اصول، روش کار، تفسیر نتایج و کنترل کیفی تست کواگولاز: راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

خلاصه تست کواگولاز

تست کواگولاز چیست؟ تست کواگولاز یک آزمایش میکروبیولوژی برای شناسایی استافیلوکوکوس اورئوس است که آنزیم کواگولاز تولید می‌کند. روش کار: در تست اسلاید، کلنی با پلاسما مخلوط شده و تجمع بررسی می‌شود؛ در تست تیوب، تشکیل لخته پس از انکوباسیون مشاهده می‌شود. این تست برای تشخیص عفونت‌های استافیلوکوکی حیاتی است.

مقدمه

تست کواگولاز (Coagulase Test) یکی از آزمایش‌های بیوشیمیایی کلیدی در میکروبیولوژی بالینی است که برای تمایز Staphylococcus aureus (استافیلوکوکوس اورئوس) از سایر گونه‌های استافیلوکوکوس، به ویژه استافیلوکوکوس‌های کواگولاز منفی (CoNS) مانند S. epidermidis و S. saprophyticus، استفاده می‌شود. این تست بر پایه تولید آنزیم کواگولاز توسط S. aureus استوار است که به عنوان یک فاکتور ویرولانس عمل می‌کند و به باکتری کمک می‌کند تا در برابر سیستم ایمنی میزبان مقاومت کند. S. aureus عامل شایع عفونت‌های پوستی، مسمومیت‌های غذایی و عفونت‌های سیستمیک است، بنابراین شناسایی سریع آن حیاتی است. این تست شامل دو روش اصلی است: تست اسلاید (برای کواگولاز متصل یا bound coagulase) و تست تیوب (برای کواگولاز آزاد یا free coagulase). در این مقاله، به طور جامع به اصول، روش کار، تفسیر نتایج و کنترل کیفی این تست پرداخته می‌شود.

اصول تست کواگولاز

کواگولاز یک پروتئین آنزیم‌مانند است که فیبرینوژن محلول در پلاسما را به فیبرین نامحلول تبدیل می‌کند و منجر به تشکیل لخته (clot) یا تجمع (clumping) می‌شود. این آنزیم به دو صورت وجود دارد:

• کواگولاز متصل (Bound Coagulase یا Clumping Factor): به دیواره سلولی باکتری متصل است و مستقیماً با فیبرینوژن واکنش می‌دهد و باعث تجمع سلول‌های باکتریایی می‌شود. این نوع توسط تست اسلاید شناسایی می‌شود و با پروتئین A در دیواره سلولی مرتبط است که به بخش FC ایمونوگلوبولین G (IgG) انسان متصل می‌شود.
• کواگولاز آزاد (Free Coagulase یا Staphylocoagulase): از سلول آزاد می‌شود و با فاکتور واکنش‌دهنده کواگولاز (CRF، یک مولکول شبیه ترومبین) در پلاسما فعال می‌شود. کمپلکس کواگولاز-CRF با فیبرینوژن واکنش داده و لخته فیبرین تشکیل می‌دهد. این نوع توسط تست تیوب شناسایی می‌شود.

استفاده از پلاسمای خرگوش (Rabbit Plasma) ترجیح داده می‌شود زیرا حساسیت بالاتری دارد و فاقد مهارکننده‌های انسانی است. پلاسما باید با EDTA مخلوط شود تا از انعقاد جلوگیری شود. تست کواگولاز گونه‌های کواگولاز مثبت مانند S. aureus، S. intermedius، S. schleiferi و S. hyicus را از گونه‌های منفی مانند S. epidermidis و S. saprophyticus تفکیک می‌کند. این تست به عنوان فاکتور ویرولانس، به باکتری کمک می‌کند تا سد محافظتی در برابر فاگوسیتوز ایجاد کند.

روش کار تست کواگولاز

تست کواگولاز معمولاً با تست اسلاید شروع می‌شود و در صورت منفی بودن، با تست تیوب تأیید می‌شود. مواد مورد نیاز شامل: پلاسمای خرگوش (تازه یا فریز شده با EDTA)، سالین فیزیولوژیک، اسلاید شیشه‌ای تمیز، لوله‌های آزمایش، حلقه تلقیح، انکوباتور در 37 درجه سانتی‌گراد، و کلنی‌های تازه (18-24 ساعته) از محیط غیرمهاری مانند آگار خونی یا نوتریانت آگار است. از کلنی‌های رشد یافته روی آگار نمک مانیتول (MSA) اجتناب شود، زیرا نمک بالا می‌تواند نتایج را مختل کند.

تست اسلاید (Slide Coagulase Test) – برای کواگولاز متصل

این روش سریع (کمتر از 10 ثانیه) است و برای غربالگری اولیه استفاده می‌شود.

1. یک قطره سالین یا آب مقطر (حدود 10 میکرولیتر) روی هر انتهای اسلاید قرار دهید (یا از دو اسلاید جداگانه استفاده کنید).
2. چند کلنی از کشت تازه را با حلقه تلقیح در قطره امولسیون کنید تا سوسپانسیون شیری‌رنگ و صاف ایجاد شود.
3. یک قطره پلاسمای رقیق‌نشده (خرگوش یا انسانی) به یکی از سوسپانسیون‌ها اضافه کنید و به آرامی مخلوط کنید.
4. بلافاصله (درون 10 ثانیه) برای تجمع (clumping) مشاهده کنید. سوسپانسیون بدون پلاسما برای تمایز تجمع واقعی از ظاهر گرانولی باکتری استفاده می‌شود.

نکته ایمنی: از پلاسمای انسانی با احتیاط استفاده کنید زیرا ممکن است عفونی باشد. اسلاید را تکان ندهید تا از تجمع کاذب جلوگیری شود.

تست تیوب (Tube Coagulase Test) – برای کواگولاز آزاد

این روش تأییدی است و تا 4-24 ساعت طول می‌کشد.

1. پلاسما را 1:5 یا 1:10 با سالین رقیق کنید (مثلاً 0.5 میلی‌لیتر پلاسما + 2.5 میلی‌لیتر سالین).
2. 0.5 میلی‌لیتر پلاسمای رقیق‌شده را در لوله آزمایش بریزید.
3. 2-4 کلنی (یا 0.1 میلی‌لیتر از براث کشت خون) را به لوله اضافه کنید و مخلوط کنید تا سوسپانسیون شیری ایجاد شود.
4. در 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 ساعت انکوبه کنید (بدون CO2).
5. هر ساعت لوله را به آرامی کج کنید و برای تشکیل لخته بررسی کنید. اگر لخته تشکیل نشد، تا 24 ساعت در دمای اتاق (25 درجه سانتی‌گراد) ادامه دهید.
6. در صورت عدم تشکیل لخته پس از 24 ساعت، 1-2 قطره CaCl2 5% اضافه کنید و دوباره بررسی کنید (برای تأیید لیز لخته توسط استافیلوکیناز).

نکته: از لوله‌های شیشه‌ای یا پلاستیکی استفاده کنید و لوله را تکان ندهید تا لخته آسیب نبیند.

اساس تست کواگولاز

تفسیر نتایج تست کواگولاز

تفسیر بر اساس مشاهده مستقیم است و باید با کنترل‌های مثبت و منفی مقایسه شود.

تفسیر تست اسلاید

• مثبت: تجمع ماکروسکوپیک (clumping) درون 10 ثانیه در قطره پلاسما، بدون تجمع در قطره سالین. نشان‌دهنده حضور کواگولاز متصل و احتمال S. aureus.
• منفی: عدم تجمع. باید با تست تیوب تأیید شود.
• نامعتبر: تجمع در هر دو قطره (auto-agglutination)؛ تست تیوب انجام دهید.

تفسیر تست تیوب

• مثبت: تشکیل هر درجه‌ای از لخته (clot) درون 4-24 ساعت؛ پلاسما سفت می‌شود و جریان ندارد. نشان‌دهنده S. aureus یا گونه‌های مشابه.
• منفی: پلاسما مایع باقی می‌ماند یا رسوب flocculent/ropy تشکیل می‌شود (نه لخته واقعی).
• تأییدی: اگر پس از 24 ساعت لخته تشکیل نشود اما پس از CaCl2 لخته ظاهر شود، مثبت تلقی می‌شود (به دلیل لیز توسط استافیلوکیناز).

نتایج مثبت در گونه‌هایی مانند S. aureus، S. intermedius و S. schleiferi دیده می‌شود، در حالی که S. epidermidis منفی است. در عفونت‌های خونی، مثبت بودن تست S. aureus را تأیید می‌کند.

کنترل کیفی تست کواگولاز

کنترل کیفی (Quality Control) برای اطمینان از صحت و دقت نتایج تست کواگولاز ضروری است و باید به صورت منظم و سیستماتیک انجام شود تا خطاهای ناشی از مواد، روش یا تفسیر به حداقل برسد. این فرآیند شامل بررسی عملکرد پلاسما، تجهیزات، روش اجرا و پرسنل است.

کنترل‌های استاندارد

• کنترل مثبت: سویه استاندارد Staphylococcus aureus (ATCC 25923) باید در هر دو تست اسلاید (تجمع قابل مشاهده) و تیوب (تشکیل لخته) نتیجه مثبت نشان دهد.
• کنترل منفی: سویه استاندارد Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) باید در هر دو تست اسلاید و تیوب نتیجه منفی (عدم تجمع یا لخته) نشان دهد.

