خلاصه روش تهیه سوسپانسیون میکروبی

روش تهیه سوسپانسیون میکروبی به این شرح است که ، کلنی‌های تازه را در بافر استریل (مانند PBS) معلق کنید، کدورت را با استاندارد McFarland تنظیم کنید، و در صورت نیاز رقیق‌سازی سریالی انجام دهید. این روش برای آزمایش‌های میکروبیولوژی مانند تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی ضروری است.

فهرست مطالب

• مقدمه
• اهمیت تهیه سوسپانسیون میکروبی
• مواد و تجهیزات مورد نیاز
• روش‌های تهیه سوسپانسیون میکروبی
  • تهیه از کلنی‌های جامد
  • تهیه از کشت مایع
  • تنظیم غلظت با استانداردهای McFarland
  • روش‌های خاص
• نکات ایمنی و آسپتیک
• کاربردها
• نتیجه‌گیری
• سوالات رایج

مقدمه

سوسپانسیون میکروبی به مخلوطی گفته می‌شود که در آن میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها، قارچ‌ها یا مخمرها در یک مایع (معمولاً بافر استریل مانند PBS یا سالین) معلق هستند. این سوسپانسیون‌ها در میکروبیولوژی برای اهداف مختلفی مانند تست‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی، شمارش کلنی‌ها، آزمایش‌های بیوشیمیایی و کشت‌های سلولی استفاده می‌شوند. تهیه صحیح سوسپانسیون تضمین‌کننده نتایج دقیق و تکرارپذیر است و باید با رعایت اصول آسپتیک انجام شود تا از آلودگی جلوگیری گردد. این روش‌ها بر اساس استانداردهایی مانند McFarland توسعه یافته‌اند که غلظت میکروبی را استاندارد می‌کنند.

اهمیت روش تهیه سوسپانسیون میکروبی

در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، سوسپانسیون‌های میکروبی پایه بسیاری از آزمایش‌ها هستند. برای مثال، در تست‌های آنتی‌بیوتیکی، غلظت دقیق باکتری‌ها (مانند ۱۰^۸ CFU/mL) ضروری است تا نتایج معتبر باشند. همچنین، در کشت‌های سوسپانسیونی، این روش اجازه رشد یکنواخت میکروارگانیسم‌هایی مانند E. coli را می‌دهد. عدم دقت در تهیه سوسپانسیون باکتریایی می‌تواند منجر به خطاهای تجربی شود، مانند شمارش نادرست کلنی‌ها یا نتایج نادرست در ارزیابی خواص ضدمیکروبی.

مواد و تجهیزات مورد نیاز برای تهیه سوسپانسیون میکروبی

برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، مواد و تجهیزات زیر ضروری هستند:

• محیط کشت: مانند Nutrient Broth، Luria-Bertani (LB) broth یا Soybean Casein Digest Broth (SCDB) برای باکتری‌ها، و Sabouraud Dextrose Broth برای قارچ‌ها.
• بافر استریل: Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X یا سالین ۰.۹% استریل.
• کلنی‌های میکروبی: از صفحات آگار تازه (مانند LB agar یا Soybean Casein Digest Agar).
• تجهیزات: سانتریفیوژ، شیکر انکوباتور، اسپکتروفتومتر یا دنسی‌چک برای اندازه‌گیری کدورت، لوله‌های استریل، پیپت‌های استریل، و لوپ استریل.
• استانداردهای کدورت: مانند استانداردهای McFarland برای تنظیم غلظت.
• آنتی‌بیوتیک‌ها: در صورت نیاز برای کشت‌های انتخابی.

تمام مواد باید استریل باشند و عملیات در کابین لامینار فلو انجام شود.

روش‌های تهیه سوسپانسیون میکروبی

روش‌های تهیه سوسپانسیون باکتریایی بسته به منبع میکروارگانیسم (کلنی جامد یا کشت مایع) متفاوت هستند. در ادامه، مراحل کلی و جزئی آورده شده است.

۱. روش تهیه سوسپانسیون میکروبی از کلنی‌های جامد (استاندارد برای باکتری‌ها مانند S. aureus یا E. coli)

• گام ۱: انتخاب کلنی: یک کلنی تک از صفحه آگار تازه (کمتر از ۲۴ ساعت) را با لوپ استریل بردارید. از کلنی‌های تازه استفاده کنید تا از زنده بودن سلول‌ها اطمینان حاصل شود.
• گام ۲: تلقیح در محیط کشت مایع: کلنی را در ۳-۵ میلی‌لیتر محیط کشت مانند LB broth یا Nutrient Broth تلقیح کنید. آنتی‌بیوتیک مناسب اضافه کنید اگر لازم باشد.
• گام ۳: انکوباسیون: لوله را در دمای مناسب (معمولاً ۳۷°C برای باکتری‌ها) به مدت ۸-۱۶ ساعت در شیکر با سرعت ۲۵۰-۳۰۰ rpm انکوبه کنید تا کشت اولیه (starter culture) آماده شود.
• گام ۴: سانتریفیوژ: کشت را سانتریفیوژ کنید (مثلاً ۵۲۵۰ × g در ۳۷°C برای ۵ دقیقه) تا سلول‌ها جدا شوند.
• گام ۵: بازتعلیق: سلول‌ها را در بافر استریل (مانند PBS) بازتعلیق کنید. کدورت را با اسپکتروفتومتر در OD۶۰۰ اندازه‌گیری کنید (مثلاً تنظیم به ۰.۰۷۹ OD۶۰۰ برای غلظت تقریبی ۱۰^۶ CFU/mL).
• گام ۶: رقیق‌سازی سریال: در صورت نیاز، رقیق‌سازی ۱:۱۰ انجام دهید تا به غلظت مورد نظر (مانند ۱۰-۱۰۰ CFU/mL) برسید. هر مرحله را خوب مخلوط کنید.

۲. روش تهیه سوسپانسیون میکروبی از کشت مایع (کشت سوسپانسیونی برای E. coli)

• گام ۱: آماده‌سازی محیط: پودر LB را در آب حل کنید، اتوکلاو کنید و به دمای اتاق برسانید.
• گام ۲: تلقیح: حدود ۱ میلی‌لیتر از کشت شبانه E. coli را به فلاسک استریل منتقل کنید. فلاسک را با پنبه استریل ببندید (نه محکم).
• گام ۳: انکوباسیون: در ۳۷°C با شیکینگ مداوم شبانه انکوبه کنید.
• گام ۴: برداشت و رقیق‌سازی: کشت را سانتریفیوژ کنید، سلول‌ها را در PBS بازتعلیق کنید و به غلظت‌های خاص (مانند ۲ × ۱۰^۷ CFU/mL) رقیق کنید.
• گام ۵: بررسی CFU: ۱ میلی‌لیتر از سوسپانسیون را روی صفحه آگار بریزید (روش pour plate)، انکوبه کنید و کلنی‌ها را شمارش کنید تا غلظت تأیید شود.

۳. تنظیم غلظت سوسپانسیون میکروبی با استانداردهای McFarland

• تهیه استاندارد: ۱% BaCl۲ و ۱% H۲SO۴ را مخلوط کنید تا کدورت‌های مختلف (۰.۵ تا ۴.۰) ایجاد شود. مثلاً برای ۰.۵ McFarland: ۰.۰۵ میلی‌لیتر BaCl۲ + ۹.۹۵ میلی‌لیتر H۲SO۴ (غلظت تقریبی ۱.۵ × ۱۰^۸ سلول).
• تنظیم سوسپانسیون: کدورت سوسپانسیون را با استاندارد مقایسه کنید (در نور مناسب و مقابل خطوط سیاه و سفید). اگر خیلی غلیظ باشد، با سالین رقیق کنید؛ اگر رقیق، سلول‌های بیشتری اضافه کنید یا بیشتر انکوبه کنید.
• نکته: استاندارد را در دمای اتاق نگه دارید و قبل از استفاده تکان دهید.

۴. روش‌های خاص تهیه سوسپانسیون میکروبی (برای قارچ‌ها یا کاربردهای ویژه)

• برای قارچ‌ها: کشت را در SCDB در ۲۲.۵ ± ۲.۵°C برای ۲۴-۷۲ ساعت انکوبه کنید، سپس رقیق‌سازی سریال انجام دهید.
• برای تست‌های محیطی یا MLT: از رقیق‌سازی ۱۰-۱۰۰ CFU/mL استفاده کنید و در یخچال تا یک هفته نگهداری کنید.

نکات ایمنی و آسپتیک در تهیه سوسپانسیون میکروبی

• همیشه در کابین لامینار فلو کار کنید تا از آلودگی جلوگیری شود.
• از دستکش، ماسک و لباس آزمایشگاهی استفاده کنید.
• کشت‌های قدیمی (>۲۴ ساعت) ممکن است غلظت نادرستی داشته باشند.
• از نور مستقیم برای استانداردهای McFarland اجتناب کنید، زیرا کدورت را تحت تأثیر قرار می‌دهد.
• پس از استفاده، سوسپانسیون‌ها را طبق SOP دفع کنید.

کاربردهای سوسپانسیون میکروبی

• تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی (AST).
• شمارش کلنی‌ها با روش spread plate یا pour plate.
• آزمایش‌های ضدمیکروبی و بیوفیلم.
• کشت‌های صنعتی و تحقیقاتی برای تولید پروتئین.

نتیجه‌گیری

تهیه سوسپانسیون میکروبی یک فرآیند کلیدی در میکروبیولوژی است که نیاز به دقت و رعایت استانداردها دارد. با پیروی از روش‌های فوق، می‌توانید سوسپانسیون‌های استاندارد و قابل اعتماد تهیه کنید. برای جزئیات بیشتر، به منابع تخصصی مراجعه کنید.

سوالات رایج درباره روش تهیه سوسپانسیون میکروبی