فهرست مطالب
آزمایش کومبس مستقیم یک روش سرولوژیک در بانک خون و هماتولوژی است که برای تشخیص گلبول‌های قرمز حساس شده با آنتی‌بادی‌های IgG و/یا کمپلمان C3 در داخل بدن (in vivo) به کار می‌رود. این آزمایش برای تشخیص بیماری‌هایی مانند کم‌خونی همولیتیک خودایمنی و بیماری همولیتیک نوزادان کاربرد دارد.
روش انجام آزمایش کومبس مستقیم (روش انجام آزمایش دایرکت کومبس) شامل مراحل کلیدی زیر است:
۱- آماده‌سازی سوسپانسیون: تهیه یک سوسپانسیون ۲ تا ۵ درصدی از گلبول‌های قرمز بیمار. ۲- شستشوی کامل نمونه: گلبول‌های قرمز حداقل ۳ تا ۴ بار با سالین ۰.۹% شسته می‌شوند تا تمامی پروتئین‌ها و آنتی‌بادی‌های آزاد حذف شوند.۳- افزودن معرف: اضافه کردن معرف آنتی‌هیومن گلوبولین (AHG) به نمونه شسته شده. ۴- سانتریفیوژ: سانتریفیوژ نمونه به مدت ۱۵ تا ۳۰ ثانیه در سرعت ۹۰۰ تا ۱۰۰۰ دور در دقیقه. ۵- بررسی و خوانش: بررسی لوله‌ها با استفاده از آینه مقعر برای مشاهده آگلوتیناسیون۶- کنترل کیفی: در صورت مشاهده واکنش منفی، یک قطره از گلبول‌های قرمز حساس شده به لوله اضافه می‌شود. مشاهده آگلوتیناسیون در این مرحله، صحت عملکرد معرف AHG را تأیید می‌کند.
این روش به تشخیص مواردی که در آنها سیستم ایمنی به گلبول‌های قرمز خودی حمله کرده، کمک شایانی می‌کند.
مقدمه
این مقاله، روش عملکردی استاندارد (SOP) برای روش انجام آزمایش کومبس مستقیم (آزمایش دایرکت کومبس) یا آنتی‌گلوبولین مستقیم (DAT) را شرح می‌دهد. هدف از این آزمایش، تشخیص گلبول‌های قرمز حساس شده با IgG و یا کمپلمان (Complement C3) در داخل بدن است. این آزمایش در تشخیص بیماری‌هایی مانند کم‌خونی همولیتیک یا واکنش‌های انتقال خون کاربرد دارد.
تفاوت با آزمایش کومبس غیرمستقیم
- کومبس مستقیم (DAT): وجود آنتی‌بادی‌های متصل به گلبول‌های قرمز در بدن بیمار (In Vivo) را بررسی می‌کند.
- کومبس غیرمستقیم (IAT): وجود آنتی‌بادی‌های آزاد (شناور) در سرم خون بیمار را بررسی می‌کند. این آزمایش معمولاً برای غربالگری قبل از انتقال خون و بررسی وجود آنتی‌بادی‌های نامنظم استفاده می‌شود تا از واکنش‌های ناشی از انتقال خون جلوگیری شود.
۱. دامنه کاربرد و نمونه‌گیری
این روش برای استفاده در بانک‌های خون بیمارستانی و مراکز مصرف‌کننده خون و فرآورده‌های خونی تدوین شده است. نمونه مورد نیاز برای انجام آزمایش، حداقل ۲.۵ میلی‌لیتر خون کامل است که باید در لوله حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع‌آوری شود.
۲. تجهیزات و مواد مورد نیاز
- لوله آزمایش ۱۲x۷۵ میلی‌متر
- سانتریفیوژ سرولوژیک کالیبره شده
- معرف آنتی‌هیومن گلوبولین پلی‌اسپسیفیک (Polyspecific Antihuman Globulin)
- گلبول قرمز کنترل حساس شده با IgG (IgG Control Cells)
- سالین ۰.۹%
- پیپت یک‌بار مصرف
- لامپ بازرسی و روشنایی
- جالوله‌ای
۳. ملاحظات ایمنی و کنترل کیفی
ایمنی: هنگام کار، استفاده از دستکش و عینک محافظ الزامی است. برای دفع تمامی مواد بیولوژیک و زباله‌های تیز و برنده، باید از سیفتی‌باکس استفاده شود.
کنترل کیفی: کنترل کیفی روزانه مطابق با SOP مربوطه و همچنین نگهداری و پایش دمایی تجهیزات و محیط بانک خون باید انجام شود. نتایج آزمایش باید در نرم‌افزار یا لیست کار دستی بیمارستانی ثبت شوند.
۴. مراحل اجرای آزمایش
- آماده‌سازی لوله‌ها: دو لوله ۱۲x۷۵ میلی‌متر را نشانه‌گذاری کنید.
- افزودن نمونه: به هر یک از لوله‌ها، یک قطره سوسپانسیون ۲ تا ۵ درصدی از نمونه بیمار اضافه کنید.
روش تهیه ی سوسپانسیون گلبول های قرمز را در مقاله ی زیر مطالعه بفرمایید:
راهنمای کامل و مرحله به مرحله تهیه سوسپانسیون گلبول های قرمز برای آزمایش کومبس
3. شستشو: گلبول‌های قرمز هر لوله را ۳ تا ۴ بار با سالین ۰.۹% به خوبی شستشو دهید. در مرحله آخر، سالین را کاملاً تخلیه کنید.
