant اضافی یا اسید) برای 3-5 دقیقه قرار دهید.
2. در آب جاری بشویید تا رنگ اضافی حذف شود.
3. در محلول اسید ضعیف (مانند اسید استیک 1%) برای 10-30 ثانیه تمایز دهید تا رنگ هسته‌ها واضح شود.
4. در آب قلیایی ملایم (bluing agent) برای 1-2 دقیقه قرار دهید تا رنگ آبی شود.
5. در آب بشویید.
6. در محلول ائوزین برای 1-3 دقیقه counterstain کنید.
7. در آب بشویید و سپس در اتانول با غلظت‌های افزایشی (70%، 95%، 100%) dehydrate کنید (هر کدام 1 دقیقه).
8. در زایلن شفاف کنید و با رزین mounting کنید.

روش پسرونده رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (Regressive)

در این روش، بافت ابتدا بیش از حد رنگ می‌گیرد و سپس رنگ اضافی حذف می‌شود. این روش تمایز دقیق‌تری فراهم می‌کند اما نیاز به نظارت میکروسکوپی دارد.

1. اسلایدها را در محلول هماتوکسیلین خنثی برای 5-10 دقیقه قرار دهید تا بیش از حد رنگ بگیرند.
2. در آب جاری بشویید.
3. در اسید الکل (مانند HCl 0.1% در اتانول 70%) برای 10-20 ثانیه تمایز دهید تا رنگ اضافی حذف شود (شدت را زیر میکروسکوپ چک کنید).
4. در آب قلیایی ملایم برای bluing قرار دهید.
5. مراحل 5-8 روش پیشرونده را تکرار کنید.

زمان‌ها ممکن است بسته به نوع هماتوکسیلین و ترجیحات پاتولوژیست تغییر کند.

رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین

کاربردها

H&E در موارد زیر کاربرد دارد:

• تشخیص پاتولوژیک: بررسی بیوپسی‌ها برای تشخیص سرطان، التهاب و ناهنجاری‌های بافتی.
• تحقیقات: در مطالعات هیستولوژی، آناتومی و پاتولوژی حیوانی.
• جراحی Mohs: برای بخش‌های منجمد در جراحی پوست.
• پزشکی قانونی و دامپزشکی: برای تشخیص بیماری‌ها در حیوانات و مدل‌های تحقیقاتی.

این روش ساختار کلی بافت را نشان می‌دهد اما برای ساختارهای خاص مانند فیبرهای الاستیک یا لیپیدها، رنگ‌آمیزی‌های ویژه (مانند PAS یا سیلور) لازم است.

نکات کلیدی و troubleshooting برای کارشناسان آزمایشگاه

• کنترل کیفیت: روزانه اسلایدهای کنترل را رنگ‌آمیزی کنید و محلول‌ها را هر 1-2 هفته تعویض کنید. pH محلول‌ها را چک کنید (هماتوکسیلین باید اسیدی باشد).
• مشکلات رایج:
  • هسته‌های کم‌رنگ: زمان هماتوکسیلین را افزایش دهید یا mordant تازه استفاده کنید.
  • سیتوپلاسم بیش از حد صورتی: زمان ائوزین را کاهش دهید.
  • رنگ آبی ضعیف: bluing agent را چک کنید.
  • artifacts: از خشک شدن اسلایدها جلوگیری کنید و از ضخامت مناسب بخش‌ها اطمینان حاصل کنید.
• ایمنی: مواد شیمیایی سمی هستند؛ در فضای تهویه‌دار کار کنید و زباله‌ها را طبق مقررات دفع کنید.
• بهینه‌سازی: روش را بر اساس ترجیحات پاتولوژیست تنظیم کنید و از اتوماسیون برای تکرارپذیری استفاده کنید.
• ذخیره‌سازی: اسلایدهای رنگ‌شده را در تاریکی نگه دارید تا رنگ پایدار بماند (تا سال‌ها بدون محو شدن).

این روش با وجود سادگی، نیاز به تجربه دارد تا نتایج دقیق و قابل اعتماد حاصل شود. برای جزئیات بیشتر، به منابع استاندارد هیستولوژی مراجعه کنید.

سوالات رایج درباره رنگ‌آمیزی H&E

1. تفاوت روش پیشرونده و پسرونده چیست؟

روش پیشرونده به تدریج بافت را رنگ می‌کند تا به شدت مطلوب برسد و نیاز به نظارت کمتری دارد. روش پسرونده بافت را بیش از حد رنگ می‌کند و سپس با تمایز، رنگ اضافی را حذف می‌کند که نیاز به کنترل میکروسکوپی دارد.

2. چرا هسته‌ها گاهی کم‌رنگ می‌شوند؟

این مشکل معمولاً به دلیل زمان ناکافی در هماتوکسیلین یا استفاده از محلول هماتوکسیلین کهنه است. محلول تازه یا افزایش زمان رنگ‌آمیزی می‌تواند مشکل را حل کند.

3. آیا H&E برای سکشن های منجمد مناسب است؟

بله، اما نیاز به تثبیت سریع در الکل و تنظیم زمان‌های رنگ‌آمیزی دارد، زیرا بافت‌های منجمد حساس‌تر هستند.

4. چگونه از artifacts در اسلایدها جلوگیری کنیم؟

از خشک شدن اسلایدها در حین فرآیند جلوگیری کنید، از برش‌های یکنواخت استفاده کنید و محلول‌ها را مرتب تعویض کنید.

5. چه زمانی باید محلول‌های رنگ‌آمیزی تعویض شوند؟

هر 1-2 هفته یا پس از رنگ‌آمیزی تعداد مشخصی اسلاید (بسته به حجم کار آزمایشگاه). همچنین pH محلول‌ها را چک کنید.

6. آیا می‌توان از H&E برای تشخیص همه بیماری‌ها استفاده کرد؟

خیر، H&E ساختار کلی بافت را نشان می‌دهد. برای ساختارهای خاص مانند لیپیدها یا فیبرهای الاستیک، رنگ‌آمیزی‌های ویژه مانند PAS یا Verhoeff لازم است.

7. چرا رنگ ائوزین گاهی بیش از حد شدید است؟

زمان طولانی در ائوزین یا غلظت بالای محلول می‌تواند باعث این مشکل شود. زمان را کاهش دهید یا محلول را رقیق کنید.

8. نقش bluing agent چیست؟

Bluing agent (مانند آب آمونیاک) رنگ هماتوکسیلین را از بنفش به آبی شفاف تبدیل می‌کند و کنتراست بهتری ایجاد می‌کند.

9. آیا می‌توان از H&E در آزمایشگاه‌های اتوماتیک استفاده کرد؟

بله، دستگاه‌های اتوماتیک رنگ‌آمیزی H&E نتایج یکنواخت‌تری ارائه می‌دهند، اما نیاز به تنظیم دقیق پروتکل دارند.

10. چگونه اسلایدهای رنگ‌شده را برای مدت طولانی حفظ کنیم؟

اسلایدها را در محیط تاریک و خشک نگه دارید و از رزین باکیفیت برای mounting استفاده کنید تا از محو شدن رنگ جلوگیری شود.

11. ائوزین اسیدی است یا بازی؟

ائوزین یک رنگ اسیدی است. این رنگ به دلیل خاصیت اسیدی خود به اجزای قلیایی بافت مانند سیتوپلاسم، کلاژن و سایر ساختارهای خارج سلولی متصل می‌شود و آن‌ها را به رنگ صورتی تا قرمز درمی‌آورد.

12. هماتوکسیلین اسیدی است یا بازی؟

هماتوکسیلین یک رنگ قلیایی (بازی) است. این رنگ پس از اکسیداسیون به هماتین تبدیل شده و با یون‌های فلزی (مانند آلومینیوم یا آهن) ترکیب می‌شود تا به اجزای اسیدی بافت مانند DNA و RNA در هسته سلول متصل شود و آن‌ها را به رنگ آبی یا بنفش رنگ‌آمیزی کند.

13. کاربرد محلول ائوزین چیست؟

محلول ائوزین در رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) برای رنگ‌آمیزی اجزای سیتوپلاسمی، ماتریکس خارج سلولی، فیبرهای کلاژن و سایر ساختارهای غیرهسته‌ای استفاده می‌شود. این رنگ به بافت‌ها رنگ صورتی تا قرمز می‌دهد و به تمایز ساختارهای مختلف در نمونه‌های بافت‌شناسی کمک می‌کند.

14. کاربرد محلول هماتوکسیلین چیست؟

محلول هماتوکسیلین در رنگ‌آمیزی H&E برای رنگ‌آمیزی هسته‌های سلولی به کار می‌رود. این رنگ به دلیل اتصال به اجزای اسیدی مانند DNA و RNA، هسته‌ها را به رنگ آبی یا بنفش درمی‌آورد و امکان بررسی دقیق ساختارهای هسته‌ای در مطالعات بافت‌شناسی و پاتولوژی را فراهم می‌کند.

برای مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید:

Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections