آزمایش آنتی ترومبین III: راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

آزمایش آنتی ترومبین III: راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

آزمایش آنتی ترومبین (AT III) یک تست کلیدی برای ارزیابی سطح فعالیت پروتئین ضد انعقادی در پلاسما است که کمبود آن ریسک ترومبوز را افزایش می‌دهد. این راهنما جامع، اصول آزمایش کروموژنیک آنتی ترومبین، روش انجام تست آنتی ترومبین III، کنترل کیفی و تفسیر نتایج آزمایش آنتی ترومبین را برای کارشناسان آزمایشگاه پوشش می‌دهد. با تمرکز بر جنبه‌های عملی، این مقاله به تشخیص دقیق کمبودهای ارثی یا اکتسابی آنتی ترومبین کمک می‌کند.

جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:

https://t.me/hematology_education

🚀عضویت در کانال تلگرام

فهرست مطالب

مقدمه

آنتی ترومبین III (AT III) یک گلیکوپروتئین پلاسمایی با وزن مولکولی تقریبی ۵۸۰۰۰ دالتون است که در کبد سنتز می‌شود و نقش حیاتی در تنظیم فرآیند انعقاد خون ایفا می‌کند. این پروتئین به عنوان یک مهارکننده طبیعی سرین پروتئاز عمل کرده و فاکتورهای انعقادی مانند ترومبین (فاکتور IIa)، فاکتور Xa و به میزان کمتری فاکتورهای IXa، XIa و XIIa را غیرفعال می‌سازد. فعالیت AT III به طور قابل توجهی توسط هپارین افزایش می‌یابد و وجود AT III برای عملکرد درمانی هپارین ضروری است. آزمایش AT III یک ابزار کلیدی برای ارزیابی سطح فعالیت این پروتئین در پلاسما است و به عنوان یک آزمایش اولیه برای تشخیص کمبودهای مادرزادی یا اکتسابی در بیماران مشکوک به اختلالات ترومبوتیک استفاده می‌شود. این راهنما بر اساس منابع معتبر انگلیسی و دستورالعمل‌های آزمایشگاهی تدوین شده و تمرکز ویژه‌ای بر جنبه‌های عملی دارد تا کارشناسان آزمایشگاه بتوانند آزمایش را با دقت و ایمنی بالا انجام دهند.

اهمیت بالینی آزمایش AT III

کمبود AT III با افزایش ریسک وقایع ترومبوآمبولیک همراه است و می‌تواند ارثی یا اکتسابی باشد. کمبود ارثی معمولاً ژنتیکی است و اغلب در سنین جوانی با ترومبوز وریدی یا شریانی ظاهر می‌شود، در حالی که کمبود اکتسابی می‌تواند ناشی از بیماری‌های شدید کبدی، انعقاد داخل عروقی منتشر (DIC)، سپسیس، سندرم نفروتیک، درمان با آسپارژیناز یا برخی بدخیمی‌ها باشد. از نظر بالینی، این کمبود منجر به افزایش خطر تشکیل لخته‌های غیرطبیعی می‌شود که می‌تواند به آمبولی ریوی، ترومبوز ورید عمقی یا حتی سکته منجر گردد. آزمایش AT III برای ارزیابی بیماران با سابقه شخصی یا خانوادگی ترومبوز، پایش درمان‌های ضد انعقادی مانند هپارین، و تشخیص اختلالات هیپرکواگولاسیون ضروری است. کارشناسان آزمایشگاه باید بدانند که این آزمایش بخشی از ارزیابی جامع سیستم انعقادی است و نتایج آن باید با وضعیت بالینی بیمار تفسیر شود.

اصول آزمایش کروموژنیک AT III

آزمایش AT III معمولاً با روش کروموژنیک (Chromogenic Assay) انجام می‌شود که بر اساس مهار ترومبین یا فاکتور Xa توسط AT III در حضور هپارین استوار است. در این روش، پلاسمای بیمار با مقدار مشخصی ترومبین (در حضور هپارین) انکوبه می‌شود. AT III موجود در پلاسما، بخشی از ترومبین را خنثی می‌کند. سپس، ترومبین باقی‌مانده با یک سوبسترای کروموژنیک واکنش داده و ماده رنگی تولید می‌کند که جذب نوری آن در طول موج ۴۰۵ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. میزان رنگ تولید شده رابطه عکس با غلظت AT III دارد. این روش تحت تأثیر دوزهای درمانی هپارین قرار نمی‌گیرد و برای بیماران تحت درمان با هپارین مناسب است. کارشناسان باید توجه کنند که آزمایش‌های فعالیت (Functional) بر اساس مهار ترومبین یا فاکتور Xa انجام می‌شود و برای تشخیص اولیه کمبود توصیه می‌گردد، در حالی که آزمایش آنتی‌ژن (Antigen) برای تعیین نوع کمبود (نوع I: کمبود کمی، نوع II: کمبود کیفی) استفاده می‌شود.

 

آزمایش آنتی ترومبین

آزمایش آنتی ترومبین

محتویات کیت و آماده‌سازی معرف‌ها

کیت‌های تجاری مانند Heamostica AT III شامل موارد زیر است:

  • ۶ عدد معرف شماره ۱: حاوی ۵ میلی‌لیتر ترومبین به صورت لیوفیلیزه.
  • ۶ عدد معرف شماره ۲: سوبسترای کروموژنیک ترومبین.
  • ۶ عدد معرف شماره ۳: حاوی ۵ میلی‌لیتر حلال ترومبین به صورت مایع.

برای آماده‌سازی:

  • محلول شماره ۳ را به خوبی تکان دهید و به معرف شماره ۱ اضافه کنید. سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق قرار دهید و به آرامی هم بزنید تا یکنواخت شود.
  • به معرف شماره ۲، ۳ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق نگه دارید، سپس هم بزنید.

معرف‌ها در دمای ۲-۸ درجه سانتی‌گراد پایدار هستند و پس از بازسازی، تا ۱۲ روز در همین دما قابل استفاده‌اند. پس از خروج از یخچال، ۳۰ دقیقه در دمای اتاق نگه دارید. لوازم مورد نیاز خارج از کیت شامل بافر Owren-Koller، دستگاه کواگولومتر، کالیبراتور و کنترل‌های نرمال و پاتولوژیک است.

احتیاط‌ها و ایمنی

  • تمام بروشور را قبل از انجام بخوانید. کیت فقط برای استفاده in vitro است و پس از تاریخ انقضا استفاده نشود.
  • در آزمایشگاه از خوردن، آشامیدن و سیگار کشیدن خودداری کنید.
  • کیت در دمای ۲-۸ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود و فقط توسط پرسنل آموزش‌دیده استفاده گردد.
  • با نمونه‌های بیمار و معرف‌ها با احتیاط برخورد کنید؛ معرف‌ها حاوی سدیم آزاید هستند و غیرقابل خوردن.
  • دفع پسماند طبق مقررات محلی انجام شود. در صورت شکستگی ویال، کیت را استفاده نکنید.

شرایط جمع‌آوری و پایداری نمونه

  • خون در لوله‌های حاوی سیترات سدیم ۳.۲% (نسبت خون به ضد انعقاد ۹:۱) جمع‌آوری شود. از EDTA، هپارین یا اگزالات اجتناب کنید. روش ترجیحی خون‌گیری، ونوپانکچر با پر کردن کامل لوله است تا نسبت دقیق حفظ شود.
  • پلاسما باید فقیر از پلاکت (PPP) باشد: سانتریفیوژ ۱۵ دقیقه در ۲۰۰۰-۲۵۰۰ g، با تعداد پلاکت کمتر از ۱۰۰۰۰. این مرحله برای جلوگیری از تداخل پلاکت‌ها ضروری است.
  • پایداری: ۴ ساعت در دمای اتاق، ۲۴ ساعت در ۲-۸ درجه سانتی‌گراد، و ۲ هفته در -۲۰ درجه سانتی‌گراد. کارشناسان باید نمونه را بلافاصله پس از سانتریفیوژ جدا کنند تا از فعال‌سازی عوامل انعقادی جلوگیری شود.

کارشناسان باید اطمینان حاصل کنند که لوله‌ها کامل پر شوند تا نسبت正確 حفظ شود.

روش انجام آزمایش

این آزمایش با دستگاه کواگولومتر انجام می‌شود. کارشناسان باید از آشنایی کامل با دستگاه اطمینان حاصل کنند و به دستورالعمل استاندارد عملیاتی (SOP) دستگاه مراجعه نمایند. روش گام به گام به شرح زیر است:

۱. کالیبراسیون: ابتدا منحنی استاندارد را با استفاده از پلاسمای کالیبراتور یا استاندارد تهیه کنید. رقت‌های زیر را با بافر Owren-Koller آماده نمایید:

غلظت حجم کالیبراتور (µL) حجم بافر (µL)
۰% ۰ ۲۰۰
۲۵% ۵۰ ۱۵۰
۵۰% ۱۰۰ ۱۰۰
۱۰۰% ۲۰۰ ۰

هر رقت را با ترومبین (در حضور هپارین) انکوبه کنید (معمولاً ۱-۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی‌گراد). سپس سوبسترا اضافه شود و جذب نوری (OD) در ۴۰۵ نانومتر در نقاط زمانی ۱۵ ثانیه، ۶۰ ثانیه و ۱۲۰ ثانیه اندازه‌گیری گردد. منحنی استاندارد را بر اساس ΔOD (تفاوت جذب بین نقاط زمانی) در مقابل غلظت رسم کنید. منحنی باید خطی باشد؛ در غیر این صورت، کالیبراسیون را تکرار کنید.

۲. آماده‌سازی نمونه بیمار: پلاسمای PPP بیمار را در رقت مناسب (معمولاً ۱:۱۰ یا بر اساس دستور کیت) با بافر رقیق کنید تا در محدوده منحنی قرار گیرد.

۳. انجام تست:

  • ۲۰۰ µL پلاسمای رقیق‌شده را با ۲۰۰ µL معرف ترومبین (حاوی هپارین) میکس کنید و به مدت ۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه نمایید.
  • سپس ۲۰۰ µL سوبسترای کروموژنیک اضافه کنید.
  • جذب نوری را در ۴۰۵ نانومتر به طور مداوم یا در نقاط زمانی مشخص (۱۵ ثانیه، ۶۰ ثانیه، ۱۲۰ ثانیه) اندازه‌گیری کنید. ΔOD را محاسبه نمایید.
  • اگر نتیجه خارج از محدوده خطی منحنی باشد، دستگاه به طور خودکار رقت جدید (مانند ۱:۲۰) اعمال کرده و تست را تکرار می‌کند.

۴. محاسبه: غلظت AT III بیمار را با وارد کردن ΔOD در معادله منحنی استاندارد تعیین کنید. نتیجه به صورت درصد فعالیت نسبت به پلاسمای نرمال گزارش شود. فرمول کلی: AT III (%) = (ΔOD نمونه / ΔOD استاندارد ۱۰۰%) × ۱۰۰. کارشناسان باید نرم‌افزار دستگاه را برای محاسبات خودکار استفاده کنند، اما صحت را دستی بررسی نمایند.

این روش معمولاً ۱۰-۱۵ دقیقه زمان می‌برد و باید در شرایط کنترل‌شده دما انجام شود تا از دقت اطمینان حاصل گردد.

کنترل کیفی

کنترل کیفی (QC) برای اطمینان از عملکرد صحیح کیت، دستگاه و فرآیند ضروری است. در هر ران کاری (run)، از کنترل‌های تجاری نرمال (سطح نزدیک به ۱۰۰%) و پاتولوژیک (سطح پایین، نزدیک به ۵۰%) استفاده کنید. نتایج کنترل‌ها باید در محدوده مورد انتظار (معمولاً ±۲ SD از میانگین) قرار گیرند.

  • تکرارپذیری درون‌آزمایشی (Intra-assay): ۲۰-۸۰ تکرار از یک نمونه را انجام دهید و ضریب تغییرات (CV) را محاسبه کنید. CV باید کمتر از ۵% برای سطوح نرمال و کمتر از ۱۰% برای سطوح پایین باشد.
  • تکرارپذیری بین‌آزمایشی (Inter-assay): نمونه‌ها را در ران‌های مختلف (حداقل ۱۰ ران) تست کنید و CV را بررسی نمایید (کمتر از ۱۰%).
  • اقدامات اصلاحی: اگر نتایج خارج از محدوده باشد، بررسی کنید: پایداری معرف‌ها، کالیبراسیون دستگاه، دما، و آلودگی نمونه. تست را تکرار کنید و در صورت ادامه مشکل، از کیت جدید استفاده نمایید. هر آزمایشگاه باید طرح QC خود را بر اساس استانداردهای CLSI تدوین کند و نمودارهای Levey-Jennings برای پایش استفاده شود. همچنین، مقایسه با کیت‌های مرجع (مانند Stago) برای همبستگی (R² > ۰.۹۹) توصیه می‌شود.

تفسیر نتایج و مقادیر مورد انتظار

نتایج به صورت درصد فعالیت گزارش می‌شود. محدوده مرجع معمولاً ۸۰-۱۳۰% است، اما هر آزمایشگاه باید محدوده خود را بر اساس جمعیت محلی و روش مورد استفاده تعیین کند (حداقل ۱۲۰ فرد سالم).

  • نتایج نرمال: ۸۰-۱۳۰%. نشان‌دهنده عملکرد طبیعی سیستم ضد انعقادی است.
  • سطوح پایین (<۸۰%): نشان‌دهنده کمبود AT III. باید با آزمایش آنتی‌ژن تکمیل شود تا نوع کمبود مشخص گردد:
    • نوع I (کمبود کمی): فعالیت و آنتی‌ژن هر دو پایین (معمولاً ارثی، ریسک بالا برای ترومبوز).
    • نوع II (کمبود کیفی): فعالیت پایین اما آنتی‌ژن نرمال (نقص در سایت‌های فعال، مانند نقص هپارین‌بایندینگ).
    • کمبود اکتسابی: اغلب گذرا، مرتبط با DIC (فعالیت <۵۰%)، نارسایی کبدی یا درمان هپارین (کاهش موقت).
  • سطوح بالا (>۱۳۰%): نادر، ممکن است با التهاب حاد یا عفونت همراه باشد، اما معمولاً اهمیت بالینی ندارد مگر در زمینه‌های خاص مانند بارداری.

عوامل مؤثر بر تفسیر: سن (کاهش در نوزادان)، بارداری (کاهش ۱۰-۲۰%)، درمان وارفارین (افزایش کاذب)، یا ترومبوز حاد (مصرف AT III و کاهش سطح). نتایج باید توسط پزشک با توجه به سابقه بالینی، آزمایش‌های دیگر (مانند پروتئین C/S) و تکرار تست پس از ۶ هفته تفسیر شود. در موارد مشکوک به ارثی، تست خانوادگی توصیه می‌گردد.

محدودیت‌ها و تداخلات

  • بیلی‌روبین تا ۲۱ mg/dL، هموگلوبین تا ۲۱۰ mg/dL، کلسترول تا ۳۵۰ mg/dL و تری‌گلیسرید تا ۴۱۰ mg/dL تداخل ندارند.
  • هپارین درمانی می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد، هرچند روش کروموژنیک مقاوم است. آزمایش نباید در حین ترومبوز حاد یا درمان با وارفارین انجام شود.
  • محدودیت‌های دیگر: نمونه همولیز شده یا لیپمیک شدید می‌تواند جذب نوری را مختل کند؛ در این موارد، نمونه جدید بگیرید.

نتیجه‌گیری

این راهنما ابزار جامعی برای کارشناسان آزمایشگاه فراهم می‌کند تا آزمایش AT III را با دقت بالا انجام دهند. با رعایت دستورالعمل‌ها، می‌توان از تشخیص دقیق کمبود AT III و پیشگیری از عوارض ترومبوتیک اطمینان حاصل کرد. برای به‌روزرسانی، به منابع معتبر انگلیسی و استانداردهای CLSI مراجعه شود.

سوالات رایج در مورد آزمایش آنتی ترومبین

۱. آزمایش آنتی ترومبین III چیست؟

آزمایش آنتی ترومبین III یک تست خونی است که سطح فعالیت یا مقدار پروتئین AT III را در خون اندازه‌گیری می‌کند، که نقش کلیدی در جلوگیری از تشکیل لخته‌های غیرطبیعی دارد.

۲. چرا آزمایش آنتی ترومبین III انجام می‌شود؟

این آزمایش برای تشخیص کمبود AT III در بیماران با سابقه ترومبوز، ارزیابی ریسک اختلالات انعقادی و پایش درمان‌های ضد انعقادی مانند هپارین استفاده می‌شود.

۳. سطوح طبیعی آنتی ترومبین III چقدر است؟

سطوح طبیعی معمولاً بین ۸۰ تا ۱۳۰ درصد فعالیت است، اما این محدوده می‌تواند بر اساس روش آزمایشگاه و جمعیت محلی متفاوت باشد.

۴. کمبود آنتی ترومبین III چه عللی دارد؟

کمبود می‌تواند ارثی (ژنتیکی) یا اکتسابی باشد، ناشی از بیماری‌های کبدی، DIC، سپسیس، سندرم نفروتیک یا درمان با برخی داروها مانند آسپارژیناز.

۵. چگونه برای آزمایش آنتی ترومبین III آماده شوم؟

معمولاً نیازی به آماده‌سازی خاص نیست، اما از مصرف داروهای ضد انعقادی مانند هپارین یا وارفارین قبل از تست اجتناب کنید مگر اینکه پزشک دستور دهد.

۶. خطرات آزمایش آنتی ترومبین III چیست؟

خطرات شامل کبودی، عفونت یا خونریزی جزئی در محل خون‌گیری است، اما این تست خونی ساده عموماً ایمن است.

۷. نتایج پایین آزمایش آنتی ترومبین III چه معنایی دارد؟

سطوح پایین (<۸۰%) نشان‌دهنده کمبود AT III است که ریسک ترومبوز را افزایش می‌دهد و ممکن است نیاز به درمان ضد انعقادی داشته باشد.

۸. نتایج بالا آزمایش آنتی ترومبین III چه معنایی دارد؟

سطوح بالا (>۱۳۰%) نادر است و معمولاً با التهاب یا عفونت همراه بوده و اهمیت بالینی کمتری دارد.

۹. آیا داروها بر نتایج آزمایش آنتی ترومبین III تأثیر می‌گذارند؟

بله، داروهایی مانند هپارین، وارفارین یا آسپارژیناز می‌توانند سطوح را تغییر دهند، بنابراین پزشک را از مصرف داروها مطلع کنید.

۱۰. تفاوت آزمایش فعالیت و آنتی‌ژن آنتی ترومبین III چیست؟

آزمایش فعالیت عملکرد مهاری AT III را اندازه‌گیری می‌کند، در حالی که آزمایش آنتی‌ژن مقدار پروتئین را ارزیابی می‌کند و برای تمایز انواع کمبود استفاده می‌شود.

دیدگاهتان را بنویسید