خلاصه مقاله: روش انجام آزمایش رتیکولوسیت

روش انجام آزمایش رتیکولوسیت (روش انجام آزمایش رتیک) شامل جمع‌آوری نمونه خون EDTA، رنگ‌آمیزی سوپرویتال با نیو متیلن بلو، انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه، تهیه اسمیر و شمارش حداقل 1000 گلبول قرمز زیر میکروسکوپ است. این تست عملکرد مغز استخوان را ارزیابی می‌کند و نتایج به صورت درصد یا تعداد مطلق گزارش می‌شود. برای دقت بیشتر، از شاخص‌های اصلاحی مانند CRC و RPI استفاده می شود تا پاسخ مغز استخوان به آنمی را تعیین نماید.

مقدمه: اهمیت روش انجام آزمایش رتیکولوسیت در تشخیص اختلالات خونی

شمارش رتیکولوسیت‌ها (Reticulocyte Count) یک پارامتر کلیدی در ارزیابی عملکرد مغز استخوان است که تعداد رتیکلوسیت ها را در گردش خون محیطی اندازه‌گیری می‌کند. رتیکولوسیت‌ها، سلول‌های قرمز خونی هستند که پس از خروج از مغز استخوان، هنوز حاوی بقایای RNA ریبوزومی (به صورت گرانول‌های بازوفیلیک) بوده و طی 1-2 روز به اریتروسیت‌های بالغ تبدیل می‌شوند. این تست، به عنوان شاخصی از نرخ تولید اریتروسیت‌ها، در تشخیص افتراقی آنمی‌ها، نظارت بر پاسخ درمانی و ارزیابی اختلالات هماتولوژیک کاربرد دارد. معمولاً همراه با پارامترهای CBC، سطح هموگلوبین و هماتوکریت تفسیر می‌شود تا تمایز بین آنمی‌های هیپوپرولیفراتیو و هیپرپرولیفراتیو فراهم آید.

روش انجام آزمایش رتیکولوسیت: دستورالعمل استاندارد عملیاتی (SOP) برای شمارش رتیکولوسیت

عنوان: روش استاندارد شمارش رتیکولوسیت دستی

دستورالعمل استاندارد عملیاتی (SOP) برای شمارش رتیکولوسیت‌ها به روش دستی

هدف: هدف از روش انجام آزمایش رتیکولوسیت

این SOP روش استاندارد برای انجام شمارش رتیکولوسیت‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی سوپرویتال و شمارش دستی زیر میکروسکوپ را توصیف می‌کند. این روش برای ارزیابی فعالیت اریتروپوئتیک مغز استخوان در آزمایشگاه‌های هماتولوژی کاربرد دارد و نتایج را به صورت درصد یا تعداد مطلق گزارش می‌کند.

دامنه کاربرد: دامنه استفاده از تست رتیکولوسیت

این دستورالعمل برای تمام پرسنل واجد شرایط ، دانشجویان و تکنسین‌های آزمایشگاه در رشته هماتولوژی یا آزمایشگاه بالینی قابل استفاده است. این SOP بر روش دستی تمرکز دارد؛ برای روش‌های اتوماتیک، به دستورالعمل‌های دستگاه مربوطه مراجعه شود.

اصل روش: اصول پایه در آزمایش رتیکولوسیت

رتیکولوسیت‌ها سلول‌های قرمز نابالغی هستند که حاوی RNA هستند. با رنگ‌آمیزی حیاتی یا سوپرویتال (مانند نیو متیلن بلو)، RNA به صورت شبکه گرانولی آبی‌رنگ ظاهر می‌شود. شمارش رتیکولوسیت‌ها شاخصی از فعالیت مغز استخوان است و می‌تواند به صورت درصد نسبت به اریتروسیت‌ها، درصد اصلاح‌شده، تعداد مطلق، شاخص رتیکولوسیت (RI) یا شاخص تولید رتیکولوسیت (RPI) بیان شود. در شرایط آنمی، رتیکولوسیت‌ها زودتر آزاد می‌شوند و زمان بلوغ آنها در گردش خون افزایش می‌یابد.

مسئولیت‌ها: مسئولیت‌ها در اجرای روش شمارش رتیکولوسیت

– تکنسین آزمایشگاه: انجام روش، شمارش و گزارش نتایج.
– سوپروایزر: نظارت بر کنترل کیفیت و آموزش پرسنل.
– مدیر آزمایشگاه: بررسی و به‌روزرسانی SOP بر اساس استانداردهای CLSI یا CAP.

مواد و معرف‌ها: مواد لازم برای تست رتیکولوسیت

– لوله‌های آزمایش (10 یا 12 × 75 میلی‌متر)
– سمپلر (حجم قابل تنظیم)
– پیپت‌های پلاستیکی پاستور
– اسلایدهای شیشه‌ای
– خون کامل آنتی‌کواگولانته با K3 EDTA (نمونه مورد نیاز)
– معرف رنگ‌آمیزی: نیو متیلن بلو (New Methylene Blue) یا آزور B (Azure B) به عنوان رنگ سوپرویتال اصلی؛ بریلینت کرزیل بلو (Brilliant Cresyl Blue) به عنوان جایگزین.
– بافر سیترات-سالین: 3 گرم تری‌سدیم سیترات در 100 میلی‌لیتر آب مقطر، سپس 20 میلی‌لیتر از آن را با 80 میلی‌لیتر NaCl 9 گرم در لیتر مخلوط کنید.
– معرف رنگ‌آمیزی آماده: 0.1 گرم نیو متیلن بلو یا آزور B را در 100 میلی‌لیتر بافر سیترات-سالین حل کنید، 24 ساعت تکان دهید، فیلتر کنید و در بطری شیشه‌ای قهوه‌ای در دمای 2-8 درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید (عمر مفید حدود یک ماه).
– مواد کنترل تجاری: کنترل‌های هماتولوژی با مقادیر مشخص رتیکولوسیت (مانند کنترل‌های سطح پایین، نرمال و بالا).

تجهیزات: تجهیزات مورد نیاز در روش انجام آزمایش رتیکولوسیت

– میکروسکوپ نوری با لنز روغن ×100
– شمارنده دستی (اختیاری برای شمارش سلول‌ها)
– تجهیزات ایمنی: دستکش، ماسک، عینک ایمنی و لباس آزمایشگاهی.

الزامات نمونه: الزامات نمونه‌برداری در تست رتیکولوسیت

– نوع نمونه: خون وریدی با آنتی‌کواگولانت K3 EDTA.
– حجم: حداقل 2 میلی‌لیتر.
– ذخیره‌سازی: آزمایش را بلافاصله پس از جمع‌آوری انجام دهید. در دمای اتاق تا 6 ساعت پایدار است؛ در یخچال (2-8 درجه سانتی‌گراد) تا 72 ساعت، اما ممکن است تا 20% کاهش در شمارش رخ دهد. برای روش‌های اتوماتیک، دستورالعمل دستگاه را بررسی کنید.
– رد نمونه: نمونه‌های منعقد، همولیز شده یا بیش از حد رقیق.

مراحل اجرایی (Procedure): مراحل گام به گام روش انجام آزمایش رتیکولوسیت

1. **آماده‌سازی نمونه:** نمونه خون EDTA را با وارونه کردن ملایم 10 بار مخلوط کنید تا سلول‌ها کاملاً معلق شوند.
2. **تهیه مخلوط رنگ‌آمیزی:** 3 قطره (حدود 150 میکرولیتر) از معرف رنگ‌آمیزی (نیو متیلن بلو یا آزور B) را در لوله آزمایش بریزید. برای بیماران آنمیک، 4 قطره خون و برای پلی‌سیتمیک، 2 قطره خون استفاده کنید.
3. **اضافه کردن خون:** 3 قطره (حدود 150 میکرولیتر) از خون بیمار را به معرف اضافه کنید و مخلوط کنید.
4. **انکوباسیون:** مخلوط را در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه انکوبه کنید.
5. **تهیه اسمیر:** پس از انکوباسیون، مخلوط را به آرامی تکان دهید. دو اسمیر خون تهیه کنید (با روش wedge smear: قطره‌ای از مخلوط را روی اسلاید قرار دهید و با اسلاید دیگر پخش کنید تا لایه نازک و یکنواخت ایجاد شود).
6. **خشک کردن:** اسمیرها را در هوا خشک کنید (بدون فیکساسیون یا کانتراستینینگ).
7. **بررسی اولیه:** زیر قدرت کم میکروسکوپ (×10)، ناحیه‌ای با توزیع یکنواخت سلول‌های قرمز (بدون هم‌پوشانی) پیدا کنید، ترجیحاً پشت دم اسمیر.
8. **شمارش زیر میکروسکوپ:** به لنز روغن ×100 تغییر دهید. ناحیه‌ای انتخاب کنید که سلول‌ها نزدیک اما بدون تماس باشند (حدود 100 سلول در هر فیلد). حداقل 1000 سلول قرمز را در 10 فیلد (هر فیلد 100 سلول) شمارش کنید. از الگوی battlement برای حرکت بین فیلدها استفاده کنید.
9. **شناسایی رتیکولوسیت‌ها:** رتیکولوسیت‌ها سلول‌های قرمز کمی بزرگ‌تر با حداقل دو گرانول آبی مجزا (یا یک گرانول متصل به رشته فیلامانتی) هستند که بدون تنظیم فوکوس ریز قابل مشاهده‌اند. گرانول‌ها نباید با اجسام هینز یا Howell-Jolly bodies اشتباه شوند (گرانول‌ها دور از حاشیه سلول هستند).
10. **شمارش جایگزین (با دیسک میلر، اگر موجود):** از ocular ×10 با دیسک میلر استفاده کنید. رتیکولوسیت‌ها را در مربع بزرگ و سلول‌های قرمز را در مربع کوچک شمارش کنید تا حداقل 111 سلول قرمز در مربع کوچک (معادل 999 سلول در روش استاندارد) شمارش شود.
11. **ثبت نتایج:** تعداد رتیکولوسیت‌ها را یادداشت کنید.

محاسبات: محاسبات در روش شمارش رتیکولوسیت

– Reticulocyte percentage: (Number of reticulocytes / 1000 red cells) × 100
– Absolute count (ARC): (Reticulocyte percentage × RBC count × 10^6 / μL) / 100
– Corrected percentage (CRC): Reticulocyte percentage × (Patient’s hematocrit / 45%)
– Reticulocyte production index (RPI): CRC / Maturation time (days); Maturation time based on hematocrit: 1 day (45%), 1.5 days (35%), 2 days (25%), 3 days (15%).

کنترل کیفیت (Quality Control): کنترل کیفیت در آزمایش رتیکولوسیت

– روزانه دو سطح کنترل (نرمال و غیرطبیعی) را انجام دهید و نتایج را در محدوده 2SD بررسی کنید.
– بررسی خطاهای بین‌مشاهده‌گر: حداقل 15% توافق بین تکنسین‌ها.
– فیلتر کردن معرف قبل از استفاده برای جلوگیری از رسوب.
– بررسی اسمیر برای توزیع یکنواخت و عدم هم‌پوشانی.
– منابع خطا: رنگ‌آمیزی ناکافی، رسوب در معرف، اشتباه در شناسایی گرانول‌ها، تأخیر در آزمایش.

ایمنی و احتیاط‌ها: ایمنی در روش انجام آزمایش رتیکولوسیت

– از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) استفاده کنید.
– نمونه‌های خون را به عنوان مواد عفونی بالقوه فرض کنید (استانداردهای بیولوژیک جهانی).
– دور ریختن مواد طبق پروتکل‌های پسماند بیولوژیک.

ارجاعات:

دوره جامع آموزش تصویری هماتولوژی فصل پنج : آزمایش‌ های پایه‌ای خون و مغز استخوان

دوره جامع آموزش تصویری هماتولوژی فصل پنج : آزمایش‌ های پایه‌ای خون و مغز استخوان

– CLSI Document H44-A2: Methods for Reticulocyte Counting.
– کتاب‌های مرجع هماتولوژی مانند Wintrobe’s Clinical Hematology.

میزان نرمال رتیکولوسیت: محدوده طبیعی در روش شمارش رتیکولوسیت

در بزرگسالان سالم، محدوده مرجع درصد رتیکولوسیت معمولاً 0.5-2.5% از کل اریتروسیت‌ها است، که معادل ARC بین 25×10^9/L تا 100×10^9/L می‌باشد. در نوزادان، به دلیل فعالیت بالای مغز استخوان، این مقدار می‌تواند تا 6% برسد و طی هفته‌های اول زندگی کاهش یابد. مقادیر مرجع ممکن است بر اساس سن، جنسیت، ارتفاع محل زندگی (به دلیل هیپوکسی فیزیولوژیک) و روش آزمایشگاهی متفاوت باشد. در آزمایشگاه‌ها، توصیه می‌شود محدوده‌های محلی بر اساس جمعیت مرجع تعیین شوند، و ARC به عنوان شاخص دقیق‌تر نسبت به درصد، به ویژه در حالات آنمیک، ترجیح داده شود.

رتیکولوسیت بالا نشانه چیست: تفسیر افزایش در آزمایش رتیکولوسیت

افزایش رتیکولوسیت (Reticulocytosis) نشان‌دهنده پاسخ جبرانی مغز استخوان به کاهش حجم اریتروسیت‌ها است، که اغلب با افزایش تولید اریتروپویتین (EPO) همراه است. این وضعیت در موارد زیر مشاهده می‌شود:
– خونریزی حاد یا مزمن، که منجر به آنمی هیپرپرولیفراتیو می‌گردد.
– همولیز داخل یا خارج عروقی، مانند آنمی‌های همولیتیک ارثی (تالاسمی، سیکل سل) یا اکتسابی (اتوایمیون، عفونی).
– پس از درمان کمبودهای تغذیه‌ای (آهن، ویتامین B12، فولات) یا خونریزی، جایی که پاسخ رتیکولوسیتی تا 5-10% قابل مشاهده است.
– هیپوکسی مزمن (مانند بیماری‌های ریوی یا ارتفاع بالا) یا پلی‌سیتمی.
– اختلالات هماتولوژیک مانند لوسمی یا سندرم‌های میلو دیسپلاستیک با کامپوننت هیپرپرولیفراتیو.
مقادیر بالای 4% نیازمند ارزیابی افتراقی با بررسی اسمیر خون محیطی برای پلی‌کرومازی و IRF بالا است، که نشان‌دهنده آزادسازی زودرس رتیکولوسیت‌ها می‌باشد.

رتیکولوسیت پایین نشانه چیست: علل کاهش در تست رتیکولوسیت

کاهش رتیکولوسیت (Reticulocytopenia) بیانگر نارسایی مغز استخوان در تولید اریتروسیت‌ها است و اغلب با آنمی هیپوپرولیفراتیو همراه است. علل شایع عبارتند از:
– آپلازی یا هیپوپلازی مغز استخوان (مانند آنمی آپلاستیک، نفوذ متاستاتیک یا اثرات توکسیک داروها/شیمی‌درمانی).
– کمبودهای تغذیه‌ای (آهن، ویتامین B12، فولات) که منجر به اختلال در سنتز DNA یا هم می‌شوند.
– نارسایی کلیوی مزمن، که تولید EPO را کاهش می‌دهد.
– عفونت‌های ویروسی (پاروویروس B19) که اریتروبلاست‌ها را هدف قرار می‌دهند.
– بیماری‌های مزمن (Chronic Disease Anemia) یا اختلالات اندوکرین (هیپوتیروئیدیسم).
– سرکوب مغز استخوان توسط پرتودرمانی یا داروهای ایمونوسوپرسیو.
مقادیر کمتر از 0.5%، به ویژه با ARC پایین، نیازمند بیوپسی مغز استخوان برای ارزیابی سلولیته و مورفولوژی است.

نتیجه‌گیری

شمارش رتیکولوسیت ابزاری اساسی در آزمایشگاه هماتولوژی است که ارزیابی دینامیک هماتوپوئز اریتروئید را تسهیل می‌کند. کارشناسان آزمایشگاه باید بر دقت روش‌شناسی، کنترل کیفی و تفسیر در زمینه بالینی تمرکز کنند. در موارد غیرطبیعی، ادغام با تست‌های تکمیلی مانند سطح EPO، اسمیر محیطی و بیوپسی ضروری است. به‌روزرسانی پروتکل‌های آزمایشگاهی بر اساس گایدلاین‌های CLSI یا CAP توصیه می‌شود.