خلاصه محیط کشت بایل اسکولین
محیط کشت بایل اسکولین آگار برای شناسایی انتروکوک‌ها و گروه D استرپتوکوک‌ها استفاده می‌شود. این محیط با استفاده از نمک‌های صفراوی و اسکولین، رشد باکتری‌های خاص را انتخاب کرده و هیدرولیز اسکولین را با تغییر رنگ به سیاه نشان می‌دهد.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education
فهرست مطالب
مقدمه
محیط بایل اسکولین آگار (BEA) یکی از محیط‌های کشت انتخابی و افتراقی در میکروبیولوژی بالینی است که برای شناسایی اولیه و جداسازی باکتری‌های گروه D استرپتوکوک‌ها و انتروکوک‌ها به کار می‌رود. این محیط برای اولین بار توسط سوآن (Swan) در سال ۱۹۵۴ معرفی شد و قابلیت هیدرولیز اسکولین در حضور صفرا را به عنوان ویژگی کلیدی انتروکوک‌ها و گروه D استرپتوکوک‌ها مورد استفاده قرار می‌دهد. تست بایل اسکولین از سال ۱۹۷۰ توسط فاکلام و مودی (Facklam and Moody) به عنوان روشی قابل اعتماد برای شناسایی این باکتری‌ها تأیید شد. هیدرولیز اسکولین برای اولین بار در سال ۱۹۲۴ توسط روشه (Rochaix) توصیف شده بود. این محیط نه تنها برای شناسایی بالینی مفید است، بلکه در بررسی‌های غذایی و دامپزشکی نیز کاربرد دارد.
اصول عملکرد محیط کشت بایل اسکولین
اصل کار محیط بایل اسکولین بر پایه هیدرولیز اسکولین توسط باکتری‌های هدف استوار است. اسکولین یک گلیکوزید است که توسط آنزیم اسکولیناز هیدرولیز شده و به دکستروز و اسکولتین تبدیل می‌شود. اسکولتین با یون‌های فریک (از سیترات فریک) واکنش داده و کمپلکسی قهوه‌ای تیره یا سیاه تشکیل می‌دهد که تغییر رنگ محیط را نشان می‌دهد.
عنصر انتخابی محیط، نمک‌های صفراوی (oxgall یا bile salts) به غلظت ۴% (معادل ۴۰ گرم در لیتر) است که رشد اکثر باکتری‌های گرم مثبت غیر گروه D را مهار می‌کند. پپتون‌های حیوانی و عصاره گوشت گاو به عنوان منبع کربن، نیتروژن و فاکتورهای رشد عمل می‌کنند. آگار نیز برای جامدسازی محیط استفاده می‌شود. pH نهایی محیط حدود ۶.۶ ± ۰.۲ است. این محیط اجازه رشد باکتری‌های گرم منفی را می‌دهد، اما هیدرولیز اسکولین توسط آن‌ها معمولاً منفی است.
ترکیبات محیط کشت بایل اسکولین
ترکیبات استاندارد محیط بایل اسکولین آگار به ازای یک لیتر به شرح زیر است:
| ماده | مقدار (گرم) |
|---|---|
| پپتون ژلاتین حیوانی (Peptic digest of animal tissue) | ۵.۰ |
| عصاره گوشت گاو (Beef extract) | ۳.۰ |
| اسکولین (Esculin) | ۱.۰ |
| نمک‌های صفراوی (Bile salts یا Oxgall) | ۴۰.۰ |
| سیترات فریک (Ferric citrate) | ۰.۵ |
| آگار (Agar) | ۱۵.۰ |
pH نهایی در ۲۵ درجه سانتی‌گراد: ۶.۶ ± ۰.۲. فرمول ممکن است بر اساس استانداردهای عملکردی تنظیم شود.
روش تهیه محیط کشت بایل اسکولین
تهیه محیط بایل اسکولین آگار به صورت زیر انجام می‌شود:
- سوسپانسیون: ۶۴.۵ گرم پودر محیط را در ۱۰۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر معلق کنید.
- حل کردن: مخلوط را تا جوشاندن حرارت دهید تا کاملاً حل شود. از هم‌زدن مداوم برای جلوگیری از تشکیل توده استفاده کنید.
- تقسیم‌بندی: محیط را در لوله‌ها یا فلاسک‌ها تقسیم کنید.
- استریلیزاسیون: در اتوکلاو با فشار ۱۵ psi (۱۲۱ درجه سانتی‌گراد) به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید.
- جامدسازی: لوله‌ها را در حالت شیب‌دار (slant) با عمق باس ۲.۵ سانتی‌متر جامد کنید یا در پلیت‌های پتری بریزید.
- خنک‌سازی: اجازه دهید محیط به دمای اتاق برسد قبل از استفاده.
محیط آماده‌شده باید شفاف تا کمی شیری با رنگ کهربایی و ته‌رنگ آبی باشد. برای بهبود رشد انتروکوک‌ها، می‌توان ۵۰ میلی‌لیتر سرم اسب در لیتر به محیط اضافه کرد.
روش انجام تست بایل اسکولین
برای انجام تست بایل اسکولین، مراحل زیر را دنبال کنید:
- از یک کلونی خالص یا ۲ قطره از کشت ۲۴ ساعته در براث تاد-هوویت (Todd-Hewitt Broth) برای تلقیح استفاده کنید.
- سطح محیط را streak کنید.
- در محیط هوازی و دمای ۳۳-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸-۴۸ ساعت (تا ۷۲ ساعت در صورت نیاز) انکوبه کنید.
تفسیر نتایج تست بایل اسکولین
- مثبت (هیدرولیز اسکولین): تغییر رنگ محیط به قهوه‌ای تیره تا سیاه اطراف کلونی‌ها و نفوذ به عمق محیط. نشان‌دهنده گروه D استرپتوکوک‌ها یا انتروکوک‌ها.
- منفی: عدم تغییر رنگ یا رشد بدون سیاه‌شدگی.
محیط کشت بایل اسکولین
نتایج نمونه با ارگانیسم‌های کنترل:
| ارگانیسم | رشد | هیدرولیز اسکولین |
|---|---|---|
| Enterococcus faecalis ATCC 29212 | خوب-پررونق | مثبت (سیاه‌شدگی) |
| Streptococcus gallolyticus ATCC 9809 | خوب-پررونق | مثبت (سیاه‌شدگی) |
| Streptococcus pyogenes ATCC 19615 | ضعیف یا عدم رشد | منفی |
| Escherichia coli | خوب | منفی |
| Yersinia enterocolitica | خوب-پررونق | مثبت (سیاه‌شدگی) |
مزایای محیط کشت بایل اسکولین
- انتخابی بودن: نمک‌های صفراوی رشد باکتری‌های غیرهدف را مهار می‌کند.
- تفریقی بودن: تغییر رنگ واضح (سیاه‌شدگی) برای شناسایی هیدرولیز اسکولین.
- سادگی: تست آسان و سریع با نتایج قابل اعتماد در ۱۸-۴۸ ساعت.
- کاربرد گسترده: مناسب برای آزمایشگاه‌های بالینی، غذایی و دامپزشکی.
- هزینه‌اثربخش: مواد اولیه ارزان و تهیه آسان.
کاربردهای محیط کشت بایل اسکولین
- شناسایی بالینی: جداسازی و شناسایی اولیه انتروکوک‌ها و گروه D استرپتوکوک‌ها از نمونه‌های بالینی.
- تمایز: تمایز گروه D از غیر گروه D استرپتوکوک‌ها.
- کاربردهای دیگر: شناسایی Enterobacter, Klebsiella و Serratia در انتروباکتریاسه؛ جداسازی Yersinia enterocolitica از مواد غذایی و خوراک دام.
- تأییدی: همراه با تست‌های بیوشیمیایی، ایمونولوژیک یا مولکولی برای شناسایی کامل.
محدودیت‌های محیط کشت بایل اسکولین
- این محیط برای جداسازی اولیه از نمونه‌های بیمارستانی مناسب نیست و فقط برای کشت‌های خالص استفاده شود.
- ارگانیسم‌های دیگری مانند استافیلوکوک‌ها، آئروکوکوس‌ها و Listeria monocytogenes ممکن است رشد کنند و اسکولین را هیدرولیز کنند (L. monocytogenes کلونی‌های کوچک سیاه تشکیل می‌دهد).
- تلقیح سنگین می‌تواند مهار صفرا را کاهش دهد و تفسیر را دشوار کند.
- برخی استرپتوکوک‌ها در صفرا رشد می‌کنند بدون هیدرولیز اسکولین.
- محیط حاوی آزید نیست، بنابراین باکتری‌های گرم منفی رشد می‌کنند و ممکن است اسکولین را هیدرولیز کنند.
- شناسایی کامل نیاز به تست‌های اضافی دارد و این محیط برای تشخیص بیماری در انسان نیست.
کنترل کیفیت
کنترل کیفیت محیط بایل اسکولین آگار بر اساس استانداردهای CLSI انجام می‌شود و شامل بررسی ظاهر، ژلینگ، شفافیت، pH و عملکرد است.
مشخصات ظاهری
- پودر دهیدراته: زرد روشن تا قهوه‌ای زرد، همگن و روان.
- محیط آماده: ژل سفت، کهربایی، شفاف تا کمی شیری با ته‌رنگ آبی.
تست‌های عملکردی
- از ارگانیسم‌های کنترل با inoculum ۵۰-۱۰۰ CFU استفاده شود.
- انکوباسیون: ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸-۲۴ ساعت در جو CO₂ افزایش‌یافته.
- نتایج مورد انتظار همانند جدول تفسیر نتایج بالا.
- اگر نتایج انحرافی مشاهده شود، گزارش نتایج بیمار را متوقف کنید.
ذخیره‌سازی
- پودر: ۱۰-۳۰ درجه سانتی‌گراد در ظرف بسته.
- محیط آماده: ۲۰-۳۰ درجه سانتی‌گراد، قبل از انقضای برچسب استفاده شود.
- از حرارت شدید و رطوبت محافظت کنید.
جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی میکروبیولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:
کنترل کیفی میکروبیولوژی: راهنمای جامع برای کارشناسان
سوالات رایج درباره محیط کشت بایل اسکولین
۱. محیط کشت بایل اسکولین چیست؟
محیط بایل اسکولین آگار یک محیط انتخابی و تفریقی است که برای شناسایی انتروکوک‌ها و گروه D استرپتوکوک‌ها استفاده می‌شود.
۲. چه باکتری‌هایی در محیط بایل اسکولین رشد می‌کنند؟
انتروکوک‌ها، گروه D استرپتوکوک‌ها، برخی باکتری‌های گرم منفی و گاهی استافیلوکوک‌ها و Listeria monocytogenes رشد می‌کنند.
۳. چگونه هیدرولیز اسکولین در این محیط شناسایی می‌شود؟
هیدرولیز اسکولین با تشکیل رنگ قهوه‌ای تیره تا سیاه در محیط به دلیل واکنش اسکولتین با سیترات فریک شناسایی می‌شود.
۴. چرا از نمک‌های صفراوی در این محیط استفاده می‌شود؟
نمک‌های صفراوی رشد باکتری‌های گرم مثبت غیر گروه D را مهار می‌کند و محیط را انتخابی می‌سازد.
۵. آیا این محیط برای جداسازی اولیه مناسب است؟
خیر، این محیط برای کشت‌های خالص مناسب است و برای جداسازی اولیه توصیه نمی‌شود.
۶. چه مدت طول می‌کشد تا نتایج تست مشاهده شود؟
نتایج معمولاً در ۱۸-۴۸ ساعت قابل مشاهده است، اما گاهی تا ۷۲ ساعت نیاز است.
۷. آیا باکتری‌های گرم منفی در این محیط رشد می‌کنند؟
بله، باکتری‌های گرم منفی می‌توانند رشد کنند، اما معمولاً اسکولین را هیدرولیز نمی‌کنند.
۸. چگونه می‌توان کیفیت محیط را بررسی کرد؟
کنترل کیفیت با بررسی ظاهر، pH، ژلینگ و تست عملکرد با ارگانیسم‌های کنترل انجام می‌شود.
۹. آیا این محیط برای تشخیص بیماری مناسب است؟
خیر، این محیط فقط برای شناسایی اولیه باکتری‌ها استفاده می‌شود و برای تشخیص بیماری نیست.
۱۰. چگونه محیط آماده‌شده را ذخیره کنیم؟
محیط آماده در دمای ۲۰-۳۰ درجه سانتی‌گراد و پودر در ۱۰-۳۰ درجه سانتی‌گراد در ظرف بسته نگهداری شود.
جهت مطالعه بیشتر به لینک زیر مراجعه کنید: