• باکتری را به‌صورت عمقی در لوله نیمه‌جامد تلقیح می‌کنیم.
• لوله را در دمای ۳۵–۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸–۲۴ ساعت انکوبه می‌نماییم.
• سپس معرف Kovac’s را برای تشخیص ایندول به سطح محیط اضافه می‌کنیم.

رسوب سیاه نشانه H₂S مثبت، رنگ قرمز نشانه ایندول مثبت و رشد پراکنده در محیط نشانه حرکت مثبت است. این ویژگی‌ها، SIM medium را به ابزاری ایده‌آل برای تمایز گونه‌هایی مانند
Escherichia coli و Salmonella تبدیل می‌کند.

جهت عضویت در کانال آموزشی تلگرام میکروب‌شناسی و هماتولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:

https://t.me/hematology_education

🚀 عضویت در کانال تلگرام

مقدمه محیط کشت SIM و کاربردهای آن

محیط کشت SIM (که مخفف Sulfide, Indole, Motility است) یکی از ابزارهای کلیدی در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی به‌ویژه برای شناسایی باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای (مانند خانواده Enterobacteriaceae) است. این محیط کشت چندمنظوره به‌طور همزمان سه ویژگی مهم باکتری‌ها را ارزیابی می‌کند: تولید سولفید هیدروژن (H₂S)، تولید ایندول از تریپتوفان و قابلیت حرکت (Motility).

SIM medium معمولاً به صورت آگار نیمه‌جامد (agar deep) تهیه می‌شود تا باکتری‌ها در عمق محیط رشد کرده و ویژگی‌های خود را بهتر نشان دهند. این محیط از دهه ۱۹۴۰ توسعه یافته و امروزه در استانداردهای معتبر میکروبیولوژی، از جمله روش‌های معرفی‌شده توسط ASM، جایگاه تثبیت‌شده‌ای دارد.

در این راهنمای آموزشی، همه جنبه‌های محیط کشت SIM را از ترکیبات و روش تهیه تا تفسیر نتایج و کنترل کیفی به‌طور جامع بررسی می‌کنیم تا برای دانشجویان، میکروبیولوژیست‌ها و کارشناسان آزمایشگاه به‌عنوان یک مرجع کاربردی قابل استفاده باشد.

تاریخچه محیط کشت SIM

ایده اولیه توسعه محیط کشت SIM بر پایه تست‌های جداگانه برای تولید H₂S، ایندول و حرکت باکتری بود. با پیشرفت میکروبیولوژی در اوایل قرن بیستم و معرفی محیط‌هایی مانند Kligler و Triple Sugar Iron (TSI) agar، نیاز به محیطی ترکیبی برای ساده‌سازی آزمایش‌ها بیشتر احساس شد.

در دهه ۱۹۴۰، SIM medium به‌عنوان یک محیط کشت ترکیبی معرفی شد تا امکان بررسی همزمان سه ویژگی مهم باکتری‌های روده‌ای فراهم شود. از آن زمان تاکنون، شرکت‌های مختلف تولیدکننده محیط‌های کشت، فرمول استاندارد SIM را توسعه داده‌اند و این محیط در پروتکل‌های رسمی ASM و دیگر مراجع معتبر جایگاه ثابتی پیدا کرده است.

ترکیبات محیط کشت SIM و مواد تشکیل‌دهنده آن

ترکیبات SIM medium به گونه‌ای طراحی شده‌اند که هم نیازهای تغذیه‌ای باکتری‌ها را تأمین کنند و هم امکان مشاهده واکنش‌های بیوشیمیایی مورد نظر را فراهم سازند. به‌طور معمول، فرمول استاندارد شامل موارد زیر است:

• پپتون‌های پروتئینی (مانند پپتون کازئین و پپتون گوشت): منبع نیتروژن، اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و تریپتوفان مورد نیاز برای تولید ایندول.
• سدیم تیوسولفات (Sodium thiosulfate): سوبسترای لازم برای تولید H₂S توسط باکتری‌های دارای آنزیم‌های مرتبط.
• فروس آمونیوم سیترات یا فروس سولفات: منبع یون‌های آهن که با H₂S تولیدشده ترکیب شده و رسوب سیاه FeS ایجاد می‌کند.
• آگار با غلظت پایین (حدود ۰٫۳–۰٫۵ درصد): ایجاد ساختار نیمه‌جامد برای بررسی حرکت باکتری.
• عصاره مخمر (Yeast extract) (در برخی فرمول‌ها): منبع ویتامین‌های گروه B و عوامل رشد اضافی.
• آب مقطر: حلال ترکیبات تا حجم نهایی یک لیتر.
• pH نهایی: حدود ۷٫۳ (خنثی تا کمی قلیایی) برای رشد بهینه باکتری‌ها.

ممکن است بین تولیدکنندگان مختلف، مقادیر دقیق ترکیبات کمی متفاوت باشد، اما اصول کلی و مکانیسم عملکرد محیط ثابت است.

اصول کار محیط کشت SIM و مکانیسم‌های بیوشیمیایی

SIM medium بر اساس سه واکنش بیوشیمیایی اصلی طراحی شده است:

1. تولید سولفید هیدروژن (H₂S):
   برخی باکتری‌ها با استفاده از آنزیم‌های تیوناز و مرتبط، تیوسولفات را به H₂S تبدیل می‌کنند. گاز H₂S تولید شده با یون‌های آهن موجود در محیط واکنش داده و رسوب سیاه FeS ایجاد می‌کند که به‌عنوان نشانه H₂S مثبت در محیط دیده می‌شود.
2. تولید ایندول:
   باکتری‌های دارای آنزیم تریپتوفاناز، اسیدآمینه تریپتوفان را به ایندول، پیروات و آمونیاک تجزیه می‌کنند. پس از اضافه کردن معرف Kovac’s، ایندول با آن واکنش داده و حلقه قرمز رنگ در سطح محیط تشکیل می‌دهد که نشان‌دهنده ایندول مثبت است.
3. حرکت (Motility):
   به دلیل نیمه‌جامد بودن آگار، باکتری‌های متحرک می‌توانند از خط تلقیح در عمق محیط خارج شده و به صورت رشد ابری و پراکنده در تمام لوله دیده شوند. در مقابل، باکتری‌های غیرمتحرک فقط در مسیر خط تلقیح رشد می‌کنند.

این سه ویژگی در کنار هم به شناسایی و تمایز باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای کمک می‌کند و به‌ویژه در کنار سایر تست‌ها (مانند IMViC) بسیار ارزشمند است.

روش تهیه محیط کشت SIM گام‌به‌گام

برای تهیه SIM medium در آزمایشگاه مراحل زیر را دنبال کنید:

1. مواد لازم: مقدار مورد نیاز پپتون‌ها، تیوسولفات، نمک آهن، آگار و در صورت لزوم عصاره مخمر را مطابق دستورالعمل تولیدکننده وزن کنید.
2. حل‌کردن: مواد خشک را در حدود ۹۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و با حرارت ملایم هم بزنید تا کاملاً حل شوند (از جوشاندن طولانی پرهیز کنید).
3. تنظیم pH: pH محیط را در حدود ۷٫۳ تنظیم کنید (با استفاده از NaOH یا HCl رقیق).
4. تکمیل حجم: حجم محلول را با آب مقطر به ۱ لیتر برسانید.
5. استریلیزاسیون: محیط را در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه در اتوکلاو استریل کنید.
6. ریختن در لوله: محیط داغ را در لوله‌های استریل (deep tubes) تقسیم کنید و اجازه دهید تا در حالت عمودی سرد شده و نیمه‌جامد گردد.

در صورت استفاده از محیط آماده کارخانه‌ای، دستورالعمل درج‌شده روی ظروف تولیدکننده را دقیقاً دنبال کنید. محیط آماده را در یخچال نگهداری کنید و قبل از مصرف از شفافیت، نبود رسوب و عدم آلودگی آن مطمئن شوید.

کنترل کیفی محیط کشت SIM و استانداردهای آن

کنترل کیفی (QC) محیط کشت SIM برای اطمینان از عملکرد صحیح آن ضروری است. این کنترل معمولاً با استفاده از سویه‌های استاندارد مثبت و منفی برای هر یک از ویژگی‌های H₂S، ایندول و حرکت انجام می‌شود.

• برای H₂S: Salmonella typhimurium (مثبت، رسوب سیاه) و Escherichia coli (منفی، بدون رسوب).
• برای ایندول: E. coli (مثبت، حلقه قرمز با Kovac’s) و Klebsiella pneumoniae (منفی، بدون حلقه قرمز).
• برای حرکت: Proteus vulgaris (متحرک، رشد ابری و پراکنده) و Shigella flexneri (غیرمتحرک، رشد محدود به خط تلقیح).

اگر نتایج به‌دست‌آمده با الگوی مورد انتظار مطابقت نداشته باشد، لازم است علت مشکل بررسی و در صورت لزوم، محیط تهیه‌شده دور ریخته شود. علاوه‌براین، بررسی ظاهری محیط (شفافیت، pH مناسب و عدم آلودگی) قبل از مصرف ضروری است.

جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی میکروبیولوژی به
لینک زیر
مراجعه کنید:

کنترل کیفی میکروب‌شناسی: اصول، روش‌ها و استانداردهای عملکردی

روش انجام آزمایش با محیط کشت SIM

برای انجام تست با محیط کشت SIM مراحل زیر را انجام دهید:

1. تلقیح: با استفاده از سوزن تلقیح استریل، کلنی خالص باکتری را برداشته و آن را به‌صورت عمقی (حدود دو سوم عمق لوله) در مرکز محیط فرو کنید. از تلقیح سطحی خودداری کنید.
2. انکوباسیون: لوله را در دمای ۳۵–۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸–۲۴ ساعت (در صورت نیاز تا ۴۸ ساعت) انکوبه کنید.
3. افزودن معرف ایندول: پس از پایان انکوباسیون، ۳–۵ قطره معرف Kovac’s (یا در صورت استفاده، Ehrlich’s) را به سطح محیط اضافه کنید.
4. مشاهده: نتایج H₂S، حرکت و ایندول را بلافاصله پس از افزودن معرف بررسی و ثبت کنید.

تفسیر نتایج محیط کشت SIM و نشانه‌های مثبت/منفی

نتایج SIM medium معمولاً به صورت زیر تفسیر می‌شوند:

• تولید H₂S: تشکیل رسوب سیاه در طول خط تلقیح یا در کل محیط نشان‌دهنده H₂S مثبت است (مانند Salmonella). عدم رسوب سیاه نشانه H₂S منفی است (مانند E. coli).
• تولید ایندول: حلقه قرمز در سطح محیط پس از افزودن معرف Kovac’s، نشانه ایندول مثبت است (مانند E. coli). عدم ایجاد رنگ قرمز نشانه ایندول منفی است (مانند Klebsiella).
• حرکت: رشد ابری و پراکنده در سراسر محیط، نشانه مثبت بودن حرکت (مانند Proteus) و رشد محدود در خط تلقیح نشانه غیرمتحرک بودن باکتری (مانند Shigella) است.

جدول خلاصه نتایج SIM برای باکتری‌های رایج

توجه داشته باشید که زمان انکوباسیون، شرایط رشد و تعداد باکتری ممکن است روی شدت واکنش‌ها تأثیر بگذارد و باید در تفسیر نتایج لحاظ شود.

محدودیت‌ها و نکات احتیاطی در استفاده از محیط کشت SIM

• دامنه محدود باکتری‌ها: SIM medium عمدتاً برای باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای طراحی شده است و برای بسیاری از باکتری‌های گرم‌مثبت یا غیرروده‌ای مناسب نیست.
• احتمال نتایج کاذب: تلقیح نادرست، انکوباسیون طولانی‌مدت یا استفاده از معرف‌های نامناسب می‌تواند به نتایج کاذب منجر شود.
• حرکت ضعیف: در برخی باکتری‌ها حرکت ضعیف است و ممکن است نیاز به تأیید با روش‌های دیگر (مانند مشاهده میکروسکوپی) داشته باشد.
• ایمنی: هنگام کار با باکتری‌های پاتوژن، استفاده از تجهیزات حفاظت فردی (دستکش، گان، عینک) و رعایت اصول ایمنی زیستی ضروری است. پس از اتمام کار، محیط‌ها و مواد آلوده باید در اتوکلاو بی‌خطرسازی شوند.
• حفظ شرایط نگهداری: نگهداری محیط خارج از محدوده دمایی توصیه‌شده می‌تواند بر عملکرد آن تأثیر بگذارد.

کاربردهای محیط کشت SIM در میکروبیولوژی بالینی و صنعتی

• میکروبیولوژی بالینی: شناسایی و تمایز عاملین عفونت‌های روده‌ای مانند سالمونلوز و شیگلوز در نمونه‌های مدفوع و سایر نمونه‌های بالینی.
• کنترل کیفیت مواد غذایی: بررسی آلودگی مواد غذایی با باکتری‌های گرم‌منفی روده‌ای و پایش ایمنی غذا.
• مطالعات تحقیقاتی: تمایز سویه‌های مختلف در مطالعات ژنتیکی، اپیدمیولوژیک و ارزیابی حساسیت آنتی‌بیوتیکی.
• آموزش دانشگاهی: استفاده در آزمایشگاه‌های آموزشی برای آموزش مفاهیم H₂S، ایندول و حرکت به دانشجویان علوم آزمایشگاهی و میکروبیولوژی.

SIM medium معمولاً همراه با سایر تست‌ها مانند سیستم IMViC (Indole, Methyl red, Voges–Proskauer, Citrate) به‌عنوان بخشی از الگوریتم شناسایی Enterobacteriaceae به کار می‌رود.

نتیجه‌گیری درباره محیط کشت SIM

محیط کشت SIM یک ابزار قدرتمند، اقتصادی و چندمنظوره برای ارزیابی همزمان سه ویژگی کلیدی باکتری‌های روده‌ای (H₂S، ایندول و حرکت) است. شناخت دقیق ترکیبات، اصول کار، روش انجام آزمایش، تفسیر نتایج و کنترل کیفی این محیط، نقش مهمی در شناسایی صحیح و سریع باکتری‌ها در آزمایشگاه‌های بالینی، غذایی و تحقیقاتی دارد.

میکروبیولوژی علمی کاملاً تجربی است؛ توصیه می‌شود نتایج خود را ثبت و با الگوهای استاندارد مقایسه کنید تا با گذشت زمان، دقت شما در تفسیر محیط کشت SIM افزایش یابد.

سوالات رایج درباره محیط کشت SIM

محیط کشت SIM چیست؟

محیط کشت SIM یک محیط نیمه‌جامد است که برای تست همزمان تولید H₂S، ایندول و حرکت باکتری‌ها به‌کار می‌رود و عمدتاً برای شناسایی باکتری‌های روده‌ای (Enterobacteriaceae) طراحی شده است.

چگونه محیط کشت SIM را تهیه کنیم؟

با ترکیب پپتون‌ها، سدیم تیوسولفات، نمک آهن، مقدار کمی آگار و آب مقطر، تنظیم pH به حدود ۷٫۳، استریلیزاسیون در اتوکلاو و ریختن در لوله‌ها می‌توان محیط را تهیه کرد.

روش تلقیح در محیط کشت SIM چگونه است؟

با استفاده از سوزن تلقیح استریل، کلنی باکتری را برداشته و به‌صورت عمقی در مرکز لوله تا حدود دو سوم عمق محیط فرو کنید؛ از تلقیح سطحی خودداری شود.

زمان انکوباسیون محیط کشت SIM چقدر است؟

معمولاً ۱۸–۲۴ ساعت در دمای ۳۵–۳۷ درجه سانتی‌گراد کافی است، اما در صورت نیاز می‌توان انکوباسیون را تا ۴۸ ساعت نیز تمدید کرد.

چگونه تولید ایندول را در SIM تشخیص دهیم؟

پس از انکوباسیون، چند قطره معرف Kovac’s به سطح محیط اضافه می‌شود؛ تشکیل حلقه قرمز در سطح نشانه ایندول مثبت است.

رسوب سیاه در SIM به چه معناست؟

رسوب سیاه ناشی از تشکیل FeS است و نشان‌دهنده تولید H₂S مثبت توسط باکتری می‌باشد؛ این حالت در گونه‌هایی مانند Salmonella دیده می‌شود.

چرا حرکت در SIM مهم است؟

تست حرکت به تمایز باکتری‌های متحرک مانند Proteus از باکتری‌های غیرمتحرک مانند Shigella کمک می‌کند و بخشی از الگوریتم شناسایی باکتری‌هاست.

محدودیت‌های محیط کشت SIM چیست؟

این محیط برای باکتری‌های گرم‌مثبت و برخی باکتری‌های غیرروده‌ای مناسب نیست و در صورت تلقیح نادرست یا شرایط نامناسب انکوباسیون ممکن است نتایج کاذب ایجاد شود.

کاربردهای بالینی SIM medium چیست؟

از محیط SIM برای شناسایی و تمایز باکتری‌های روده‌ای عامل عفونت‌ها، به‌ویژه سالمونلوز و شیگلوز، در آزمایشگاه‌های بالینی استفاده می‌شود.

چگونه کنترل کیفی SIM را انجام دهیم؟

با تلقیح سویه‌های کنترل مثبت و منفی استاندارد برای H₂S، ایندول و حرکت (مانند E. coli، Salmonella، Proteus و Shigella) و مقایسه نتایج با الگوی مورد انتظار، کنترل کیفی انجام می‌شود.

آیا SIM برای باکتری‌های غیرروده‌ای قابل استفاده است؟

این محیط عمدتاً برای Enterobacteriaceae طراحی شده است و استفاده از آن برای باکتری‌های غیرروده‌ای ممکن است نتایج قابل اعتمادی ارائه نکند.

معرف جایگزین برای Kovac’s چیست؟

معرف Ehrlich’s می‌تواند به‌عنوان جایگزین برای تشخیص ایندول استفاده شود، اما Kovac’s معرف استاندارد و متداول‌تری در آزمایشگاه‌ها است.

چرا pH محیط SIM مهم است؟

pH حدود ۷٫۳ برای رشد بهینه باکتری‌ها و انجام صحیح واکنش‌های بیوشیمیایی ضروری است و انحراف از این محدوده می‌تواند روی نتایج تست اثر بگذارد.

مدت نگهداری محیط SIM چقدر است؟

در صورت نگهداری در یخچال و شرایط مناسب، می‌توان محیط SIM را برای چند هفته ذخیره کرد؛ با این حال، قبل از استفاده باید شفافیت، عدم رسوب و نبود آلودگی بررسی شود.