تست کومبس رایت یک روش سرولوژیک برای تشخیص بروسلوز (تب مالت) مزمن است که آنتی‌بادی‌های ناقص را شناسایی می‌کند. روش انجام آزمایش کومبس رایت شامل مراحل کلیدی زیر است: ۱. آماده‌سازی رقت‌های سریال از سرم بیمار، ۲. انکوباسیون با آنتی‌ژن بروسلا، ۳. شستشوی کامل نمونه، ۴. افزودن آنتی‌هیومن گلوبولین (AHG) یا همان ریجنت کومبس، ۵. انکوباسیون مجدد و ۶. بررسی آگلوتیناسیون برای تعیین تیتر نهایی. این روش به شناسایی موارد مشکوک به بروسلوز که در تست رایت منفی کاذب نشان می‌دهند، کمک شایانی می‌کند.
فهرست مطالب
- خلاصه مقاله
- مقدمه
- بروسلوز چیست؟
- مراحل بیماری بروسلوز
- تست رایت (Wright Test) چیست؟
- محدودیت‌های تست رایت
- تست کومبس رایت (Coombs Wright Test) چیست؟
- کاربردهای تست کومبس رایت
- تفاوت تست کومبس رایت و تست رایت
- روش انجام تست کومبس رایت با جزئیات
- کنترل کیفی (Quality Control)
- تفسیر نتایج تست کومبس رایت
- تست‌های مکمل برای تشخیص بروسلوز
- سوالات رایج (FAQ)
- نتیجه‌گیری
خلاصه مقاله
تست‌های رایت و کومبس رایت برای تشخیص بروسلوز (تب مالت) به‌صورت مکمل تفسیر می‌شوند. در عفونت حاد، تیتر تست رایت (که عمدتاً آنتی‌بادی‌های IgM را شناسایی می‌کند) معمولاً بالا است، در حالی که تیتر کومبس رایت پایین یا منفی است. در مقابل، در عفونت مزمن یا عود بیماری، تیتر کومبس رایت (که آنتی‌بادی‌های ناقص IgG را تشخیص می‌دهد) بالا می‌رود، حتی اگر تست رایت منفی کاذب نشان دهد. به همین دلیل، منفی بودن تست رایت در کنار علائم بالینی مشکوک، نیاز به انجام تست کومبس رایت را ضروری می‌سازد تا آنتی‌بادی‌های ناقص شناسایی شده و تشخیص دقیق انجام شود. 🔬
مقدمه
بروسلوز (تب مالت) یک بیماری عفونی زئونوتیک است که توسط باکتری‌های جنس Brucella (مانند B. melitensis، B. abortus و B. suis) ایجاد می‌شود. این بیماری می‌تواند علائم سیستمیک متنوعی از جمله تب مواج، آرترالژی، میالژی، خستگی مزمن، تعریق شبانه و هپاتواسپلنومگالی ایجاد کند. تشخیص دقیق بروسلوز حیاتی است، زیرا درمان به‌موقع (معمولاً با ترکیبی از آنتی‌بیوتیک‌ها مانند داکسی‌سیکلین و ریفامپین) می‌تواند از پیشرفت به فرم مزمن و عوارض مانند اندوکاردیت یا نوروبروسلوز جلوگیری کند. آزمایش‌های سرولوژیک، از جمله تست استاندارد آگلوتیناسیون لوله‌ای (SAT یا تست رایت) و تست آنتی‌گلوبولین غیرمستقیم (تست کومبس رایت)، نقش کلیدی در تشخیص دارند. تست کومبس رایت به‌طور خاص برای شناسایی آنتی‌بادی‌های ناقص (non-agglutinating) از کلاس IgG و IgA در مراحل مزمن یا عودکننده بیماری طراحی شده است، جایی که تست رایت ممکن است منفی کاذب نشان دهد. این مقاله، با تمرکز بر کارشناسان آزمایشگاه، به بررسی جامع تست کومبس رایت، کاربردهای آن، روش انجام با جزئیات فنی، تفسیر نتایج، کنترل کیفی و تست‌های مکمل می‌پردازد. اطلاعات بر اساس استانداردهای آزمایشگاهی مانند CLSI و WHO تنظیم شده است.
بروسلوز چیست؟
بروسلوز یک عفونت باکتریایی است که عمدتاً از طریق مصرف شیر و محصولات لبنی غیرپاستوریزه، تماس پوستی یا مخاطی با ترشحات حیوانات آلوده (گاو، گوسفند، بز، خوک) یا استنشاق آئروسل‌های آلوده منتقل می‌شود. باکتری Brucella درون‌فاگوسیتی است و می‌تواند در سلول‌های میزبان زنده بماند، منجر به عفونت حاد، تحت‌حاد یا مزمن شود. در مناطق اندمیک مانند ایران، شیوع سالانه بالایی گزارش می‌شود (تا ۱۰۰ مورد در ۱۰۰۰۰۰ نفر در برخی استان‌ها). علائم بالینی اغلب غیراختصاصی هستند و می‌توانند با عفونت‌های ویروسی، سل یا مالاریا اشتباه گرفته شوند. تشخیص قطعی نیاز به ترکیبی از تاریخچه بالینی، آزمایش‌های سرولوژیک، کشت باکتریایی و روش‌های مولکولی مانند PCR دارد.
مراحل بیماری بروسلوز
- حاد (Acute): کمتر از ۳ ماه؛ علائم شامل تب مواج (undulant fever)، دردهای عضلانی-مفصلی و لنفادنوپاتی.
- تحت‌حاد (Subacute): ۳ تا ۱۲ ماه؛ علائم پایدار با دوره‌های عود.
- مزمن (Chronic): بیش از ۱۲ ماه؛ خستگی مزمن، افسردگی، آرتریت و عوارض ارگان‌محور مانند اسپوندیلیت.
در مراحل مزمن، پاسخ ایمنی به سمت IgG و IgA ناقص تغییر می‌کند که تست‌های استاندارد مانند SAT قادر به شناسایی آن‌ها نیستند.
تست رایت (Wright Test) چیست؟
تست رایت یا SAT یک روش آگلوتیناسیون لوله‌ای است که آنتی‌بادی‌های agglutinating (عمدتاً IgM و IgG کامل) علیه آنتی‌ژن‌های سطحی Brucella (مانند لیپوپلی‌ساکارید O) را تشخیص می‌دهد. این تست برای غربالگری اولیه و تشخیص عفونت حاد استفاده می‌شود. تیتر ≥۱:۱۶۰ (یا ≥۱۲۰ IU/mL) معمولاً مثبت تلقی می‌شود، اما باید با علائم بالینی و تست‌های تکمیلی مانند ۲ME (۲-مرکاپتواتانول) ترکیب شود تا IgM (عفونت اخیر) از IgG (عفونت فعال) تمایز داده شود.
محدودیت‌های تست رایت
- منفی کاذب در مراحل مزمن به دلیل غلبۀ آنتی‌بادی‌های ناقص (blocking antibodies) که آگلوتیناسیون ایجاد نمی‌کنند.
- مثبت کاذب به دلیل واکنش متقاطع با باکتری‌هایی مانند Yersinia enterocolitica، Salmonella یا Francisella tularensis.
- حساسیت پایین در عفونت‌های زیربالینی یا پس از واکسیناسیون (مانند سویه RB51).
- وابستگی به کیفیت آنتی‌ژن و تکنیک آزمایشگاهی.
تست کومبس رایت (Coombs Wright Test) چیست؟
تست کومبس رایت یک تست آنتی‌گلوبولین غیرمستقیم (Indirect Antiglobulin Test) است که برای تشخیص آنتی‌بادی‌های ناقص IgG و IgA طراحی شده است. این آنتی‌بادی‌ها در مراحل مزمن بروسلوز افزایش می‌یابند و در SAT شناسایی نمی‌شوند زیرا قادر به اتصال مستقیم به آنتی‌ژن نیستند. با افزودن آنتی‌هیومن گلوبولین (AHG یا Coombs reagent)، که علیه Fc بخش IgG انسانی عمل می‌کند، پل‌هایی بین آنتی‌بادی‌های ناقص و آنتی‌ژن ایجاد می‌شود و آگلوتیناسیون قابل مشاهده می‌گردد. این تست حساسیت بالاتری در تشخیص بروسلوز مزمن دارد (تا ۹۸% در برخی مطالعات) و زمانی درخواست می‌شود که SAT منفی باشد اما علائم بالینی مشکوک وجود داشته باشد.
