اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی با روش سیانو مت هموگلوبین، استاندارد طلایی برای تعیین غلظت هموگلوبین در خون است. این تکنیک دستی شامل مخلوط کردن خون با محلول درابکین (حاوی پتاسیم فری‌سیانید و سیانید) برای تبدیل هموگلوبین به سیانومتهموگلوبین پایدار، انکوباسیون، و اندازه‌گیری جذب نوری در 540 نانومتر با اسپکتروفتومتر می‌شود. نتایج دقیق برای تشخیص کم‌خونی و نظارت بالینی ارائه می‌دهد.

1. اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی: هدف و دامنه کاربرد

این SOP روش استاندارد برای تعیین غلظت هموگلوبین در خون کامل با استفاده از روش سیانو مت هموگلوبین را توصیف می‌کند. این روش برای آزمایشگاه‌های بالینی، تحقیقات و نظارت بر کم‌خونی مناسب است و به عنوان روش مرجع توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) شناخته شده است.

2.  اصول روش سیانو مت هموگلوبین

خون با محلولی حاوی پتاسیم فری‌سیانید و پتاسیم سیانید (معروف به محلول درابکین) مخلوط می‌شود. پتاسیم فری‌سیانید، آهن هموگلوبین را اکسید کرده و به متهموگلوبین تبدیل می‌کند. سپس پتاسیم سیانید با متهموگلوبین واکنش داده و سیانو مت هموگلوبین پایدار تشکیل می‌دهد. جذب نوری این ترکیب در طول موج 540 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شده و با استاندارد مقایسه می‌شود. این روش تمام اشکال هموگلوبین به جز سولفهموگلوبین را اندازه‌گیری می‌کند.

3. اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی: مواد و تجهیزات مورد نیاز

مواد:

– محلول درابکین (حاوی 200 میلی‌گرم پتاسیم فری‌سیانید، 50 میلی‌گرم پتاسیم سیانید، 1 گرم بی‌کربنات سدیم در 1 لیتر آب مقطر؛ pH باید 8.6-9.6 باشد).
– استانداردهای هموگلوبین کالیبره‌شده (غلظت‌های شناخته‌شده مانند 5، 10، 15 g/dL).
– کنترل‌های کیفیت (سطوح نرمال و غیرنرمال).
– خون کامل ضد انعقاد شده با EDTA (تازه، حداکثر 24 ساعت نگهداری در یخچال 2-8 درجه سانتی‌گراد).

تجهیزات:

– پیپت‌های دقیق (میکروپیپت 20 میکرولیتر و پیپت 5 میلی‌لیتر).
– لوله‌های آزمایش شیشه‌ای یا پلاستیکی شفاف (ظرفیت حداقل 10 میلی‌لیتر).
– اسپکتروفتومتر کالیبره‌شده با طول موج 540 نانومتر (با کووت‌های 1 سانتی‌متر).
– ورتکس میکسر یا شیکر برای مخلوط کردن.
– تایمر یا ساعت.
– تجهیزات حفاظت فردی (دستکش، عینک ایمنی، روپوش آزمایشگاهی).
– هود بخار برای کار با مواد سمی.

4. اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی: روش انجام

این بخش به صورت آموزشی و گام‌به‌گام توضیح داده شده است تا کاربر بتواند آن را به راحتی اجرا کند. قبل از شروع، مطمئن شوید تمام تجهیزات کالیبره و تمیز هستند. همیشه در هود بخار کار کنید و از تماس مستقیم با سیانید اجتناب کنید.

4.1. آماده‌سازی نمونه و تجهیزات

– خون بیمار را از ورید جمع‌آوری کنید و در لوله EDTA بریزید. نمونه را به آرامی مخلوط کنید (حداقل 8-10 بار invert) بدون ایجاد کف یا همولیز.
– اگر نمونه تازه نیست، آن را از یخچال خارج کرده و به دمای اتاق (20-25 درجه سانتی‌گراد) برسانید.
– اسپکتروفتومتر را روشن کنید و حداقل 15 دقیقه گرم کنید. طول موج را روی 540 نانومتر تنظیم کنید و با آب مقطر چک کنید که جذب صفر باشد.
– لوله‌های آزمایش را تمیز و خشک کنید. هرگونه آلودگی می‌تواند نتایج را مختل کند.
– استانداردها و کنترل‌ها را از فریزر یا یخچال خارج کرده و به دمای اتاق برسانید. قبل از استفاده، آن‌ها را مخلوط کنید.

4.2. برچسب‌گذاری و اضافه کردن معرف

– لوله‌ها را برچسب‌گذاری کنید: بلانک (فقط معرف)، استاندارد کم (مثلاً 5 g/dL)، استاندارد نرمال (10 g/dL)، استاندارد بالا (15 g/dL)، کنترل نرمال، کنترل بالا، و لوله‌های نمونه بیمار (یکی برای هر بیمار).
– با استفاده از پیپت 5 میلی‌لیتر، دقیقاً 5 میلی‌لیتر محلول درابکین را به هر لوله اضافه کنید. پیپت را عمودی نگه دارید و نوک آن را به دیواره لوله تماس ندهید تا آلودگی جلوگیری شود. اگر حباب ایجاد شد، آن را با ضربه ملایم به لوله خارج کنید.
– لوله بلانک را کنار بگذارید (هیچ نمونه‌ای اضافه نکنید؛ این برای صفر کردن دستگاه است).

4.3. اضافه کردن نمونه

– با میکروپیپت 20 میکرولیتر، دقیقاً 20 میکرولیتر از خون بیمار، استاندارد یا کنترل را بردارید. نوک پیپت را تمیز نگه دارید و نمونه را به آرامی به مرکز معرف اضافه کنید تا پخش شود.
– برای خون بیمار: ابتدا نمونه را به خوبی مخلوط کنید (ورتکس 10 ثانیه در سرعت متوسط). اگر نمونه کدورت دارد (مانند لیپمیک یا ایکتریک)، ممکن است نیاز به رقیق‌سازی اضافی یا روش جایگزین باشد.
– پس از اضافه کردن، لوله را با پارافیلم یا درپوش بپوشانید و به آرامی invert کنید (5-10 بار) یا روی ورتکس میکسر قرار دهید (5 ثانیه در سرعت پایین) تا مخلوط یکنواخت شود. اجتناب از ایجاد کف زیاد کنید، زیرا می‌تواند جذب را تحت تأثیر قرار دهد.

4.4. انکوباسیون

– تمام لوله‌ها را در دمای اتاق (20-25 درجه سانتی‌گراد) به مدت حداقل 10 دقیقه (حداکثر 30 دقیقه) انکوبه کنید. این زمان برای تکمیل واکنش اکسیداسیون و تشکیل سیانومتهموگلوبین لازم است.
– در این مدت، لوله‌ها را در رک قرار دهید و از نور مستقیم خورشید دور نگه دارید، زیرا می‌تواند ترکیب را ناپایدار کند.
– پس از انکوباسیون، چک کنید که溶液 شفاف و بدون کدورت باشد. رنگ باید قرمز-قهوه‌ای یکنواخت باشد. اگر کدورت وجود دارد، لوله را سانتریفیوژ کنید (1000 g برای 5 دقیقه) و supernatant را استفاده کنید.

4.5. اندازه‌گیری جذب نوری

– اسپکتروفتومتر را با لوله بلانک صفر کنید: لوله بلانک را در جایگاه کووت قرار دهید، درب دستگاه را ببندید و دکمه zero یا blank را فشار دهید تا جذب صفر نشان دهد.
– سپس، هر لوله را یکی یکی اندازه‌گیری کنید: لوله را تمیز کنید (با دستمال بدون پرز)، در جایگاه قرار دهید، درب را ببندید و جذب (A) را بخوانید. بین هر اندازه‌گیری، کووت را با آب مقطر شستشو دهید و خشک کنید.
– مقادیر جذب را یادداشت کنید. برای استانداردهای چندگانه، منحنی کالیبراسیون رسم کنید (جذب در مقابل غلظت).

4.6. تکرار و چک

– اگر نتایج مشکوک است (مثلاً جذب خارج از محدوده خطی 0.1-0.8)، نمونه را رقیق کنید (مثلاً 1:2 با معرف) و دوباره اندازه‌گیری کنید، سپس نتیجه را ضرب در فاکتور رقیق‌سازی کنید.
– کل فرآیند برای هر سری باید کمتر از 1 ساعت طول بکشد تا پایداری حفظ شود.

5. اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی: محاسبات

غلظت هموگلوبین (g/dL) = (A نمونه / A استاندارد) × غلظت استاندارد × فاکتور رقیق‌سازی (معمولاً 251 برای رقت 1:251).
یا از معادله خطی منحنی استاندارد استفاده کنید: y = mx + c، جایی که y جذب و x غلظت است. نرم‌افزار اسپکتروفتومتر ممکن است این را اتوماتیک محاسبه کند.

6. کنترل کیفیت

– استانداردهای سه سطحی را در هر سری اجرا کنید و منحنی را چک کنید (R² > 0.995).
– کنترل‌ها باید در محدوده ±2 SD از مقدار هدف باشند.
– ثبت روزانه نتایج کنترل در چارت Levey-Jennings.
– اگر خارج از محدوده، تجهیزات را چک کنید (کالیبراسیون، معرف تازه) و سری را تکرار کنید.

جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی هماتولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی هماتولوژی (Levey-Jennings + قوانین Westgard): راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

7. مزایا و محدودیت‌ها

مزایا:

– دقت بالا (CV < 2%) و استاندارد جهانی.
– اندازه‌گیری تمام هموگلوبین‌ها جز سولفهموگلوبین.

محدودیت‌ها:

– زمان انکوباسیون لازم.
– سمیت سیانید (نیاز به احتیاط).
– تداخل با کدورت (لیپمی، ایکتر).
– نیاز به تجهیزات گران.

8.  ایمنی و احتیاط‌ها

– همیشه دستکش نیتریل، عینک و روپوش بپوشید.
– در هود بخار با تهویه خوب کار کنید؛ سیانید سمی است و می‌تواند گاز HCN تولید کند.
– در صورت تماس با پوست، فوراً با آب فراوان بشویید و به پزشک مراجعه کنید.
– معرف را در بطری‌های تیره نگهداری کنید و تاریخ انقضا چک کنید.
– زباله‌ها را به عنوان مواد خطرناک دفع کنید (طبق مقررات محلی).

9. مقادیر نرمال

– زنان: 12-16 g/dL
– مردان: 14-18 g/dL
– کودکان: 11-16 g/dL (بسته به سن)
– نوزادان: 14-20 g/dL
توجه: مقادیر ممکن است بر اساس جمعیت متفاوت باشد؛ از رفرنس محلی استفاده کنید.

10. عیب‌یابی

– جذب پایین: نمونه کم یا معرف فاسد.
– جذب بالا: کدورت یا همولیز؛ سانتریفیوژ کنید.
– منحنی غیرخطی: استانداردها را چک کنید یا دستگاه را کالیبره کنید.
– نتایج ناسازگار: پیپت‌ها را چک کنید (دقت ±1%).

سوالات رایج

1. روش سیانومتهموگلوبین چیست؟

روش سیانومتهموگلوبین استاندارد مرجع برای اندازه‌گیری غلظت هموگلوبین در خون است که از تبدیل هموگلوبین به سیانومتهموگلوبین پایدار و اندازه‌گیری جذب نوری آن استفاده می‌کند.

2. اصل کار روش سیانومتهموگلوبین چگونه است؟

خون با محلول درابکین مخلوط می‌شود، پتاسیم فری‌سیانید هموگلوبین را به متهموگلوبین تبدیل می‌کند و سیانید آن را به سیانومتهموگلوبین تبدیل می‌نماید، سپس جذب در 540 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود.

3. مزایای روش سیانومتهموگلوبین چیست؟

دقت بالا، پایداری ترکیب، و شناخت بین‌المللی به عنوان روش استاندارد توسط WHO.

4. محدودیت‌های روش سیانومتهموگلوبین کدامند؟

زمان‌بر بودن، سمیت سیانید، نیاز به تجهیزات دقیق، و تداخل با کدورت نمونه.

5. چگونه روش سیانومتهموگلوبین را انجام دهیم؟

نمونه خون را با محلول درابکین رقیق کنید، انکوبه کنید، و جذب نوری را با اسپکتروفتومتر بخوانید و با استاندارد مقایسه کنید.

6. احتیاط‌های ایمنی در روش سیانومتهموگلوبین چیست؟

استفاده از تجهیزات حفاظتی، کار در هود بخار، اجتناب از تماس با پوست، و دفع مناسب زباله‌های خطرناک.

7. مقادیر نرمال هموگلوبین چقدر است؟

برای مردان 14-18 g/dL، زنان 12-16 g/dL، کودکان 11-16 g/dL، و نوزادان 14-20 g/dL.

8. مشکلات رایج در روش سیانومتهموگلوبین چیست؟

جذب پایین به دلیل معرف فاسد، جذب بالا به دلیل کدورت، منحنی غیرخطی، و نتایج ناسازگار به دلیل پیپت نادرست.

9. روش سیانومتهموگلوبین با روش‌های دیگر مقایسه شود؟

دقیق‌تر از روش‌های دستی مانند ساهلی، اما زمان‌برتر و نیاز به تجهیزات بیشتر نسبت به دستگاه‌های اتوماتیک.

10. چرا روش سیانومتهموگلوبین استاندارد است؟

به دلیل دقت بالا، قابلیت اندازه‌گیری تمام اشکال هموگلوبین (جز سولفهموگلوبین)، و توصیه توسط سازمان‌های بین‌المللی مانند WHO.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر در مورد اندازه گیری هموگلوبین به روش دستی

• What is the cyanmethemoglobin method for measuring hemoglobin – The Blood Project
• Hemoglobin Determination – ScienceDirect
• Systematic review on haemoglobin assessment – WHO
• Methods and analyzers for hemoglobin measurement – PMC
• Hemoglobin estimation by the HemoCue – PMC
• Cyanmethemoglobin Method For The Estimation Of Hemoglobin – Laboratory Tests