روش تهیه محلول بردفورد
روش تهیه محلول بردفورد به این شرح است۱۰۰ میلی‌گرم کوماسی بلو G-250 را در ۵۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵% حل کنید، سپس ۱۰۰ میلی‌لیتر اسید فسفریک ۸۵% اضافه کرده و با آب مقطر به ۱ لیتر برسانید. فیلتر کنید و در بطری تیره در ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
فهرست مطالب
مقدمه
محلول بردفورد (Bradford reagent) یک معرف شیمیایی است که برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها در نمونه‌های بیولوژیکی استفاده می‌شود. این روش توسط ماریون ام. بردفورد در سال ۱۹۷۶ توسعه یافت و بر پایه اتصال رنگ کوماسی بریلیانت بلو G-250 به اسیدهای آمینه خاص مانند آرژنین، هیستیدین و فنیل‌آلانین در پروتئین‌ها عمل می‌کند. این اتصال باعث تغییر رنگ محلول از قهوه‌ای به آبی می‌شود و جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر را افزایش می‌دهد. روش بردفورد سریع، حساس و ساده است و برای غلظت‌های پروتئین بین ۱ تا ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر مناسب است. با این حال، مواد تداخلی مانند دترجنت‌ها (مانند SDS) می‌توانند نتایج را تحت تأثیر قرار دهند. در این مقاله روش تهیه محلول بردفورد را می آموزید.
اصل کار
در محیط اسیدی، رنگ کوماسی به پروتئین‌ها متصل می‌شود و کمپلکس پروتئین-رنگ تشکیل می‌دهد. این کمپلکس جذب نور در ۵۹۵ نانومتر را نشان می‌دهد که با غلظت پروتئین متناسب است. منحنی استاندارد معمولاً با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) تهیه می‌شود.
مواد لازم (برای تهیه ۱ لیتر محلول)
- ۱۰۰ میلی‌گرم کوماسی بریلیانت بلو G-250 (Coomassie Brilliant Blue G-250)
- ۵۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵٪ (اتانول مطلق رقیق‌شده)
- ۱۰۰ میلی‌لیتر اسید فسفریک ۸۵٪ (وزنی/وزنی)
- آب مقطر تا حجم نهایی ۱ لیتر
نکته: مواد باید با کیفیت آزمایشگاهی باشند. کوماسی بلو را از منابع معتبر تهیه کنید.
روش تهیه گام به گام
- حل کردن رنگ: ۱۰۰ میلی‌گرم کوماسی بریلیانت بلو G-250 را در ۵۰ میلی‌لیتر اتانول ۹۵٪ بریزید. مخلوط را به آرامی هم بزنید تا رنگ کاملاً حل شود. این مرحله ممکن است چند ساعت طول بکشد؛ می‌توانید از همزن مغناطیسی استفاده کنید. اگر رنگ حل نشد، کمی حرارت ملایم (زیر ۴۰ درجه سانتی‌گراد) اعمال کنید.
- افزودن اسید: به آرامی ۱۰۰ میلی‌لیتر اسید فسفریک ۸۵٪ را به مخلوط اضافه کنید. مخلوط را به خوبی هم بزنید. این مرحله گرما تولید می‌کند، بنابراین از دستکش و عینک ایمنی استفاده کنید.
- رقیق‌سازی: حجم مخلوط را با افزودن آب مقطر به ۱ لیتر برسانید. دوباره هم بزنید تا یکنواخت شود.
- فیلتراسیون: اگر ذرات معلق یا رسوب مشاهده شد، محلول را از کاغذ صافی واتمن شماره ۱ یا فیلتر ۰.۴۵ میکرومتری عبور دهید تا شفاف شود.
- ذخیره‌سازی: محلول را در بطری شیشه‌ای تیره‌رنگ بریزید و در یخچال (۴ درجه سانتی‌گراد) نگهداری کنید. عمر مفید محلول حدود ۶ ماه است، اما قبل از استفاده بررسی کنید که رسوب نداشته باشد.
روش تهیه محلول بردفورد
احتیاط‌ها و نکات ایمنی درباره روش تهیه محلول بردفورد
- اسید فسفریک خورنده است؛ در محیط تهویه‌دار کار کنید و از تجهیزات حفاظتی (دستکش، عینک، روپوش آزمایشگاهی) استفاده کنید.
- اتانول قابل اشتعال است؛ دور از شعله نگه دارید.
- محلول نهایی اسیدی است (pH حدود ۱) و ممکن است پوست را تحریک کند.
- اگر محلول تجاری استفاده می‌کنید، دستورالعمل سازنده را دنبال کنید.
- برای دقت بیشتر، از دستگاه اسپکتروفتومتر کالیبره‌شده استفاده کنید.
نحوه استفاده از محلول بردفورد
- استانداردهای پروتئین (مانند BSA در غلظت‌های ۰ تا ۱ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) تهیه کنید.
- ۵ میلی‌لیتر محلول بردفورد را به ۱۰۰ میکرولیتر نمونه اضافه کنید.
- ۵-۱۰ دقیقه در دمای اتاق نگه دارید.
- جذب در ۵۹۵ نانومتر را اندازه‌گیری کنید.
- غلظت را از منحنی استاندارد محاسبه کنید.
این روش در آزمایشگاه‌های بیوشیمی، بیولوژی مولکولی و تحقیقات پروتئومیکس کاربرد گسترده‌ای دارد. برای نسخه‌های بهبودیافته (مانند روش اصلاح‌شده برای دترجنت‌ها)، به منابع تخصصی مراجعه کنید.
سوالات رایج درباره روش تهیه محلول بردفورد
۱. محلول بردفورد چیست؟
محلول بردفورد یک معرف برای اندازه‌گیری پروتئین بر پایه رنگ کوماسی بلو است.
۲. چرا از کوماسی بریلیانت بلو G-250 استفاده می‌شود؟
این رنگ به پروتئین‌ها متصل شده و تغییر رنگ ایجاد می‌کند که قابل اندازه‌گیری است.
۳. مواد لازم برای تهیه محلول بردفورد چیست؟
۱۰۰ мг کوماسی، ۵۰ мл اتانول ۹۵%، ۱۰۰ мл اسید فسفریک ۸۵% و آب مقطر.
۴. مراحل اصلی روش تهیه محلول بردفورد کدامند؟
حل رنگ در اتانول، افزودن اسید، رقیق‌سازی، فیلتر و ذخیره.
۵. عمر مفید محلول بردفورد چقدر است؟
حدود ۶ ماه در یخچال اگر رسوب نداشته باشد.
۶. مواد تداخلی در روش بردفورد کدامند؟
دترجنت‌ها مانند SDS نتایج را مختل می‌کنند.
۷. طول موج جذب در روش بردفورد چند است؟
۵۹۵ نانومتر.
۸. استاندارد معمول برای منحنی در روش بردفورد چیست؟
آلبومین سرم گاوی (BSA).
۹. نکات ایمنی در تهیه محلول بردفورد چیست؟
استفاده از دستکش، عینک و کار در هود به دلیل اسید و اتانول.
۱۰. آیا می‌توان محلول بردفورد را تجاری خرید؟
بله، اما تهیه دستی ارزان‌تر و قابل کنترل است.
منابع معتبر برای مطالعه بیشتر روش تهیه محلول بردفورد
- Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254. (مقاله اصلی)
- Sigma-Aldrich Protocol: Bradford Reagent Preparation and Assay. (راهنمای تجاری معتبر)