کاربردهای تست کومبس رایت
- تشخیص بروسلوز مزمن، عودکننده یا زیربالینی.
- تمایز عفونت فعال از غیرفعال (در ترکیب با ۲ME یا ELISA).
- ارزیابی بیماران با علائم پایدار اما نتایج منفی SAT.
- پیگیری درمانی و تشخیص عود (تیترهای پایدار بالا نشان‌دهنده عفونت مقاوم).
- در مناطق اندمیک، برای غربالگری گروه‌های پرخطر مانند دامداران.
تفاوت تست کومبس رایت و تست رایت
| ویژگی | تست رایت (Wright Test) | تست کومبس رایت (Coombs Wright Test) |
|---|---|---|
| نوع آنتی‌بادی تشخیص‌داده‌شده | Agglutinating (IgM و IgG کامل) | Non-agglutinating (IgG و IgA ناقص) |
| کاربرد اصلی | تشخیص اولیه و حاد | تشخیص مزمن و منفی کاذب SAT |
| روش | آگلوتیناسیون مستقیم | آگلوتیناسیون با کمک AHG |
| تیتر مثبت | ≥۱:۱۶۰ (با علائم) | ≥۱:۴۰ (با علائم؛ اغلب ≥۱:۱۶۰ برای فعال) |
| محدودیت | منفی کاذب در مزمن؛ مثبت کاذب متقاطع | گران‌تر، زمان‌برتر و نیاز به AHG با کیفیت بالا |
| حساسیت در مزمن | پایین (۵۰-۷۰%) | بالا (۸۰-۹۸%) |
در عفونت حاد، تیتر SAT اغلب بالاتر از کومبس است؛ در مزمن، تیترها مشابه یا کومبس بالاتر.
روش انجام تست کومبس رایت با جزئیات
این روش نیاز به تجهیزات استاندارد آزمایشگاه سرولوژی (لوله‌های شیشه‌ای، پیپت، انکوباتور، سانتریفیوژ) دارد. تمام مراحل باید تحت شرایط آسپتیک و با رعایت ایمنی زیستی (BSL-2 برای Brucella) انجام شود.
- نمونه‌گیری و آماده‌سازی: خون وریدی (۵-۱۰ میلی‌لیتر) در لوله بدون ضد انعقاد گرفته شود. سرم را با سانتریفیوژ (۱۵۰۰g برای ۱۰ دقیقه) جدا کنید. نمونه باید بدون همولیز، لیپمی یا ایکتریک باشد؛ در غیر این صورت، تکرار نمونه‌گیری لازم است. سرم را در -۲۰°C نگهداری کنید اگر بلافاصله تست نشود. ناشتایی لازم نیست، اما از نمونه‌های پس از غذا اجتناب کنید تا لیپمی کاهش یابد.
- تهیه رقت‌های سریال: سرم بیمار را در سالین نرمال (۰.۹% NaCl، pH ۷.۲) رقیق کنید. رقت‌های دو برابر سریال از ۱:۲۰ تا ۱:۱۲۸۰ (یا بالاتر تا ۱:۵۱۲۰ در موارد تیتر بالا) تهیه کنید. حجم هر لوله: ۰.۵ میلی‌لیتر سرم رقیق + ۰.۵ میلی‌لیتر آنتی‌ژن. کنترل‌های مثبت (سرم با تیتر شناخته شده ≥۱:۱۶۰) و منفی (سرم سالم) را همزمان تهیه کنید.
- افزودن آنتی‌ژن: آنتی‌ژن استاندارد Brucella abortus (سوسپانسیون کشته شده با فرمالدئید و حرارت، غلظت استاندارد مانند Bio-Rad یا WHO، معادل ۱۰^۹ باکتری/mL) اضافه کنید. آنتی‌ژن باید تازه و در ۴°C نگهداری شود؛ قبل از استفاده، هم بزنید تا سوسپانسیون یکنواخت شود.
- انکوباسیون اولیه: لوله‌ها را در انکوباتور ۳۷°C برای ۱۸-۲۴ ساعت (معمولاً overnight) قرار دهید. از لرزاننده ملایم (۵۰-۱۰۰ rpm) برای بهبود تماس استفاده کنید اگر تجهیزات موجود باشد.
