دستورالعمل استاندارد انجام آزمایش Du (تست ضعیف D)

خلاصه روش انجام آزمایش Du

آزمایش Du (تست ضعیف D) برای شناسایی آنتی‌ژن D ضعیف روی گلبول‌های قرمز انجام می‌شود. روش انجام آزمایش Du به این شرح است که سوسپانسیون گلبول های قرمزبا آنتی‌D انکوبه شده، شستشو داده می‌شوند و در نهایت AHG اضافه می شود و آگلوتیناسیون بررسی می‌شود.

جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education

🚀عضویت در کانال تلگرام

فهرست مطالب

هدف آزمایش Du

هدف این SOP تشریح روش استاندارد برای انجام آزمایش Du به منظور شناسایی آنتی‌ژن D ضعیف یا جزئی روی گلبول‌های قرمز است که در آزمایش مستقیم آگلوتیناسیون با آنتی‌D قابل شناسایی نیست. این آزمایش در بانک خون و آزمایش‌های پیش از زایمان برای تعیین دقیق گروه خونی و جلوگیری از عوارض انتقال خون یا ناسازگاری خونی مادر و جنین حیاتی است.

دامنه کاربرد تست ضعیف D

این دستورالعمل برای تمامی پرسنل آموزش‌دیده آزمایشگاه که در زمینه تکنیک‌های سرولوژیکی مهارت دارند و آزمایش Du را در آزمایشگاه‌های بالینی یا بانک خون انجام می‌دهند، قابل استفاده است.

اصل تست Du

آزمایش Du (تست ضعیف D) برای شناسایی گلبول‌های قرمز با بیان ضعیف یا جزئی آنتی‌ژن D طراحی شده است. در این آزمایش، گلبول‌های قرمز با سرم آنتی‌D در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شوند. پس از انکوباسیون، گلبول‌ها شستشو داده می‌شوند تا آنتی‌بادی‌های غیرمتصل (IgG ضد D) حذف شوند. سپس، معرف آنتی‌هومن گلبولین (AHG یا معرف کومبز) حاوی آنتی-IgG اضافه می‌شود تا آنتی‌بادی‌های متصل به آنتی‌ژن D ضعیف را شناسایی کند. در صورت وجود آنتی‌ژن D ضعیف، آگلوتیناسیون مشاهده خواهد شد. برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب ناشی از اتوآنتی‌بادی‌ها یا پروتئین‌های غیرطبیعی سرم، از کنترل آلبومین گاوی 22% استفاده می‌شود.

تجهیزات و مواد مورد نیاز برای آزمایش Du

برای انجام آزمایش Du، تجهیزات و مواد زیر مورد نیاز است:

• نمونه آزمایش: خون کامل یا گلبول‌های قرمز جدا شده (ترجیحاً تازه و در لوله حاوی ضد انعقاد EDTA).
• لوله‌های آزمایش: لوله‌های شیشه‌ای یا پلاستیکی به ابعاد 10 × 75 میلی‌متر.
• جا لوله‌ای: برای نگهداری لوله‌ها.
• پیپت پاستور یا میکروپیپت: برای انتقال دقیق مقادیر کم نمونه و معرف‌ها.
• مارکر: برای برچسب‌زنی لوله‌ها.
• ظرف دفع زباله: برای دفع ایمن مواد زائد.
• کاغذ بافتی (Tissue Paper): برای تمیز کردن سطوح و تجهیزات.
• انکوباتور یا حمام آب: تنظیم‌شده در دمای 37 درجه سانتی‌گراد.
• سانتریفیوژ: با قابلیت تنظیم سرعت تا 1500 دور در دقیقه (RPM).
• سوسپانسیون سلولی 5% گلبول‌های قرمز: طبق روش شرح داده شده در بخش روش اجرا.
• نرمال سالین (محلول نمکی 0.9%): برای شستشوی گلبول‌های قرمز.
• جعبه مشاهده (View Box) یا میکروسکوپ: برای بررسی آگلوتیناسیون.
• لام‌های شیشه‌ای تمیز و بدون چربی: برای بررسی میکروسکوپی در صورت نیاز.
• سرم آنتی‌D: برای شناسایی آنتی‌ژن D.
• معرف آنتی‌هومن گلبولین (کومبز): حاوی آنتی-IgG.
• آلبومین گاوی 22%: به عنوان کنترل برای تشخیص نتایج مثبت کاذب.

روش انجام آزمایش Du

روش انجام آزمایش Du

برای انجام آزمایش Du، مراحل زیر را به ترتیب و با دقت دنبال کنید:

آماده‌سازی سوسپانسیون سلولی 5% گلبول‌های قرمز

جهت مطالعه جامع در مورد روش تهیه ی سوسپانسیون گلبول های قرمز به لینک زیر مراحعه کنید:

راهنمای کامل و مرحله به مرحله طرز تهیه سوسپانسیون گلبول های قرمز برای آزمایش کومبس

آماده‌سازی لوله‌های آزمایش

1. لوله تست (T):
   • یک لوله را با علامت “T” برچسب بزنید.
   • یک قطره سرم آنتی‌D به لوله اضافه کنید.
2. لوله کنترل (C):
   • یک لوله دیگر را با علامت “C” برچسب بزنید.
   • یک قطره آلبومین گاوی 22% به لوله اضافه کنید.

افزودن سوسپانسیون سلولی

• با استفاده از پیپت پاستور یا میکروپیپت، یک قطره از سوسپانسیون 5% گلبول‌های قرمز را به هر یک از لوله‌های T و C اضافه کنید.
• محتویات هر لوله را به آرامی مخلوط کنید.

انکوباسیون

• هر دو لوله (T و C) را به مدت حداقل 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور یا حمام آب قرار دهید.

شستشوی گلبول‌های قرمز

1. پس از انکوباسیون، هر لوله را با نرمال سالین تازه پر کنید.
2. لوله‌ها را به مدت 1 دقیقه با سرعت 1500 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
3. سوپرناتانت را به طور کامل دور بریزید.
4. این مرحله شستشو را سه بار تکرار کنید تا آنتی‌بادی‌های غیرمتصل به طور کامل حذف شوند.

افزودن معرف کومبز

• پس از آخرین شستشو، سوپرناتانت را به طور کامل دور بریزید.
• به هر لوله (T و C)، دو قطره معرف آنتی‌هومن گلبولین (کومبز) اضافه کنید.

سانتریفیوژ و بررسی نتایج

1. محتویات لوله‌ها را به آرامی مخلوط کنید.
2. لوله‌ها را به مدت 1 دقیقه با سرعت 1500 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
3. گلبول‌های قرمز را با تکان دادن آرام لوله‌ها معلق کنید.
4. به صورت ماکروسکوپی (با چشم غیرمسلح) برای آگلوتیناسیون بررسی کنید.
5. در صورت وجود ابهام در نتایج ماکروسکوپی، با استفاده از میکروسکوپ و لام شیشه‌ای بررسی میکروسکوپی انجام دهید.
6. در نهایت جهت اطمینان از صحت عملکرد AHG ، آن را با چک سل ( سلول های حساس شده) آزمایش می کنیم: اگر پس از افزودن گلبول قرمز حساس شده، همچنان واکنش منفی مشاهده شود، این نشان‌دهنده خطاهایی مانند اضافه نشدن AHG، شستشوی نامناسب یا کاهش توان معرف AHG است و آزمایش باید تکرار شود.

تفسیر نتایج آزمایش Du

نتایج آزمایش Du به صورت زیر تفسیر می‌شوند:

کلیدها:

• O/-: عدم وجود آگلوتیناسیون.
• +: وجود آگلوتیناسیون.

نکات کلیدی در آزمایش Du

1. کنترل آلبومین گاوی: اگر در لوله کنترل (C) آگلوتیناسیون مشاهده شود، نتیجه آزمایش نامعتبر است، زیرا ممکن است به دلیل حضور اتوآنتی‌بادی‌ها یا پروتئین‌های غیرطبیعی سرم باشد.
2. کاربرد در انتقال خون:
   • اهداکنندگان Du مثبت نباید برای انتقال خون استفاده شوند، زیرا ممکن است باعث واکنش‌های ایمونولوژیک در گیرندگان Rh منفی شوند.
   • گیرندگان Du مثبت باید فقط خون Rh منفی دریافت کنند.
3. نتایج مثبت کاذب: نتایج مثبت کاذب ممکن است در حضور اتوآنتی‌بادی‌ها یا پروتئین‌های غیرطبیعی سرم رخ دهد. استفاده از کنترل آلبومین گاوی 22% برای تشخیص این موارد ضروری است.
4. تهیه معرف کومبز: معرف آنتی‌هومن گلبولین از طریق تزریق گاماگلوبولین انسانی به یک گروه از خرگوش‌ها و بتاگلوبولین انسانی به گروه دیگر (برای تولید آنتی‌بادی‌های مکمل) تهیه می‌شود. سرم این خرگوش‌ها پس از مدتی جمع‌آوری و ترکیب می‌شود.
5. تکرار آزمایش: در صورت نتایج نامعتبر، آزمایش باید با نمونه تازه تکرار شود یا از روش‌های پیشرفته‌تر مانند PCR برای شناسایی ژن RHD استفاده شود.

اقدامات احتیاطی در تست ضعیف D

• از سرم آنتی‌D و معرف کومبز معتبر و دارای تاریخ انقضای مناسب استفاده کنید.
• شستشوی کامل گلبول‌های قرمز برای حذف آنتی‌بادی‌های غیرمتصل ضروری است.
• دمای انکوباتور یا حمام آب باید دقیقاً 37 درجه سانتی‌گراد باشد.
• از آلودگی لوله‌ها، لام‌ها و معرف‌ها جلوگیری کنید.
• تجهیزات سانتریفیوژ و انکوباتور را به طور منظم کالیبره کنید.
• تمام مواد زائد بیولوژیکی را طبق پروتکل‌های دفع ایمن دور بریزید.

کنترل کیفیت

• کنترل مثبت و منفی: از نمونه‌های شناخته‌شده Rh مثبت و Rh منفی به عنوان کنترل استفاده کنید.
• کنترل معرف‌ها: کیفیت سرم آنتی‌D و معرف کومبز را قبل از استفاده بررسی کنید.
• نگهداری معرف‌ها: معرف‌ها را در دمای توصیه‌شده (معمولاً 2-8 درجه سانتی‌گراد) نگهداری کنید و از یخ‌زدگی یا گرمای بیش از حد جلوگیری کنید.

محدودیت‌های آزمایش Du

• آزمایش Du ممکن است در حضور اتوآنتی‌بادی‌ها یا بیماری‌های خودایمنی مانند لوپوس اریتماتوز سیستمیک نتایج نادرست نشان دهد.
• این آزمایش برای شناسایی انواع بسیار ضعیف آنتی‌ژن D (مانند D-el) مناسب نیست و نیاز به روش‌های مولکولی دارد.
• خطاهای تکنیکی مانند شستشوی ناکافی یا آلودگی معرف‌ها می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.

مستندات و گزارش‌دهی در آزمایش Du

• تمام مراحل آزمایش، از جمله شماره نمونه، تاریخ، و نتایج را در فرم‌های استاندارد آزمایشگاه ثبت کنید.
• نتایج مثبت یا نامعتبر را به سرپرست آزمایشگاه گزارش دهید.
• در صورت لزوم، نتایج را با آزمایش‌های تکمیلی (مانند تست‌های مولکولی) تأیید کنید.

منابع پیشنهادی برای مطالعه بیشتر

1. http://jbas.juw.edu.pk/index.php/JBAS/article/download/13/12/
2. http://cfdamp.nic.in/Serology/2.3%20Du%20testing.docx
3. Technical Manual of the American Association of Blood Banks, 13th Edition, 1999
4. Introduction to Transfusion Medicine – Zarin Bharucha & D.D. Chouhan, 1st Edition, 1990
5. Textbook of Medical Laboratory Technology – Praful B. Godkar and Darshan P. Godkar

ملاحظات ایمنی در آزمایش Du

• از دستکش، روپوش آزمایشگاهی و سایر تجهیزات حفاظت فردی (PPE) استفاده کنید.
• با نمونه‌های خون به عنوان مواد بالقوه عفونی رفتار کنید.
• تمام مواد زائد را در ظروف مخصوص دفع زباله‌های بیولوژیکی قرار دهید.

سوالات رایج درباره آزمایش Du

1. آزمایش Du چیست؟

آزمایش Du یا تست ضعیف D برای شناسایی آنتی‌ژن D ضعیف یا جزئی روی گلبول‌های قرمز استفاده می‌شود که در آزمایش مستقیم با سرم آنتی‌D قابل تشخیص نیست.

2. چرا آزمایش Du انجام می‌شود؟

این آزمایش برای تعیین دقیق گروه خونی در بانک خون و جلوگیری از عوارض انتقال خون یا ناسازگاری خونی مادر و جنین انجام می‌شود.

3. چه زمانی نتیجه آزمایش Du نامعتبر است؟

اگر در لوله کنترل (C) آگلوتیناسیون مشاهده شود، نتیجه نامعتبر است و ممکن است به دلیل اتوآنتی‌بادی‌ها یا پروتئین‌های غیرطبیعی سرم باشد.

4. چرا از کنترل آلبومین گاوی استفاده می‌شود؟

کنترل آلبومین گاوی 22% برای شناسایی نتایج مثبت کاذب ناشی از اتوآنتی‌بادی‌ها یا پروتئین‌های غیرطبیعی سرم استفاده می‌شود.

5. چه افرادی نباید خون Du مثبت دریافت کنند؟

گیرندگان Rh منفی نباید خون Du مثبت دریافت کنند، زیرا ممکن است باعث واکنش‌های ایمونولوژیک شود.

6. آیا آزمایش Du برای همه نمونه‌ها لازم است؟

خیر، این آزمایش معمولاً برای نمونه‌هایی انجام می‌شود که در تست مستقیم آگلوتیناسیون با آنتی‌D نتیجه منفی یا ضعیف نشان می‌دهند.

7. شستشوی گلبول‌های قرمز چه اهمیتی دارد؟

شستشوی کامل گلبول‌ها برای حذف آنتی‌بادی‌های غیرمتصل ضروری است تا از نتایج کاذب جلوگیری شود.

8. چه روش‌هایی برای تأیید نتایج Du مثبت استفاده می‌شود؟

در صورت نتایج نامعتبر یا مشکوک، از روش‌های مولکولی مانند PCR برای شناسایی ژن RHD استفاده می‌شود.

9. آیا آزمایش Du محدودیت‌هایی دارد؟

بله، این آزمایش در حضور اتوآنتی‌بادی‌ها یا برای شناسایی انواع بسیار ضعیف آنتی‌ژن D (مانند D-el) ممکن است نادرست باشد.

10. چگونه از کیفیت معرف‌ها در آزمایش Du اطمینان حاصل کنیم؟

کیفیت سرم آنتی‌D و معرف کومبز باید قبل از استفاده بررسی شود و معرف‌ها در دمای مناسب (2-8 درجه سانتی‌گراد) نگهداری شوند.