4. افزودن معرف‌ها:
-
- به لوله ۱، مقدار مناسبی AHG مطابق دستورالعمل سازنده(دو قطره) اضافه کنید.
- به لوله ۲، دو قطره سالین ۰.۹% اضافه کنید.
5. سانتریفوژ و خوانش اولیه: محتویات لوله‌ها را به آرامی مخلوط کرده و به مدت ۱۵ تا ۳۰ ثانیه با سرعت ۹۰۰ تا ۱۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ کنید. سپس لوله‌ها را به آرامی خارج کرده و بلافاصله با استفاده از لامپ بازرسی، هرگونه آگلوتیناسیون را بررسی کنید.
6. ثبت نتایج: هرگونه واکنش مشاهده شده را درجه‌بندی و ثبت کنید.
7. انکوباسیون (در صورت منفی بودن لوله‌ها): در صورت مشاهده واکنش منفی، مطابق دستورالعمل سازنده، لوله‌های واکنش منفی را به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس مجدداً سانتریفوژ کنید. مراحل خوانش و ثبت را تکرار کنید.
روش انجام آزمایش کومبز مستقیم
۵. کنترل منفی کاذب و تفسیر نتایج
کنترل منفی کاذب: در صورت منفی بودن واکنش لوله حاوی AHG، یک قطره از گلبول قرمز حساس شده را به آن لوله اضافه کنید. لوله را سانتریفوژ کنید؛ باید یک واکنش مثبت مشاهده شود.
تفسیر نتایج:
- لوله ۱ (با AHG): اگر واکنش مثبت باشد، نتیجه DAT مثبت است.
- لوله ۲ (با سالین): این لوله به عنوان کنترل منفی عمل می‌کند. اگر مثبت باشد، نتیجه غیر قابل گزارش است.
- لوله ۱ و ۲ (هر دو منفی): نتیجه DAT منفی است.
نکات:
- در صورت مشاهده واکنش‌های ضعیف و مشکوک، از میکروسکوپ استفاده کنید.
- اگر پس از افزودن گلبول قرمز حساس شده، همچنان واکنش منفی مشاهده شود، این نشان‌دهنده خطاهایی مانند اضافه نشدن AHG، شستشوی نامناسب یا کاهش توان معرف AHG است و آزمایش باید تکرار شود.
۶. محدودیت‌ها
- نمونه خونی که بیش از ۴۸ ساعت از خونگیری آن گذشته باشد، نباید برای آزمایش استفاده شود.
- معرف‌های AHG مختلف (پلی‌اسپسیفیک و آنتی-IgG) می‌توانند با حداقل ۲۰۰-۵۰۰ مولکول IgG روی غشای هر گلبول قرمز واکنش دهند. اگر تعداد IgGهای چسبیده به گلبول قرمز کمتر از این مقدار باشد، ممکن است نتایج منفی شوند.
۷. سوالات متداول
- آزمایش کومبس مستقیم چیست؟
آزمایش کومبس مستقیم (DAT) برای تشخیص گلبول‌های قرمز حساس شده با IgG یا کمپلمان در بدن استفاده می‌شود. - چه زمانی آزمایش کومبس مستقیم انجام می‌شود؟
این آزمایش برای تشخیص کم‌خونی همولیتیک، واکنش‌های انتقال خون یا بیماری‌های خودایمنی انجام می‌شود. - چرا نتیجه کومبس مستقیم مثبت می‌شود؟
نتیجه مثبت نشان‌دهنده وجود آنتی‌بادی‌های IgG یا کمپلمان روی گلبول‌های قرمز است. - نمونه مورد نیاز برای آزمایش DAT چیست؟
حداقل ۲.۵ میلی‌لیتر خون کامل در لوله EDTA. - آیا آزمایش DAT خطرناک است؟
خیر، این آزمایش روی نمونه خون انجام می‌شود و هیچ خطری برای بیمار ندارد. - چرا شستشوی گلبول‌های قرمز مهم است؟
شستشو برای حذف پروتئین‌های غیراختصاصی و جلوگیری از نتایج کاذب ضروری است. - چه عواملی باعث نتیجه کاذب در کومبس مستقیم می‌شوند؟
شستشوی ناکافی، معرف AHG نامناسب یا نمونه قدیمی می‌توانند نتایج کاذب ایجاد کنند. - آزمایش کومبس مستقیم چه تفاوتی با آزمایش کومبس غیرمستقیم دارد؟
DAT حساسیت گلبول‌های قرمز در بدن را بررسی می‌کند، در حالی که کومبس غیرمستقیم آنتی‌بادی‌های موجود در سرم را تشخیص می‌دهد. - آیا نتایج DAT همیشه دقیق هستند؟
خیر، اگر تعداد مولکول‌های IgG کمتر از ۲۰۰-۵۰۰ باشد، ممکن است نتیجه منفی کاذب شود. - چگونه نتایج DAT ثبت می‌شوند؟
نتایج باید در نرم‌افزار بیمارستانی یا لیست کار دستی ثبت شوند.
جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید:
The Direct Antiglobulin Test: Indications, Interpretation, and Pitfalls