- بررسی اولیه آگلوتیناسیون: لوله‌ها را سانتریفیوژ کنید (۱۰۰۰g برای ۵ دقیقه) و جهت وجود آگلونیناسیون بررسی کنید. درجه آگلوتیناسیون را امتیازدهی کنید: ۴+ (کامل)، ۳+ (۷۵%)، ۲+ (۵۰%)، ۱+ (۲۵%)، ۰ (منفی). اگر آگلوتیناسیون مشاهده شد، تیتر را بر اساس SAT گزارش کنید.
- افزودن AHG (Coombs reagent): برای لوله‌های منفی یا ضعیف، محتویات را با سالین شستشو دهید (سانتریفیوژ و دور ریختن سوپرناتانت، تکرار ۲-۳ بار برای حذف آنتی‌بادی‌های آزاد). سپس ۰.۵ میلی‌لیتر AHG (آنتی-IgG انسانی، تیتر ≥۱:۲۵۶، بدون همولیزین) اضافه کنید.
- انکوباسیون ثانویه و خواندن نتیجه: لوله‌ها را دوباره در ۳۷°C برای ۳۰-۶۰ دقیقه انکوبه کنید، سانتریفیوژ و بررسی آگلوتیناسیون کنید. آخرین رقت با آگلوتیناسیون ≥۵۰% (۲+) تیتر گزارش می‌شود. نتایج را در فرم استاندارد آزمایشگاه ثبت کنید.
آزمایش کومبس رایت
کنترل کیفی (Quality Control)
کنترل کیفی برای اطمینان از دقت، تکرارپذیری و اعتبار نتایج ضروری است و باید طبق استانداردهای ISO 15189 یا CLSI انجام شود.
Licensed by Google
- کنترل روزانه: استفاده از کنترل مثبت (سرم استاندارد با تیتر شناخته شده، ) و کنترل منفی (سرم سالم بدون آنتی‌بادی). نتایج باید در محدوده ±۱ رقت از مقدار مورد انتظار باشد.
- کنترل آنتی‌ژن و ریجنت: قبل از هر بچ، آنتی‌ژن را با کنترل مثبت چک کنید تا آگلوتیناسیون مناسب نشان دهد. AHG را با سلول‌های sensitized (مانند Rh-positive coated) تست کنید تا فعالیت آن تایید شود.
- کالیبراسیون تجهیزات: انکوباتورها را روزانه چک کنید (دما ±۱°C)، سانتریفیوژها را ماهانه کالیبره کنید. pH سالین را با pH-metr بررسی کنید.
- کنترل داخلی و خارجی: مشارکت در برنامه‌های EQA (External Quality Assessment) مانند WHO یا NEQAS برای بروسلوز. ثبت تمام انحرافات در لاگ QC و اقدامات اصلاحی.
- حدود پذیرش: اگر کنترل خارج از محدوده باشد (مثلاً تیتر کنترل مثبت <۱:۸۰)، بچ را رد کنید و علت (مانند آلودگی یا انقضای ریجنت) را بررسی کنید.
تفسیر نتایج تست کومبس رایت
- منفی: تیتر <۱:۴۰؛ معمولاً عدم عفونت یا مرحله خیلی زودرس. در مناطق اندمیک، تکرار تست پس از ۲ هفته توصیه می‌شود.
- مثبت: تیتر ≥۱:۴۰؛ نشان‌دهنده مواجهه قبلی یا عفونت مزمن، به‌خصوص با علائم بالینی. تیتر ≥۱:۱۶۰ اغلب عفونت فعال را نشان می‌دهد.
- تیتر بالا (≥۱:۳۲۰): عفونت اخیر یا عود؛ نیاز به پیگیری با کشت یا PCR.
- ترکیب با تست‌ها: اگر ۲ME مثبت (تیتر ≥۱:۴۰ پس از درمان با ۲ME)، عفونت فعال است؛ اگر منفی، عفونت گذشته. نتایج همیشه با تاریخچه بیمار، علائم و تست‌های دیگر ترکیب شوند.
تست‌های مکمل برای تشخیص بروسلوز
- رز بنگال (Rose Bengal): تست غربالگری سریع (حساسیت >۹۵%) برای SAT مثبت.
- ۲ME: تمایز IgG فعال از IgM.
- ELISA (IgG/IgM): حساسیت بالا (۹۰-۱۰۰%) برای تشخیص کلاس‌های آنتی‌بادی؛ روش انتخابی در آزمایشگاه‌های مدرن.
