محیط کشت EMB: راهنمای جامع و کاربردی
خلاصه محیط کشت EMB: محیط کشت EMB ( محیط کشت Eosin Methylene Blue Agar) یک محیط انتخابی و تمایزی برای جداسازی باکتری‌های گرم منفی روده‌ای مانند E. coli است. این محیط بر اساس تخمیر لاکتوز عمل می‌کند و کلنی‌های تخمیرکننده را با رنگ آبی-سیاه و درخشندگی فلزی سبز نشان می‌دهد، در حالی که غیرتخمیرکننده‌ها کلنی‌های بی‌رنگ تولید می‌کنند. کاربرد اصلی آن در تشخیص عفونت‌های ادراری، مدفوعی و کنترل کیفیت آب است و با مهار رشد گرم مثبت‌ها، شناسایی سریع پاتوژن‌ها را تسهیل می‌کند.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education
فهرست مطالب
مقدمه
محیط کشت EMB یا Eosin Methylene Blue Agar، یک محیط کشت انتخابی و تمایزی است که برای جداسازی و شناسایی باکتری‌های گرم منفی، به ویژه باکتری‌های روده‌ای (انتروباکتریاسه) استفاده می‌شود. این محیط توسط هولت-هریس و تیگ توسعه یافت و بعداً توسط لوین اصلاح شد. EMB حاوی رنگ‌های ائوزین Y و متیلن بلو است که به عنوان مهارکننده‌های انتخابی عمل می‌کنند و رشد باکتری‌های گرم مثبت را تا حد زیادی مهار می‌کنند. اصل کار این محیط بر اساس تمایز باکتری‌ها بر پایه توانایی تخمیر لاکتوز است: باکتری‌هایی که لاکتوز را تخمیر می‌کنند، اسید تولید کرده و رنگ محیط را تغییر می‌دهند، در حالی که باکتری‌های غیرتخمیرکننده لاکتوز، کلنی‌های بی‌رنگ یا روشن تولید می‌کنند. برای مثال، Escherichia coli کلنی‌هایی با درخشندگی فلزی سبز تولید می‌کند. این محیط در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی پزشکی و کنترل کیفیت آب کاربرد گسترده‌ای دارد.
کاربرد محیط کشت EMB در میکروبیولوژی
محیط کشت EMB عمدتاً برای جداسازی و تمایز باکتری‌های گرم منفی روده‌ای از نمونه‌های بالینی و غیربالینی مانند ادرار، مدفوع، آب و مواد غذایی استفاده می‌شود. این محیط در تشخیص پاتوژن‌هایی مانند E. coli، Salmonella و Shigella مفید است، زیرا باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز (مانند E. coli) را از غیرتخمیرکننده‌ها (مانند Salmonella) تمایز می‌دهد. همچنین در تست‌های کیفیت آب برای شناسایی کلیفرم‌ها و کلیفرم‌های فکال (نشانه آلودگی با پاتوژن‌ها) کاربرد دارد. EMB در تمایز گروه‌های باکتریایی مانند گروه کولون-تیفوئید-دیسانتری مفید است و به شناسایی سریع باکتری‌های غیرپاتوژن و پاتوژن کمک می‌کند.
روش تهیه محیط کشت EMB به صورت گام به گام
برای تهیه محیط EMB، ترکیبات زیر برای یک لیتر محیط لازم است:
- پپتیک دایجست بافت حیوانی: ۱۰ گرم
- دی‌پتاسیم فسفات: ۲ گرم
- لاکتوز: ۵ گرم
- ساکارز: ۵ گرم
- ائوزین Y: ۰.۴ گرم
- متیلن بلو: ۰.۰۶۵ گرم
- آگار: ۱۳.۵ گرم
- pH نهایی (در ۲۵ درجه سانتی‌گراد): ۷.۲ ± ۰.۲
روش تهیه به شرح زیر است:
- ۳۵.۹۶ گرم از پودر محیط را در ۱۰۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر معلق کنید.
- مخلوط را تا جوش حرارت دهید تا کاملاً حل شود.
- در اتوکلاو با فشار ۱۵ پوند (۱۲۱ درجه سانتی‌گراد) به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید (از حرارت بیش از حد اجتناب کنید).
- تا ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد خنک کنید و ظرف را تکان دهید تا متیلن بلو اکسید شود (رنگ آبی بازگردد) و رسوب معلق شود.
- در پتری دیش‌های استریل بریزید و اجازه دهید تا سطح آگار خشک شود.
کنترل کیفی محیط کشت EMB
کنترل کیفی EMB شامل بررسی ظاهر محیط (باید سبز مایل به نارنجی و کمی کدر باشد)، تست استریلیتی (عدم رشد پس از انکوباسیون بدون تلقیح)، و تست عملکرد با باکتری‌های کنترل است. برای مثال:
- E. coli: رشد خوب با کلنی‌های آبی-سیاه با درخشندگی فلزی سبز.
