فهرست مطالب روش رنگ آمیزی گیمسا

• مقدمه روش رنگ آمیزی گیمسا در هماتولوژی
• اصول رنگ‌آمیزی Giemsa و مبانی روش رنگ آمیزی گیمسا
• تهیه محلول مادر (Giemsa Stock Solution)
• تهیه محلول کاری رنگ آمیزی گیمسا (Giemsa Working Solution)
• مراحل روش رنگ آمیزی گیمسا برای لام خون محیطی
• کنترل کیفی روش رنگ آمیزی گیمسا در هماتولوژی
• عیب‌یابی مشکلات رنگ‌آمیزی Giemsa
• تفسیر رنگ‌ها در لام رنگ‌آمیزی‌شده با گیمسا
• نکات ایمنی و نگهداری رنگ Giemsa
• سوالات متداول روش رنگ آمیزی گیمسا (FAQ)
• منابع معتبر برای مطالعه بیشتر درباره رنگ‌آمیزی گیمسا

مقدمه روش رنگ آمیزی گیمسا در هماتولوژی

رنگ‌آمیزی Giemsa یکی از اساسی‌ترین روش‌های رنگ‌آمیزی در هماتولوژی است و از بیش از یک قرن پیش تاکنون در تمام آزمایشگاه‌های تشخیص طبی دنیا استفاده می‌شود.
این روش به‌دلیل قدرت تفکیک بالای آن در نمایش جزئیات سلول‌های خونی، هنوز هم انتخاب اول برای بررسی لام محیطی خون (Peripheral Blood Smear)، مغز استخوان و تشخیص برخی انگل‌ها محسوب می‌شود.

این رنگ بر پایه‌ی ترکیب سه رنگ اصلی ساخته شده است:

• Methylene Blue (رنگ بازی)
• Eosin Y (رنگ اسیدی)
• Azure B (مشتق اکسید شده متیلن بلو)

این ترکیب در محیط بافر با pH حدود 7.0 تا 7.2 به حالت متاکروماتیک درمی‌آید و باعث تمایز رنگی چشمگیری بین اجزای سلول می‌شود.
به این ترتیب، اجزای اسیدی سلول مانند DNA و RNA با رنگ‌های بازی (آبی تا بنفش) و اجزای بازی مانند پروتئین‌های سیتوپلاسم با رنگ‌های اسیدی (صورتی تا قرمز) رنگ می‌گیرند.

لام خون محیطی رنگ شده با رنگ گیمسا

اصول رنگ‌آمیزی Giemsa و مبانی روش رنگ آمیزی گیمسا

رنگ Giemsa از گروه Romanowsky stains است و اساس عملکرد آن بر واکنش‌های بین رنگ‌های اسیدی و بازی در حضور یک بافر با pH دقیق است.
در pH=7.2، اجزای سلولی به‌صورت زیر رنگ می‌گیرند:

از آنجا که تعادل pH کلید اصلی کیفیت رنگ‌آمیزی است، کوچک‌ترین انحراف از pH=7.2 می‌تواند باعث تغییر محسوس در رنگ نهایی سلول‌ها شود.

تهیه محلول مادر (Giemsa Stock Solution) در روش رنگ آمیزی گیمسا

در این بخش از روش رنگ آمیزی گیمسا، محلول مادر (استوک) Giemsa را برای استفاده در محلول‌های کاری تهیه می‌کنیم.

مواد لازم:

• پودر رنگ Giemsa (درجه آزمایشگاهی، 3.8 گرم)
• متانول مطلق (Methanol 100%)، 250 میلی‌لیتر
• گلیسرول خالص (Glycerol)، 250 میلی‌لیتر
• بطری شیشه‌ای تیره 500 میلی‌لیتری
• مهره‌های شیشه‌ای کوچک (حدود 50 عدد)
• ترازوی دیجیتال دقیق (0.01 گرم)
• همزن یا شیکر

روش تهیه:

1. مهره‌های شیشه‌ای را با متانول شسته و خشک کنید.
2. 3.8 گرم پودر رنگ را داخل بطری بریزید.
3. 100 میلی‌لیتر متانول اضافه کنید و 3 دقیقه تکان دهید تا رنگ شروع به حل شدن کند.
4. 250 میلی‌لیتر گلیسرول اضافه کرده و 5 دقیقه تکان دهید.
5. بقیه متانول را بریزید و بطری را درب‌دار کرده، 6 مرتبه در طول روز تکان دهید.
6. این کار را حداقل 7 روز ادامه دهید تا محلول یکنواخت شود.
7. بطری را برچسب‌گذاری کنید (Batch No، تاریخ تهیه و انقضا، نام تهیه‌کننده).
8. محلول را در جای تاریک و خنک نگهداری کنید (دور از نور مستقیم).