روش اجرای کنترل کیفی تست کواگولاز

1. کنترل روزانه: قبل از انجام تست روی نمونه‌های بالینی، کنترل‌های مثبت و منفی را با هر لات پلاسما اجرا کنید. نتایج را در فرم کنترل کیفی ثبت کنید.
2. بررسی پلاسما: پلاسما باید شفاف، بدون کدورت یا رسوب باشد. قبل از استفاده، آن را در دمای اتاق (25 درجه سانتی‌گراد) قرار دهید تا به دمای مناسب برسد.
3. ذخیره‌سازی پلاسما: پلاسمای خرگوش را در -20 درجه سانتی‌گراد (تا 30 روز) یا در 4 درجه سانتی‌گراد (تا 5 روز برای بخش در حال استفاده) نگهداری کنید. از پلاسمای منقضی‌شده یا آلوده استفاده نشود.
4. کنترل لات جدید: هر لات جدید پلاسما باید با کنترل‌های مثبت و منفی آزمایش شود. تاریخ تولید، انقضا و شرایط ذخیره‌سازی را بررسی کنید.
5. کنترل تجهیزات: انکوباتور (37 درجه سانتی‌گراد) باید کالیبره باشد. دمای آن را روزانه با دماسنج تأیید کنید.
6. کنترل پرسنل: اپراتورها باید آموزش دیده باشند و روش استاندارد (SOP) را دنبال کنند. نتایج باید توسط دو تکنسین مستقل بررسی شود تا خطای انسانی کاهش یابد.

احتیاط‌های کنترل کیفی تست کواگولاز

• اجتناب از پلاسمای سیتراته: پلاسمای حاوی سیترات ممکن است توسط باکتری‌هایی مانند Enterococcus متابولیزه شود و نتایج کاذب مثبت ایجاد کند. از پلاسمای EDTA استفاده کنید.
• انتخاب کلنی مناسب: کلنی‌های تازه (18-24 ساعته) از محیط غیرمهاری مانند آگار خونی انتخاب شوند. محیط‌های حاوی نمک بالا (مانند MSA) می‌توانند نتایج را مختل کنند.
• بررسی آلودگی: پلاسما یا سالین آلوده می‌تواند نتایج کاذب ایجاد کند. قبل از استفاده، پلاسما را از نظر کدورت بررسی کنید.
• ثبت نتایج: تمام نتایج کنترل کیفی (مثبت، منفی، تاریخ، لات پلاسما، اپراتور) باید در یک سیستم ثبت و نگهداری شوند تا قابلیت ردیابی وجود داشته باشد.

رفع اشکال در کنترل کیفی تست کواگولاز

• عدم تشکیل لخته در کنترل مثبت: بررسی کنید که آیا پلاسما منقضی شده یا به درستی ذخیره نشده است. سویه کنترل را دوباره کشت دهید تا از زنده بودن آن مطمئن شوید.
• تشکیل لخته در کنترل منفی: پلاسما ممکن است آلوده باشد یا سویه کنترل به اشتباه انتخاب شده باشد. پلاسما و سویه را تعویض کنید.
• نتایج متناقض: روش اجرا (مثلاً رقیق‌سازی نادرست پلاسما یا انکوباسیون نادرست) را بررسی کنید. تست را با پلاسمای جدید و سویه‌های استاندارد تکرار کنید.

تست‌های تکمیلی برای کنترل کیفی پیشرفته تست کواگولاز

در صورت نتایج مشکوک، تست‌های تکمیلی مانند تست لاتکس برای کلامپینگ فاکتور یا PCR برای ژن coa (کواگولاز) می‌تواند برای تأیید استفاده شود. این روش‌ها به ویژه در سویه‌های غیرمعمول یا MRSA با کواگولاز ضعیف مفید هستند.

محدودیت‌ها و احتیاط‌ها در تست کواگولاز

• محدودیت‌ها: حدود 15% سویه‌های MRSA ممکن است کواگولاز متصل ضعیفی داشته باشند (false negative در اسلاید). برخی گونه‌های حیوانی مانند S. hyicus مثبت تیوب هستند. لیز لخته توسط استافیلوکیناز پس از انکوباسیون طولانی.
• احتیاط‌ها: همه نمونه‌ها را عفونی فرض کنید و از دستکش و تجهیزات ایمنی استفاده کنید. تست را روی کلنی‌های تازه (≤18 ساعت) انجام دهید. از پلاسمای انسانی با تست ویروسی استفاده کنید.

نتیجه‌گیری تست کواگولاز

تست کواگولاز ابزاری ساده، سریع و مقرون‌به‌صرفه برای شناسایی S. aureus است که نقش کلیدی در تشخیص عفونت‌های استافیلوکوکی دارد. با رعایت اصول، روش دقیق، تفسیر صحیح و کنترل کیفی جامع و منظم، دقت تشخیصی بالا تضمین می‌شود. برای موارد مشکوک، تست‌های تکمیلی مانند PCR یا تست لاتکس توصیه می‌شود. این تست همچنان پایه‌ای در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی بالینی باقی مانده است.