- PCR: تشخیص DNA باکتری، سریع و اختصاصی (حساسیت ۸۰-۹۵% در خون).
- کشت خون/مغز استخوان: استاندارد طلایی (حساسیت ۵۰-۸۰%)، اما زمان‌بر (تا ۶ هفته) و نیاز به BSL-3.
سوالات رایج (FAQ)
- تست کومبس رایت برای چه مواردی استفاده می‌شود؟عمدتاً برای تشخیص بروسلوز مزمن وقتی SAT منفی است اما علائم وجود دارد. همچنین در پیگیری عود یا ارزیابی درمان مفید است.
- تفاوت تست کومبس رایت و تست رایت چیست؟تست رایت آنتی‌بادی‌های کامل (agglutinating) را تشخیص می‌دهد و برای مراحل حاد مناسب است، در حالی که کومبس آنتی‌بادی‌های ناقص را با کمک AHG شناسایی می‌کند و برای مراحل مزمن کاربرد دارد.
- تیتر مثبت در تست کومبس رایت چقدر است؟تیتر ≥۱:۴۰ مثبت تلقی می‌شود، اما ≥۱:۱۶۰ نشان‌دهنده عفونت فعال است. همیشه با علائم بالینی تفسیر شود.
- روش انجام تست کومبس رایت چطور است؟شامل رقیق‌سازی سریال سرم، افزودن آنتی‌ژن، انکوباسیون اولیه، شستشو، افزودن AHG و انکوباسیون ثانویه برای بررسی آگلوتیناسیون.
- محدودیت‌های تست کومبس رایت چیست؟گران‌تر و زمان‌برتر از SAT، وابستگی به کیفیت AHG، و امکان مثبت کاذب در بیماری‌های خودایمنی مانند آرتریت روماتوئید.
- کنترل کیفی در تست کومبس رایت چگونه انجام می‌شود؟با کنترل‌های مثبت/منفی روزانه، چک آنتی‌ژن/AHG، کالیبراسیون تجهیزات و برنامه‌های EQA برای اطمینان از دقت.
- تست کومبس رایت با چه تست‌هایی ترکیب می‌شود؟اغلب با ۲ME برای تمایز عفونت فعال، ELISA برای کلاس آنتی‌بادی، و PCR برای تایید مولکولی.
- در چه بیمارانی تست کومبس رایت درخواست می‌شود؟بیماران با علائم مزمن مانند خستگی پایدار، آرتریت یا تب نامشخص، به‌خصوص در مناطق اندمیک یا سابقه مواجهه با دام.
- نتایج تست کومبس رایت و تست رایت چگونه با هم تفسیر می‌شوند؟در عفونت حاد، تیتر رایت معمولاً بالاتر از کومبس است (به دلیل IgM غالب). در مزمن، تیتر کومبس بالاتر یا مشابه رایت است (به دلیل IgG ناقص). اگر رایت منفی و کومبس مثبت باشد، بروسلوز مزمن محتمل است. نتایج باید با ۲ME و علائم بالینی ترکیب شوند.
- خطاهای رایج در انجام تست کومبس رایت چیست؟شستشوی ناکافی (منجر به مثبت کاذب)، انقضای ریجنت‌ها، یا عدم کنترل دما (منجر به منفی کاذب). رعایت پروتکل دقیق ضروری است.
- چگونه می‌توان از مثبت کاذب در تست کومبس رایت جلوگیری کرد؟استفاده از AHG با کیفیت بالا، شستشوی کامل نمونه، و کنترل‌های مثبت/منفی دقیق. همچنین، بررسی تاریخچه بیمار برای رد بیماری‌های خودایمنی.
برای سوالات بیشتر، با پزشک یا آزمایشگاه تخصصی مشورت کنید.
نتیجه‌گیری
تست کومبس رایت ابزاری حیاتی برای کارشناسان آزمایشگاه در تشخیص بروسلوز مزمن است و مکمل SAT محسوب می‌شود. با جزئیات فنی ارائه‌شده، می‌توان دقت تشخیص را افزایش داد. تشخیص زودهنگام و درمان مناسب از عوارض جلوگیری می‌کند. اگر علائم مشکوک وجود دارد، به پزشک مراجعه شود و آزمایشگاه‌ها از استانداردهای QC پیروی کنند.
جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید: