روش انجام آزمایش 2ME
آزمایش 2ME برای تشخیص بروسلوز، IgM را با 2-مرکاپتواتانول غیرفعال می‌کند تا IgG اندازه‌گیری شود. روش انجام آزمایش 2ME به شرح زیر است: رقیق‌سازی سریالی سرم با 2ME (1:20 تا 1:2560)، افزودن آنتی‌ژن بروسلا، انکوباسیون در 37 درجه به مدت 18-24 ساعت، سانتریفیوژ و خوانش آگلوتیناسیون. تیتر ≥1:160 مثبت است.
جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education
فهرست مطالب
مقدمه
آزمایش 2ME (که مخفف 2-Mercaptoethanol Test است) یک آزمون سرولوژیک مهم در تشخیص بیماری بروسلوز یا تب مالت است. این بیماری یک عفونت باکتریایی ناشی از باکتری‌های جنس بروسلا (Brucella) است که معمولاً از طریق مصرف محصولات لبنی غیرپاستوریزه یا تماس با حیوانات آلوده منتقل می‌شود. آزمایش 2ME برای تمایز بین آنتی‌بادی‌های IgM (که در مراحل حاد عفونت تولید می‌شوند) و IgG (که در مراحل مزمن غالب هستند) طراحی شده است.
در این آزمایش، از ماده 2-مرکاپتواتانول استفاده می‌شود که پیوندهای دی‌سولفیدی در مولکول‌های IgM را می‌شکند و باعث می‌شود این آنتی‌بادی‌ها غیرفعال شوند. در نتیجه، اگر آگلوتیناسیون (تجمع ذرات) مشاهده شود، نشان‌دهنده حضور IgG است که مقاوم به 2ME هستند. این تمایز بسیار مهم است زیرا IgM معمولاً در عفونت‌های حاد ظاهر می‌شود و IgG در عفونت‌های مزمن یا بهبودیافته باقی می‌ماند.
روش انجام آزمایش 2ME
این مقاله به صورت جامع و با توضیحات مفصل، مراحل انجام آزمایش 2ME را توصیف می‌کند. توجه کنید که این آزمایش باید در آزمایشگاه‌های مجهز و توسط پرسنل آموزش‌دیده انجام شود، زیرا شامل مواد شیمیایی سمی است و نیاز به دقت بالا دارد. همچنین، نتایج باید با سایر تست‌ها مانند آزمایش رایت استاندارد، ELISA یا کشت باکتریایی تأیید شود. برای اطلاعات بیشتر در مورد آزمایش رایت لوله‌ای، به لینک زیر مراجعه کنید.
heamostica.com/روش-انجام-آزمایش-رایت-لوله-ای
اهمیت آزمایش 2ME
قبل از ورود به روش انجام، بیایید به اهمیت این آزمایش بپردازیم. بروسلوز یک بیماری زئونوز (مشترک بین انسان و حیوان) است که علائمی مانند تب، تعریق شبانه، درد مفاصل و خستگی ایجاد می‌کند. تشخیص زودرس آن حیاتی است زیرا درمان با آنتی‌بیوتیک‌ها (مانند داکسی‌سیکلین و ریفامپین) می‌تواند عوارض را کاهش دهد. آزمایش 2ME حساسیت بالایی (حدود 80-90%) در تشخیص عفونت حاد دارد و می‌تواند عفونت‌های کاذب مثبت ناشی از واکسیناسیون یا عفونت‌های متقاطع (مانند یرسینیا یا ویبریو) را کاهش دهد.
در مقایسه با آزمایش رایت استاندارد (که هر دو IgM و IgG را تشخیص می‌دهد)، آزمایش 2ME تیتر IgG را اندازه‌گیری می‌کند. اگر تیتر در حضور 2ME کاهش یابد، نشان‌دهنده غالب بودن IgM و عفونت حاد است. این آزمایش معمولاً پس از مثبت شدن آزمایش رایت درخواست می‌شود. برای مقایسه با تست کومبس رایت، به این لینک مراجعه کنید.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
برای انجام آزمایش 2ME، مواد و تجهیزات زیر ضروری هستند. توضیح هر کدام برای درک بهتر فرآیند آورده شده است:
- سرم نمونه بیمار: سرم خون که از خون کامل (معمولاً 5-10 میلی‌لیتر) پس از انعقاد و سانتریفیوژ (3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه) به دست می‌آید. سرم باید شفاف و بدون همولیز باشد تا نتایج دقیق باشد. اگر همولیز رخ دهد، می‌تواند باعث نتایج کاذب شود.
- آنتی‌ژن بروسلا: آنتی‌ژن استاندارد بروسلا (معمولاً Brucella abortus) که به صورت تجاری موجود است. این آنتی‌ژن باید در غلظت 1:100 رقیق شود. آنتی‌ژن باید تازه و عاری از آلودگی باشد؛ در غیر این صورت، آگلوتیناسیون خودبه‌خودی رخ می‌دهد.
- محلول 2-مرکاپتواتانول (2ME): غلظت 0.05 مولار در بافر فسفات سالین (PBS) با pH 7.2. این ماده شیمیایی پیوندهای دی‌سولفیدی را می‌شکند و IgM را غیرفعال می‌کند. باید تازه تهیه شود زیرا در معرض هوا اکسید می‌شود و کارایی‌اش کاهش می‌یابد. 2ME سمی است و باید با احتیاط扱 شود (استفاده از دستکش و تهویه مناسب).
- بافر PBS (Phosphate Buffered Saline): با pH 7.2 برای رقیق‌سازی‌ها. این بافر محیط خنثی فراهم می‌کند تا واکنش‌های بیولوژیکی به درستی انجام شود.
- کنترل‌های مثبت و منفی: سرم کنترل مثبت (با تیتر شناخته‌شده، مثلاً 1:160) برای تأیید واکنش و سرم منفی برای بررسی عدم واکنش. این کنترل‌ها برای اعتبارسنجی آزمایش ضروری هستند.
- تجهیزات آزمایشگاهی:
– لوله‌های شیشه‌ای یا پلاستیکی (10×75 میلی‌متر) برای رقیق‌سازی.
– پیپت‌های دقیق (میکروپیپت) برای اندازه‌گیری حجم‌های کوچک (0.1-1 میلی‌لیتر).
– انکوباتور یا حمام آب در 37 درجه سانتی‌گراد برای شبیه‌سازی دمای بدن.
– سانتریفیوژ برای جداسازی رسوبات.
– ورتکس میکسر برای مخلوط کردن یکنواخت.
– تجهیزات ایمنی: دستکش، عینک، و ماسک برای جلوگیری از تماس با 2ME.
روش انجام آزمایش 2ME (گام به گام)
آزمایش 2ME بر پایه روش آگلوتیناسیون لوله‌ای (Tube Agglutination) انجام می‌شود که مشابه آزمایش رایت است، اما با اضافه کردن 2ME. فرآیند به صورت تیتراسیون سریالی است تا تیتر (بالاترین رقیق‌سازی با واکنش مثبت) تعیین شود. کل زمان حدود 2-4 ساعت است.
مرحله 1: آماده‌سازی نمونه و رقیق‌سازی‌ها در روش انجام آزمایش 2ME
– سرم بیمار را در دمای اتاق گرم کنید (اگر فریز شده باشد).
– 8-10 لوله را برچسب‌گذاری کنید برای رقیق‌سازی‌های
– در لوله اول 0.9 میلی لیتر بافر 2ME و به سایر لوله ها 0.5 میلی‌لیتر بافر 2ME اضافه کنید.
– در لوله اول، 0.1 میلی‌لیتر سرم اضافه کنید (رقیق‌سازی اولیه 1:10 با 2ME). این مرحله کلیدی است زیرا 2ME بلافاصله شروع به شکستن IgM می‌کند.
– 0.5 میلی‌لیتر از لوله اول به لوله دوم منتقل کنید و ورتکس کنید (رقیق‌سازی 1:20).
– این فرآیند را تا لوله آخر تکرار کنید و در آخر، 0.5 میلی‌لیتر از لوله نهایی را دور بریزید تا حجم یکسان باشد.
– به لوله آخر به عنوان کنترل منفی فقط 0.5 میلی‌لیتر بافر 2ME اضافه کنید.
توضیح: رقیق‌سازی سریالی اجازه می‌دهد تیتر دقیق تعیین شود. غلظت 2ME باید ثابت باشد تا IgM کاملاً غیرفعال شود.
مرحله 2: اضافه کردن آنتی‌ژن در روش انجام آزمایش 2ME
– به همه ی لوله ها، 0.5 میلی‌لیتر آنتی‌ژن بروسلا (رقیق‌شده) اضافه کنید.
– لوله‌ها را دوباره ورتکس کنید تا مخلوط یکنواخت شود.
– یک لوله کنترل مثبت تهیه کنید.
توضیح: آنتی‌ژن ذرات باکتریایی کشته‌شده است که اگر آنتی‌بادی وجود داشته باشد، به آن متصل شده و تجمع ایجاد می‌کند.
مرحله 3: انکوباسیون در روش انجام آزمایش 2ME
– لوله‌ها را در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48-24 ساعت قرار دهید.
توضیح: انکوباسیون زمان لازم برای واکنش آنتی‌بادی-آنتی‌ژن فراهم می‌کند. دمای 37 درجه شبیه دمای بدن است و واکنش را تسریع می‌کند.
مرحله 4: سانتریفیوژ و خوانش نتایج در روش انجام آزمایش 2ME
– لوله‌ها را سانتریفیوژ کنید (1000-2000 دور در دقیقه به مدت 5-10 دقیقه) تا رسوبات ته‌نشین شوند.
– لوله‌ها را به آرامی تکان دهید و زیر نور (یا با آینه) مشاهده کنید.
– درجه‌بندی آگلوتیناسیون:
– 4+: تجمع کامل (رسوب متراکم).
– 3+: 75% تجمع.
– 2+: 50% تجمع (تیتر مثبت در نظر گرفته می‌شود).
– 1+: 25% تجمع (مشکوک).
– 0: بدون تجمع (منفی).
– تیتر = بالاترین رقیق‌سازی با حداقل 2+ آگلوتیناسیون.
توضیح: خوانش ماکروسکوپیک است، اما برای دقت، می‌توان از میکروسکوپ استفاده کرد. کنترل منفی باید شفاف باشد.
تفسیر نتایج
– تیتر ≥1:160: مثبت قوی، نشان‌دهنده عفونت فعال (معمولاً IgG غالب).
– تیتر 1:80-1:160: مثبت، نیاز به پیگیری.
– تیتر 1:40: مشکوک، تکرار آزمایش.
– تیتر <1:40: منفی.
توضیح مفصل: در عفونت حاد، تیتر 2ME پایین‌تر از رایت است (به دلیل حذف IgM). در مزمن، تیترها مشابه هستند. عوامل تداخلی: بارداری، آرتریت روماتوئید یا عفونت‌های دیگر می‌توانند نتایج کاذب ایجاد کنند.
نکات ایمنی و محدودیت‌ها
– 2ME سمی است؛ از استنشاق اجتناب کنید و در هود کار کنید.
– آزمایش را دو بار تکرار کنید برای دقت.
– محدودیت‌ها: حساسیت پایین در مراحل اولیه (قبل از تولید آنتی‌بادی) یا در افراد immunocompromised.
– نگهداری: سرم را در -20 درجه نگه دارید.
نتیجه‌گیری
آزمایش 2ME ابزاری ارزشمند برای تشخیص دقیق بروسلوز است. با پیروی از این روش، می‌توان نتایج قابل اعتمادی به دست آورد. برای تشخیص نهایی، همیشه با پزشک مشورت کنید. اگر نیاز به جزئیات بیشتر دارید، به منابع استاندارد مانند CLSI مراجعه کنید.
سوالات رایج در مورد روش انجام آزمایش 2ME
1. آزمایش 2ME چیست؟
آزمایش 2ME یک تست سرولوژیک برای تشخیص بروسلوز است که IgM را غیرفعال می‌کند تا IgG را اندازه‌گیری کند.
2. تفاوت آزمایش 2ME و رایت چیست؟
رایت هر دو IgM و IgG را تشخیص می‌دهد، اما 2ME فقط IgG را اندازه‌گیری می‌کند.
3. چه زمانی آزمایش 2ME انجام می‌شود؟
معمولاً پس از مثبت شدن تست رایت برای تمایز عفونت حاد و مزمن.
4. مواد لازم برای آزمایش 2ME چیست؟
سرم بیمار، آنتی‌ژن بروسلا، 2ME، PBS، و تجهیزات مانند لوله و سانتریفیوژ.
5. تیتر مثبت در 2ME چقدر است؟
تیتر ≥1:160 نشان‌دهنده عفونت فعال است.
6. آیا 2ME سمی است؟
بله، باید با احتیاط و تجهیزات ایمنی استفاده شود.
7. محدودیت‌های آزمایش 2ME چیست؟
حساسیت پایین در مراحل اولیه عفونت یا افراد با سیستم ایمنی ضعیف.
8. چگونه نتایج 2ME تفسیر می‌شود؟
بر اساس درجه آگلوتیناسیون و تیتر رقیق‌سازی.
9. آیا آزمایش 2ME نیاز به انکوباسیون دارد؟
بله، معمولاً 18-24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد.
10. کنترل‌های آزمایش 2ME چیست؟
کنترل مثبت و منفی برای اعتبارسنجی نتایج.
منابع معتبر برای مطالعه بیشتر
“`