تهیه محلول کاری رنگ آمیزی گیمسا (Giemsa Working Solution)

بلافاصله قبل از رنگ‌آمیزی، در روش رنگ آمیزی گیمسا باید محلول کاری تازه از محلول مادر تهیه شود.

برای رنگ‌آمیزی سریع (10%)

• 9 میلی‌لیتر بافر pH 7.2
• 1 میلی‌لیتر محلول مادر
• مخلوط کرده و حداکثر ظرف 15 دقیقه مصرف شود.

برای رنگ‌آمیزی آهسته (3%)

• 97 میلی‌لیتر بافر pH 7.2
• 3 میلی‌لیتر محلول مادر
• بلافاصله مصرف شود.

مراحل روش رنگ آمیزی گیمسا برای لام خون محیطی

در این بخش پروتکل کامل روش رنگ آمیزی گیمسا برای لام خون محیطی (Peripheral Blood Smear) را گام‌به‌گام مرور می‌کنیم.

1. آماده‌سازی لام:

– از خون تازه و بدون EDTA زیاد استفاده کنید.
– لام را در هوای آزاد خشک کنید و از حرارت مستقیم اجتناب نمایید.

2. فیکساسیون:

– لام نازک را با متانول خالص به مدت 3 دقیقه فیکس کنید.
– متانول باید خشک و خنک باشد (درپوش‌دار نگهداری شود).

3. رنگ‌آمیزی:

– محلول کاری را روی لام بریزید تا سطح آن کاملاً پوشیده شود.
– زمان رنگ‌آمیزی:
– 10% → حدود 10 دقیقه
– 3% → حدود 45 دقیقه

4. شستشو:

– لام را با آب بافر pH 7.2 به‌آرامی بشویید تا رنگ اضافی خارج شود.
– از آب مقطر یا آب سخت استفاده نکنید.

5. خشک کردن:

– لام را به‌صورت ایستاده خشک کنید تا اثر قطرات باقی نماند.

6. مشاهده:

– ابتدا با عدسی ×10 محل تمرکز را بیابید، سپس با عدسی روغنی ×100 بررسی کنید.

کنترل کیفی روش رنگ آمیزی گیمسا در هماتولوژی

کنترل کیفی در هماتولوژی با هدف اطمینان از کیفیت رنگ، دقت pH، و وضوح اجزای سلولی انجام می‌شود. برخلاف کنترل‌های مخصوص مالاریا، این بخش روی تشخیص مورفولوژی گلبول‌ها و پلاکت‌ها تمرکز دارد.

1. کنترل کیفی داخلی:

بررسی ظاهری لام رنگ‌شده:
– لام باید ظاهری خاکستری-آبی ملایم داشته باشد.
– وجود ته‌رنگ قرمز نشانه pH پایین و ته‌رنگ آبی تیره نشانه pH بالا است.

ارزیابی کیفیت سلولی:
– RBCها: یکنواخت و بدون لیز شدن
– WBCها: هسته واضح و جزئیات کروماتین مشخص
– پلاکت‌ها: بنفش روشن، بدون تجمع
– پس‌زمینه شفاف و تمیز

بررسی در لام کنترل:
– از لام خون سالم استاندارد به عنوان کنترل استفاده شود.
– اگر تغییر رنگ مشهود بود، QC محلول و بافر انجام شود.

مستندسازی:
– تمام موارد QC (شماره بچ، تاریخ، pH، نتایج مشاهده‌شده) ثبت گردد.

جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی رنگ آمیزی گیمسا به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی رنگ گیمسا (Giemsa Stain): روش انجام، ارزیابی کیفیت و نکات مهم آزمایشگاهی

عیب‌یابی مشکلات رنگ‌آمیزی Giemsa در روش رنگ آمیزی گیمسا

در جدول زیر مشکلات رایج در روش رنگ آمیزی گیمسا، علل احتمالی و راه‌حل‌های پیشنهادی آورده شده است.

تفسیر رنگ‌ها در لام رنگ‌آمیزی‌شده با گیمسا

در روش رنگ آمیزی گیمسا، تفسیر صحیح رنگ‌ها برای تشخیص دقیق مورفولوژی سلول‌ها ضروری است.

نکات ایمنی و نگهداری رنگ Giemsa در روش رنگ آمیزی گیمسا

– رنگ Giemsa را در بطری قهوه‌ای در دمای اتاق (20–25°C) نگهداری کنید.
– از تماس مستقیم با نور آفتاب خودداری شود.
– بطری‌ها را کاملاً درب‌دار نگه دارید تا از جذب رطوبت جلوگیری شود.
– محلول کاری هرگز بیش از 15–30 دقیقه نگهداری نشود.
– در هنگام کار با متانول از هود یا تهویه مناسب استفاده کنید.

سوالات متداول روش رنگ آمیزی گیمسا (FAQ)

1. چرا بعضی لام‌ها بیش از حد آبی می‌شوند؟

pH بافر بیش از حد قلیایی (مثلاً 7.4 یا بالاتر) باعث می‌شود پروتئین‌های بازی سیتوپلاسم رنگ بیشتری جذب کنند و لام به رنگ آبی مایل شود. برای رفع مشکل، pH بافر را به 7.2 تنظیم کرده و زمان رنگ‌آمیزی را کاهش دهید.

2. چرا گلبول‌های قرمز من قرمز یا نارنجی دیده می‌شوند؟

احتمالاً pH بافر پایین (اسیدی) بوده است. در pH پایین، رنگ اسیدی (Eosin) غالب می‌شود و RBCها قرمز روشن به نظر می‌رسند. همیشه قبل از شروع کار pH را با کاغذ اندیکاتور کنترل کنید.

3. آیا می‌توان از آب مقطر به‌جای بافر استفاده کرد؟

خیر. pH آب مقطر معمولاً در اثر جذب CO₂ از هوا اسیدی می‌شود (pH≈6) و باعث تغییر رنگ‌ها می‌گردد. آب مقطر فقط برای شستشو مجاز است نه برای تهیه محلول کاری.

4. بهترین دمای رنگ‌آمیزی چقدر است؟

دمای اتاق (22–25°C). دمای بالاتر موجب تسریع واکنش و احتمال رنگ‌پریدگی می‌شود.

5. آیا می‌توان لام‌های آماده را بعداً رنگ‌آمیزی کرد؟

بله، به‌شرط آن‌که در محیط خشک، بدون رطوبت و گردوغبار نگهداری شده باشند. در صورت نگهداری بیش از یک هفته، توصیه می‌شود لام‌ها مجدداً با متانول فیکس شوند.

6. چگونه بفهمیم رنگ خراب شده است؟

رنگ کهنه معمولاً دارای رسوب، ته‌رنگ قهوه‌ای، یا بوی ترشیدگی است. در چنین حالتی، رنگ‌آمیزی نامتعادل خواهد بود و باید رنگ تازه تهیه شود.

7. چطور می‌توان لام رنگ‌شده را بهتر حفظ کرد؟

لام‌های رنگ‌شده را در جعبه مخصوص لام و در محیط خشک نگهداری کنید. قرار دادن در نزدیکی مواد اسیدی (مثل بخارات سرکه) می‌تواند رنگ را تغییر دهد.

8. آیا رنگ Giemsa برای مغز استخوان هم کاربرد دارد؟

بله، اما معمولاً با غلظت 10% و زمان کوتاه‌تر (7–10 دقیقه) استفاده می‌شود تا جزئیات سلولی حفظ گردد.

9. آیا رنگ‌آمیزی Giemsa با Wright تفاوت دارد؟

بله. Wright زمان کوتاه‌تر دارد و بیشتر برای CBC یا اسمیرهای خودکار استفاده می‌شود. Giemsa وضوح بهتری در کروماتین و سیتوپلاسم ایجاد می‌کند.

10. چه اشتباهاتی در کنترل کیفی رایج است؟

– استفاده از آب غیر بافر
– عدم کنترل pH
– نگهداری طولانی محلول کاری
– شستشوی خشن لام
– عدم فیلتر رنگ قبل از مصرف

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر درباره رنگ‌آمیزی گیمسا

• 
  WHO – Basic Malaria Microscopy. Part I: Learner’s Guide
  
• 
  CDC – Laboratory Diagnosis of Malaria: Staining for Malaria Parasites
  
• 
  PubMed – مقالات مروری درباره Giemsa Stain در هماتولوژی