- Salmonella Typhimurium: رشد خوب با کلنی‌های بی‌رنگ.
- Staphylococcus aureus: رشد ضعیف یا مهار شده.
همچنین، pH باید ۷.۲ ± ۰.۲ باشد و محیط باید در برابر نور محافظت شود تا رنگ‌ها تجزیه نشوند.
جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی میکروبیولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:
کنترل کیفی میکروب شناسی: اصول، روش‌ها و استانداردهای عملکردی
روش کشت بر روی محیط EMB
- نمونه را پس از جمع‌آوری تلقیح کنید.
- اگر نمونه مایع است، با لوپ استریل رگه‌کشی کنید تا کلنی‌های ایزوله تشکیل شود.
- اگر سواب است، سواب را روی ناحیه کوچکی بغلتانید و سپس با لوپ رگه‌کشی کنید.
- پتری دیش را در دمای ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸-۲۴ ساعت انکوبه کنید (از نور محافظت کنید).
- پس از ۲۴ ساعت، کلنی‌ها را از نظر مورفولوژی بررسی کنید؛ اگر منفی بود، ۲۴ ساعت دیگر انکوبه کنید.
تفسیر نتایج:
- E. coli: کلنی‌های تخت، آبی-سیاه با درخشندگی فلزی سبز.
- Klebsiella pneumoniae: کلنی‌های صورتی، موکوئید.
- Salmonella: کلنی‌های بی‌رنگ یا روشن.
محیط کشت EMB
محدودیت‌های محیط کشت EMB و چالش‌های آن
- برخی سویه‌های Salmonella و Shigella ممکن است روی EMB رشد نکنند.
- باکتری‌های گرم مثبت مانند انتروکوک‌ها یا استافیلوکوک‌ها ممکن است رشد کنند، اما کلنی‌های کوچک (پین‌پوینت) تشکیل دهند.
- باید همراه با محیط غیرانتخابی استفاده شود تا رشد همه باکتری‌ها بررسی شود.
- برخی باکتری‌های غیرپاتوژن غیرتخمیرکننده لاکتوز نیز رشد می‌کنند و ممکن است با پاتوژن‌ها اشتباه شوند.
- برای شناسایی کامل، تست‌های بیوشیمیایی یا مولکولی اضافی لازم است.
سوالات رایج
چرا کلنی‌های E. coli بر روی محیط کشت EMB درخشندگی فلزی سبز دارند؟
این به دلیل تولید اسید زیاد از تخمیر سریع لاکتوز است که باعث رسوب رنگ‌ها می‌شود.
آیا EMB برای باکتری‌های گرم مثبت مناسب است؟
خیر، EMB انتخابی برای گرم منفی است و گرم مثبت‌ها را مهار می‌کند، اما برخی ممکن است رشد ضعیفی داشته باشند.
چگونه EMB را ذخیره کنیم؟
در دمای ۲-۸ درجه سانتی‌گراد، دور از نور مستقیم، و قبل از استفاده بررسی کنید که خشک نشده باشد.
تفاوت EMB با MacConkey Agar چیست؟
هر دو انتخابی برای گرم منفی هستند، اما EMB تمایز بهتری برای E. coli با درخشندگی فلزی ارائه می‌دهد، در حالی که MacConkey ساده‌تر است.
آیا EMB برای تشخیص قطعی کافی است؟
خیر، برای شناسایی دقیق، تست‌های اضافی مانند بیوشیمیایی لازم است.
ماندگاری محیط کشت EMB چقدر است؟
محیط آماده شده تا ۲ هفته در یخچال (۲-۸ درجه سانتی‌گراد) و پودر خشک تا ۳ سال در دمای اتاق ماندگار است، مشروط به محافظت از نور.
تفاوت محیط EMB با SS Agar چیست؟
SS Agar برای جداسازی Salmonella و Shigella طراحی شده و حاوی نمک صفراوی بیشتری است، در حالی که EMB بر تخمیر لاکتوز تمرکز دارد و برای E. coli مناسب‌تر است.
آیا محیط EMB برای شناسایی Pseudomonas مناسب است؟
خیر، Pseudomonas غیرتخمیرکننده است و کلنی‌های بی‌رنگ تولید می‌کند، اما EMB برای Pseudomonas انتخابی نیست و محیط‌های دیگری مانند Cetrimide Agar بهتر عمل می‌کنند.
چگونه کلنی‌های Salmonella را روی EMB تأیید کنیم؟
کلنی‌های بی‌رنگ یا روشن را با تست‌های بیوشیمیایی مانند TSI یا سرولوژی تأیید کنید، زیرا EMB فقط تمایز اولیه ارائه می‌دهد.
نقش ساکارز در ترکیب محیط EMB چیست؟
ساکارز به عنوان قند اضافی برای تمایز باکتری‌های تخمیرکننده مانند برخی سویه‌های Klebsiella عمل می‌کند و کمک به تولید کلنی‌های صورتی می‌کند.
جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراحعه کنید: