راهنمای جامع کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار برای کارشناسان آزمایشگاه

کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار فرآیندی ضروری برای تضمین دقت نتایج آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی (AST) است. این کنترل شامل بررسی ترکیبات پایه‌ای مانند عصاره گوشت و هیدرولیزات کازئین، تنظیم pH و کاتیون‌ها، آزمون‌های میکروبی با سویه‌های استاندارد ATCC، و ذخیره‌سازی مناسب می‌شود. برای انجام کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون، از استانداردهای CLSI پیروی کنید، سویه‌های QC مانند E. coli ATCC 25922 را استفاده نمایید و نتایج را مستندسازی کنید تا مقاومت یا حساسیت باکتری‌ها به درستی تفسیر شود.

جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education

🚀عضویت در کانال تلگرام

مقدمه

محیط مولر هینتون آگار یکی از پرکاربردترین محیط‌های کشت در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی است که عمدتاً برای انجام آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی (Antimicrobial Susceptibility Testing – AST) به کار می‌رود. این محیط، که اولین بار توسط Mueller و Hinton در سال ۱۹۴۱ معرفی شد، برای کشت باکتری‌های غیرسخت‌رشد (non-fastidious) طراحی شده و امکان ارزیابی دقیق اثربخشی آنتی‌بیوتیک‌ها را فراهم می‌کند. اهمیت کنترل کیفی (Quality Control – QC) این محیط به دلیل تأثیر مستقیم آن بر نتایج آزمون‌های AST است؛ زیرا هرگونه ناهنجاری در ترکیب یا عملکرد آن می‌تواند منجر به تفسیر نادرست مقاومت یا حساسیت باکتری‌ها شود.

طبق استانداردهای موسسه استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI)، محیط مولر هینتون باید با معیارهای خاصی مطابقت داشته باشد تا نتایج قابل تکرار و معتبر تولید کند. این مقاله همه جنبه‌های کنترل کیفی محیط مولر هینتون را پوشش می‌دهد، از جمله ترکیبات، تهیه، پارامترهای فیزیکی و شیمیایی، آزمون‌های میکروبی، ذخیره‌سازی، مشکلات رایج و نسخه‌های خاص آن. اطلاعات بر اساس استانداردهای CLSI (مانند M100، M02 و M07) و منابع معتبر دیگر گردآوری شده است.

کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون

جهت مطالعه جامع از کنترل کیفی در بخش میکروب شناسی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی میکروب شناسی: اصول، روش‌ها و استانداردهای عملکردی

ترکیبات محیط کشت مولر هینتون آگار در فرآیند کنترل کیفی و کیفیت سنجی

محیط مولر هینتون آگار (MHA) و براث (MHB) شامل مواد مغذی پایه‌ای است که رشد باکتری‌ها را بدون تداخل با آنتی‌بیوتیک‌ها حمایت می‌کند. ترکیبات استاندارد طبق CLSI عبارتند از:

  • عصاره گوشت (Beef Extract یا Meat Infusion): ۲ گرم در لیتر، منبع کربن و نیتروژن.
  • هیدرولیزات کازئین (Casein Hydrolysate یا Acicase): ۱۷.۵ گرم در لیتر، تأمین‌کننده اسیدهای آمینه.
  • نشاسته (Starch): ۱.۵ گرم در لیتر، به عنوان محافظ در برابر مواد سمی و منبع انرژی پس از هیدرولیز.
  • آگار (Agar): ۱۷ گرم در لیتر (فقط در MHA برای جامد کردن محیط).

pH نهایی محیط باید ۷.۳ ± ۰.۱ در ۲۵ درجه سانتی‌گراد باشد. سطوح thymine و thymidine باید پایین باشد تا با آزمون‌های سولفونامید و تری‌متوپریم تداخل نکند، و غلظت کاتیون‌های دو ظرفیتی مانند کلسیم (Ca²⁺) و منیزیم (Mg²⁺) کنترل‌شده باشد (معمولاً ۲۰-۲۵ میلی‌گرم در لیتر برای Ca و ۱۰-۱۲.۵ میلی‌گرم در لیتر برای Mg) تا اندازه زون‌های مهاری مناسب باشد.

تهیه و آماده‌سازی محیط کشت مولر هینتون آگار

برای تهیه محیط خشک (dehydrated)، مقدار مشخصی (معمولاً ۳۸ گرم برای MHA) را در ۱ لیتر آب مقطر حل کرده و با حرارت جوشانده تا کاملاً حل شود. سپس در اتوکلاو در ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید. پس از خنک شدن تا ۴۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد، محیط را در پلیت‌های استریل بریزید. ضخامت آگار باید ۴ میلی‌متر باشد تا پخش آنتی‌بیوتیک مناسب باشد.

در صورت نیاز به نسخه‌های خاص:

  • MH با خون (MH with 5% Blood): برای باکتری‌های سخت‌رشد مانند Streptococcus pneumoniae.
  • MH-F (برای fastidious organisms): با افزودنی‌های اضافی برای Haemophilus spp.

پس از تهیه، کنترل pH ضروری است؛ اگر pH خارج از محدوده باشد، با HCl یا NaOH تنظیم کنید.

کنترل کیفی فیزیکی و شیمیایی محیط کشت مولر هینتون آگار و پارامترهای کیفیت سنجی

پارامترهای فیزیکی در کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار

  • ظاهر: محیط باید شفاف، بدون رسوب، حباب یا ناهمواری باشد. رطوبت بیش از حد یا خشکی می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.
  • pH: اندازه‌گیری pH پس از تهیه الزامی است. محدوده قابل قبول ۷.۲-۷.۴ در ۲۵ درجه سانتی‌گراد. انحراف می‌تواند رشد باکتری یا پخش آنتی‌بیوتیک را مختل کند.
  • سختی (Hardness): آگار باید محکم اما نه بیش از حد سفت باشد تا دیسک‌ها به درستی قرار گیرند.

پارامترهای شیمیایی در کیفیت سنجی محیط کشت مولر هینتون آگار

  • غلظت کاتیون‌ها: با آزمون دیسک دیفیوژن آمینوگلیکوزیدها روی Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 کنترل شود. زون‌های خارج از محدوده نشان‌دهنده سطوح نامناسب Ca/Mg است.
  • سطوح thymine/thymidine: با آزمون SXT روی Enterococcus faecalis ATCC 29212 بررسی شود؛ زون‌های کوچک نشان‌دهنده سطوح بالا است.
  • مهارکننده‌ها: محیط نباید حاوی مهارکننده‌های تتراسایکلین یا سولفونامید باشد.

طبق ISO/TS 16782، محیط خشک باید معیارهای عملکردی را برای پذیرش لات‌ها برآورده کند.

کنترل کیفی میکروبی محیط کشت مولر هینتون و آزمون‌های کیفیت سنجی AST

کنترل کیفی میکروبی محیط مولر هینتون بخش حیاتی از فرآیند اطمینان از کیفیت است و هدف آن تأیید عملکرد محیط در حمایت از رشد باکتری‌ها و تولید نتایج دقیق در آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی (AST) است. این کنترل با استفاده از سویه‌های استاندارد کنترل کیفیت (QC strains) که توسط موسساتی مانند ATCC (American Type Culture Collection) فراهم می‌شوند، انجام می‌شود. این سویه‌ها باکتری‌های غیرسخت‌رشد هستند که رفتار قابل پیش‌بینی در برابر آنتی‌بیوتیک‌های خاص دارند. کنترل کیفی میکروبی باید برای هر لات جدید محیط، و همچنین به صورت هفتگی یا روزانه (بسته به حجم کار آزمایشگاه) انجام شود تا هرگونه تغییر در عملکرد محیط شناسایی شود.

طبق استانداردهای CLSI (M02 و M07) و راهنماهای WHO، کنترل کیفی باید شامل آزمون‌های دیسک دیفیوژن (Disk Diffusion) و تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC) باشد. در ادامه، جزئیات روش، سویه‌ها، محدوده‌های قابل قبول، و مشکلات رایج توضیح داده می‌شود. همچنین، از جدول ارائه‌شده توسط کاربر که بر اساس استانداردهای WHO (revised) است، برای مثال‌های عملی استفاده می‌شود. توجه کنید که محدوده‌ها ممکن است بین استانداردهای CLSI و WHO تفاوت‌هایی داشته باشد، بنابراین آزمایشگاه‌ها باید به استاندارد مورد استفاده خود پایبند باشند.

سویه‌های کنترل استاندارد در کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار

سویه‌های QC رایج برای محیط مولر هینتون عبارتند از:

  • Escherichia coli ATCC 25922: برای کنترل آنتی‌بیوتیک‌های گسترده مانند بتا-لاکتام‌ها، آمینوگلیکوزیدها و فلوروکینولون‌ها.
  • Staphylococcus aureus ATCC 25923: برای کنترل آنتی‌بیوتیک‌های ضداستاف مانند پنی‌سیلین‌ها و تتراسایکلین‌ها.
  • Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: برای کنترل سطوح کاتیون‌ها (مانند Ca و Mg) و آنتی‌بیوتیک‌های ضدپسودوموناس مانند جنتامایسین.
  • Enterococcus faecalis ATCC 29212: برای کنترل سولفونامیدها و تری‌متوپریم (SXT)، و سطوح thymine/thymidine.
  • سویه‌های اضافی برای نسخه‌های خاص: مانند Haemophilus influenzae ATCC 49247 برای MH-F، یا Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 برای محیط با خون.

در جدول ارائه‌شده، سویه Enterococcus faecalis ATCC 33186 استفاده شده که معمولاً برای آزمون‌های مقاومت سطح بالا (مانند High-Level Aminoglycoside Resistance) به کار می‌رود، اما در برخی استانداردهای WHO برای کنترل SXT نیز ذکر می‌شود.

روش آزمون کنترل کیفی در کیفیت سنجی محیط کشت مولر هینتون آگار

  1. آماده‌سازی اینوکولوم: سویه QC را از ذخیره فریز (-70 درجه سانتی‌گراد) احیا کرده و روی محیط غیرانتخابی (مانند Blood Agar ) کشت دهید. سپس، کلنی‌ها را در سالین استریل معلق کنید تا توربیدیتی 0.5 McFarland (معادل 1.5 × 10^8 CFU/mL) برسد. این مرحله باید در 15 دقیقه انجام شود تا زنده‌مانی باکتری حفظ شود.
  2. روش دیسک دیفیوژن (Kirby-Bauer): پلیت MHA را با سواب پنبه‌ای به طور یکنواخت اینوکوله کنید (سه بار چرخش 60 درجه‌ای برای پوشش کامل). دیسک‌های آنتی‌بیوتیک را با پنس استریل قرار دهید (حداکثر 6 دیسک در پلیت 150 میلی‌متری). پلیت را در 35 ± 2 درجه سانتی‌گراد به مدت 16-18 ساعت (برای اکثر باکتری‌ها) یا 20-24 ساعت (برای برخی) انکوبه کنید. قطر زون مهار (Inhibition Zone) را با کالیپر اندازه‌گیری کنید (از پشت پلیت، شامل زون کامل مهار).
  3. روش MIC (Broth Microdilution یا E-test): در MHB، رقت‌های سریالی آنتی‌بیوتیک تهیه کنید. اینوکولوم نهایی 5 × 10^5 CFU/mL باشد. پس از انکوباسیون، پایین‌ترین غلظتی که رشد قابل مشاهده را مهار می‌کند، MIC است.
  4. فرکانس کنترل: برای هر لات جدید محیط یا دیسک‌ها. هفتگی برای آزمایشگاه‌های با حجم کم. روزانه اگر بیش از 5 آزمون در روز انجام شود (طبق CLSI). ثبت نتایج در لاگ‌بوک و بررسی روند (Trend Analysis) برای شناسایی انحرافات.

اگر نتایج خارج از محدوده باشد، لات محیط یا دیسک‌ها رد شده و آزمون تکرار می‌شود. اگر مشکل ادامه داشت، عوامل خارجی مانند دما، رطوبت یا کیفیت آب بررسی شود.

محدوده‌های قابل قبول

محدوده‌ها بر اساس استانداردهای CLSI M100 (نسخه‌های اخیر مانند 2020 یا جدیدتر) و WHO تعیین می‌شوند. در استانداردهای CLSI، محدوده‌ها سالانه به‌روزرسانی می‌شوند (برای مثال، در نسخه 2025، تغییراتی در برخی آنتی‌بیوتیک‌ها مانند سیپروفلوکساسین برای E. coli اعمال شده). جدول زیر بر اساس استانداردهای WHO (revised) استخراج شده است. این جدول قطر زون مهار (در میلی‌متر) را برای دیسک‌های خاص نشان می‌دهد:

Test discs Esch. coli ATCC 25922 Staph. aureus ATCC 25923 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 Enteroc. faecalis ATCC 33186
Ampicillin 10 μg 16-22 27-35 – –
Tetracyclin 30 μg 18-25 19-28 16-21 –
Gentamicin 10 μg 19-26 19-27 16-21 –
Polymyxin B 300 IU 12-17 7-13 – –
Sulfamethoxazole 1.25 μg + Trimethoprim 23.75 μg 24-32 24-32 – >20

توضیحات جدول:

  • “-” نشان‌دهنده عدم کاربرد آنتی‌بیوتیک برای سویه مربوطه در کنترل کیفی است.
  • برای SXT (Sulfamethoxazole-Trimethoprim)، سطوح پایین thymine/thymidine در محیط ضروری است تا زون‌های کاذب کوچک ایجاد نشود.
  • این محدوده‌ها طبق راهنماهای WHO (revised) هستند که ممکن است برای آزمایشگاه‌های در کشورهای در حال توسعه بهینه‌سازی شده باشند. در مقایسه با CLSI M100 (2020)، برخی تفاوت‌ها وجود دارد؛ برای مثال:
    • Tetracycline برای S. aureus ATCC 25923 در CLSI: 24-30 mm (در مقابل 19-28 mm در WHO).
    • Trimethoprim-Sulfamethoxazole برای E. coli ATCC 25922 در CLSI: 23-29 mm (در مقابل 24-32 mm در WHO).
    • Polymyxin B معمولاً برای P. aeruginosa در CLSI (13-19 mm) کنترل می‌شود، اما در این جدول برای E. coli و S. aureus ذکر شده.

برای MIC، محدوده‌ها متفاوت هستند (در μg/mL). برای مثال، طبق CLSI 2020 (Table 5A):

  • Ampicillin برای E. coli ATCC 25922: 2-8 μg/mL.
  • Gentamicin برای P. aeruginosa ATCC 27853: 0.5-2 μg/mL.

آزمایشگاه‌ها باید از آخرین نسخه استاندارد (مانند CLSI M100-35th ed. در 2025) استفاده کنند و محدوده‌ها را به‌روزرسانی نمایند.

مشکلات رایج

  • زون‌های کوچکتر از حد انتظار: ممکن است به دلیل سطوح بالای کاتیون‌ها (برای آمینوگلیکوزیدها) یا thymidine (برای SXT). رفع: تعویض لات محیط یا تنظیم کاتیون‌ها با افزودن CaCl2/MgCl2.
  • زون‌های بزرگتر: سطوح پایین کاتیون‌ها یا pH بالا. رفع: کنترل شیمیایی محیط.
  • رشد ضعیف یا عدم رشد: آلودگی، pH نامناسب یا محیط خشک‌شده. رفع: آزمون استریلیتی و تنظیم pH به 7.2-7.4.
  • انحرافات مکرر: بررسی کیفیت دیسک‌ها (تاریخ انقضا، ذخیره‌سازی در -20 درجه)، دستگاه انکوباتور یا تکنیک اینوکوله.
  • نکته: برای سویه‌های سخت‌رشد، از MH-F استفاده کنید و QC را با سویه‌های خاص مانند H. influenzae انجام دهید.

با رعایت این مراحل، کنترل کیفی میکروبی تضمین می‌کند که نتایج AST دقیق و قابل اعتماد باشند، که برای درمان بیماران حیاتی است. مستندسازی همه آزمون‌ها و گزارش انحرافات به آزمایشگاه الزامی است.

ذخیره‌سازی و تاریخ انقضا در کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار

  • ذخیره‌سازی: پلیت‌ها در یخچال (۲-۸ درجه سانتی‌گراد) دور از نور مستقیم نگهداری شوند. محیط خشک در ۱۰-۳۰ درجه سانتی‌گراد و دور از رطوبت.
  • تاریخ انقضا: معمولاً ۶ هفته برای MHB و تا تاریخ درج‌شده برای MHA. از محیط‌های خشک‌شده یا آلوده اجتناب کنید.
  • نکته: پس از باز کردن، درب را محکم ببندید تا رطوبت جذب نشود.

مشکلات رایج و عیب‌یابی در کیفیت سنجی محیط کشت مولر هینتون

  • مشکل: زون‌های کوچک با آمینوگلیکوزیدها – علت: سطوح بالای Ca/Mg؛ رفع: تنظیم کاتیون‌ها یا تعویض لات.
  • مشکل: رشد ضعیف – علت: pH نامناسب یا آلودگی؛ رفع: کنترل pH و استریلیتی.
  • مشکل: زون‌های بزرگ با SXT – علت: سطوح پایین thymine؛ رفع: آزمون با سویه کنترل.
  • مشکلات عمومی: حباب (به دلیل جوشاندن ناکافی)، رطوبت اضافی (انکوباسیون طولانی)، یا آلودگی (کنترل استریلیتی). خطاهای رایج شامل تنظیم نادرست اینوکولوم، دمای انکوباسیون نامناسب یا خوانش زود/دیر زون‌ها است.

نسخه‌های خاص محیط کشت مولر هینتون و کنترل کیفی آنها

  • MH-F (Mueller-Hinton Fastidious): برای باکتری‌های سخت‌رشد مانند Haemophilus، با افزودن NAD و خون اسب.
  • MH با خون و NAD: برای Streptococcus و Haemophilus، با کنترل QC جداگانه.
  • MH برای قارچ‌ها: برای آزمون‌های ضدقارچی، با کنترل برای آمفوتریسین B و ایتراکونازول.

این نسخه‌ها نیاز به QC خاص دارند، مانند استفاده از سویه‌های ATCC 49247 برای Haemophilus.

نتیجه‌گیری

کنترل کیفی محیط مولر هینتون پایه‌ای برای دقت آزمون‌های AST است و باید طبق استانداردهای CLSI انجام شود. رعایت همه جنبه‌ها از تهیه تا ذخیره‌سازی، نتایج معتبر و قابل اعتماد را تضمین می‌کند. کارشناسان آزمایشگاه باید به طور منظم QC را مستندسازی کنند و در صورت انحراف، اقدامات اصلاحی انجام دهند.

مراجع

  • CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. M100, 30th ed. 2020.
  • CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. M07.
  • CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. M02.
  • ISO/TS 16782: Criteria for acceptable lots of dehydrated Mueller-Hinton agar and broth.

سوالات رایج

1. کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون آگار چیست؟

کنترل کیفی محیط مولر هینتون فرآیندی است برای اطمینان از عملکرد صحیح محیط در آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی، شامل بررسی فیزیکی، شیمیایی و میکروبی طبق استانداردهای CLSI و WHO.

2. چرا کنترل کیفی محیط مولر هینتون مهم است؟

این کنترل تضمین می‌کند که نتایج AST دقیق باشند و از تفسیر نادرست مقاومت باکتری‌ها جلوگیری شود، که مستقیماً بر درمان بیماران تأثیر می‌گذارد.

3. ترکیبات اصلی محیط کشت مولر هینتون در کنترل کیفی چیست؟

ترکیبات شامل عصاره گوشت (2 گرم/لیتر)، هیدرولیزات کازئین (17.5 گرم/لیتر)، نشاسته (1.5 گرم/لیتر) و آگار (17 گرم/لیتر برای MHA) است، با pH 7.3 ± 0.1.

4. چگونه محیط کشت مولر هینتون را تهیه کنیم برای کنترل کیفی؟

38 گرم پودر خشک را در 1 لیتر آب حل کنید، بجوشانید، اتوکلاو کنید و در پلیت‌ها بریزید با ضخامت 4 میلی‌متر، سپس pH را تنظیم کنید.

5. پارامترهای فیزیکی در کنترل کیفی  کدامند؟

شامل ظاهر شفاف بدون رسوب، pH 7.2-7.4 و سختی مناسب آگار برای قرارگیری دیسک‌ها.

6. سویه‌های استاندارد برای کنترل کیفی میکروبی محیط کشت مولر هینتون چیست؟

سویه‌هایی مانند E. coli ATCC 25922، S. aureus ATCC 25923، P. aeruginosa ATCC 27853 و E. faecalis ATCC 29212.

7. فرکانس کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون چقدر است؟

برای هر لات جدید، هفتگی برای حجم کم و روزانه برای بیش از 5 آزمون در روز طبق CLSI.

8. مشکلات رایج در کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون چیست؟

زون‌های کوچک یا بزرگ، رشد ضعیف به دلیل pH نامناسب، سطوح کاتیون‌ها یا آلودگی.

9. نسخه‌های خاص محیط کشت مولر هینتون برای کنترل کیفی کدامند؟

MH-F برای باکتری‌های سخت‌رشد، MH با خون برای Streptococcus و MH برای قارچ‌ها با QC خاص.

10. استانداردهای اصلی برای کنترل کیفی محیط کشت مولر هینتون چیست؟

استانداردهای CLSI مانند M100، M02، M07 و ISO/TS 16782 برای پذیرش لات‌ها.

11. چگونه سطوح کاتیون‌ها را بررسی کنیم؟

با آزمون دیسک دیفیوژن آمینوگلیکوزیدها روی P. aeruginosa ATCC 27853 و بررسی زون‌های مهار.

12. تاریخ انقضا محیط کشت مولر هینتون چقدر است؟

معمولاً 6 هفته برای MHB و تا تاریخ درج‌شده برای MHA، با ذخیره‌سازی در یخچال.

جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35659925/

 

دیدگاهتان را بنویسید