محیط کشت BHI: راهنمای جامع محیط کشت Brain Heart Infusion

محیط کشت BHI یا Brain Heart Infusion یک محیط غنی برای رشد باکتری‌ها و قارچ‌هاست. روش  تهیه ی محیط کشت BHI به این شرح است که: 37-52 گرم پودر را در آب حل کنید، بجوشانید یا حرارت دهید، اتوکلاو کنید و خنک نمایید. برای کنترل کیفی، pH را چک کنید و با سویه‌های استاندارد تست نمایید تا رشد مناسب تایید شود.

فهرست مطالب محیط کشت BHI

• مقدمه به محیط کشت BHI و تاریخچه Brain Heart Infusion
• کاربردهای محیط کشت BHI در میکروبیولوژی و کشت باکتری
• ترکیبات محیط کشت BHI و مواد مغذی Brain Heart Infusion
• روش تهیه محیط کشت BHI براث و آگار Brain Heart Infusion
• کنترل کیفی محیط کشت BHI و تست عملکرد Brain Heart Infusion
• مزایا و محدودیت‌های محیط کشت BHI در آزمایشگاه

مقدمه به محیط کشت BHI و تاریخچه Brain Heart Infusion

محیط کشت Brain Heart Infusion (BHI) یک محیط غنی و همه‌منظوره است که برای کشت و جداسازی انواع میکروارگانیسم‌ها، از جمله باکتری‌های فستیدیوس (دشواررشد) مانند استرپتوکوک‌ها، نایسریاها، هموفیلوس‌ها، و همچنین باکتری‌های غیرفستیدیوس، مخمرها، قارچ‌ها و حتی آناروب‌ها طراحی شده است. این محیط اولین بار در سال 1919 توسط Rosenow معرفی شد، که قطعات بافت مغز را به براث دکستروز اضافه کرد تا رشد استرپتوکوک‌ها را بهبود بخشد. بعداً در سال 1923، Hayden فرمول را اصلاح کرد و با افزودن مرمر خردشده، رشد پاتوژن‌های دندانی را تسهیل نمود. فرمول مدرن BHI از اینفیوژن‌های خشک مغز گوساله و قلب گاو به جای بافت تازه مغز استفاده می‌کند و از دی‌سدیم فسفات به عنوان بافر بهره می‌برد تا محیط شفاف‌تر و با ارزش غذایی معادل ایجاد شود. BHI در دو فرم اصلی موجود است: براث (مایع) و آگار (جامد)، که هر کدام کاربردهای خاصی دارند. این محیط به دلیل محتوای غنی از پروتئین‌ها، پپتون‌ها، ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه و عوامل رشد، یکی از پرکاربردترین محیط‌ها در میکروبیولوژی بالینی، تحقیقاتی و صنعتی است. pH نهایی آن معمولاً 7.4 ± 0.2 در 25°C است که برای رشد اکثر میکروارگانیسم‌ها مناسب می‌باشد. BHI تجاری توسط شرکت‌هایی مانند HiMedia، Sigma-Aldrich، Thermo Fisher، Hardy Diagnostics و BD تولید می‌شود و معادل‌های آماده‌ای مانند Difco یا BBL دارد.

در تحقیقات مدرن، BHI برای مطالعات ژنتیکی، تست‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی و حتی کشت باکتری‌های لاکتیک اسید (مانند لاکتوباسیلوس) بهینه‌سازی شده است، هرچند برای برخی باکتری‌ها نیاز به بهبود فرمول دارد. این محیط غیرانتخابی است، یعنی رشد انواع میکروارگانیسم‌ها را حمایت می‌کند، اما می‌توان آن را با افزودنی‌هایی مانند خون، آنتی‌بیوتیک‌ها یا ویتامین‌ها انتخابی یا غنی کرد.

محیط کشت BHI

کاربردهای محیط کشت BHI در میکروبیولوژی و کشت باکتری فستیدیوس Brain Heart Infusion

BHI به عنوان یک محیط همه‌منظوره، کاربردهای گسترده‌ای در میکروبیولوژی دارد. فرم براث (مایع) عمدتاً برای کشت‌های مایع، تهیه اینوکولوم (تلقیح اولیه) و تست‌های بیوشیمیایی استفاده می‌شود، در حالی که فرم آگار (جامد) برای جداسازی کلنی‌ها و شمارش مناسب‌تر است. کاربردهای اصلی عبارتند از:

– **کشت باکتری‌های فستیدیوس:** مانند Streptococcus pneumoniae، Neisseria meningitidis، Haemophilus influenzae، و Listeria monocytogenes. BHI رشد لوکسوریانت (پررشد) این ارگانیسم‌ها را فراهم می‌کند، زیرا حاوی عوامل رشد ضروری مانند همین و ویتامین K است (در نسخه‌های غنی‌شده).

– **کشت آناروب‌ها و میکروآئروفیل‌ها:** با افزودن 0.1% آگار یا همین و ویتامین K، برای باکتری‌های آناروبیک مانند Clostridium spp. یا Bacteroides spp. مناسب می‌شود. این افزودنی‌ها اکسیژن را کاهش می‌دهند و رشد را تسهیل می‌کنند.

– **کشت قارچ‌ها و مخمرها:** BHI با 10% خون گوسفند defibrinated برای جداسازی Histoplasma capsulatum، Trichophyton mentagrophytes و سایر قارچ‌های پاتوژن سیستمیک استفاده می‌شود. در فرم آگار، برای مایکوزهای سیستمیک و Actinomycetales ایده‌آل است.

– **کشت خون و نمونه‌های بالینی:** در بالینی، BHI براث برای کشت خون (blood culture) و مایعات بدن مانند CSF (مایع مغزی نخاعی) به کار می‌رود، زیرا رشد سریع پاتوژن‌ها را حمایت می‌کند. برای Vibrio spp. هالوفیلیک، NaCl اضافی (2-3%) اضافه می‌شود.

– **تهیه اینوکولوم برای تست‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی:** BHI براث برای تهیه سوسپانسیون باکتریایی در تست‌های MIC (حداقل غلظت مهاری) و دیسک دیفیوژن استفاده می‌شود، زیرا رشد یکنواخت فراهم می‌کند.

– **کاربردهای تحقیقاتی و صنعتی:** برای شمارش و کشت باکتری‌های لاکتیک اسید، تولید اینوکولوم در بیوتکنولوژی، و مطالعات متابولیکی. در نسخه‌های انتخابی با آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند کلرامفنیکل یا جنتامیسین، برای جداسازی قارچ‌های پاتوژن از نمونه‌های آلوده مناسب است.

تفاوت broth و agar: براث برای رشد حجمی و تست‌های مایع مناسب است (مانند رشد منحنی)، در حالی که آگار برای جداسازی کلنی‌ها و مشاهده مورفولوژی (مانند کلنی‌های خاکستری-سبز S. pneumoniae) استفاده می‌شود. مزایای براث: رشد سریع‌تر و آسان‌تر نمونه‌برداری؛ محدودیت‌ها: کنترل اسمیر سخت‌تر. آگار: محیط کنترل‌شده برای شمارش، اما تهیه سریالی زمان‌بر.

ترکیبات محیط کشت BHI و مواد تشکیل دهنده Brain Heart Infusion

ترکیبات BHI بسته به تولیدکننده کمی متفاوت است، اما پایه آن اینفیوژن‌های مغز و قلب برای تأمین مواد مغذی است. مقادیر بر حسب گرم در لیتر (g/L) آورده شده‌اند.

– **برای BHI براث (مایع):**
– اینفیوژن مغز گوساله (Calf brain infusion): 200 g
– اینفیوژن قلب گاو (Beef heart infusion): 250 g
– پروتئوز پپتون (Proteose peptone): 10 g
– دکستروز (Dextrose/Glucose): 2 g
– سدیم کلرید (NaCl): 5 g
– دی‌سدیم هیدروژن فسفات (Na₂HPO₄): 2.5 g
– آب مقطر: تا 1 لیتر
– مقدار کل پودر خشک: حدود 37-38.75 g/L
– نسخه‌های جایگزین (مانند Hardy): Pancreatic digest of casein 14.5 g، Brain heart infusion solids 10 g، Peptic digest of animal tissue 5 g، NaCl 5 g، Na₂HPO₄ 2.5 g، Dextrose 2 g.

– **برای BHI آگار (جامد):**
– ترکیبات مشابه براث + آگار: 15 g
– HM infusion powder: 12.5 g
– BHI powder: 5 g
– Proteose peptone: 10 g
– Dextrose: 2 g
– NaCl: 5 g
– Na₂HPO₄: 2.5 g
– مقدار کل پودر خشک: حدود 52 g/L
– افزودنی‌های اختیاری: 5-10% خون گوسفند defibrinated برای رشد قارچ‌ها، یا 20 واحد پنی‌سیلین + 40 µg استرپتومایسین برای انتخابی قارچی.

این ترکیبات کربن، نیتروژن، ویتامین‌ها و عوامل رشد را فراهم می‌کنند. دکستروز منبع انرژی، پپتون‌ها منبع اسیدهای آمینه، و فسفات بافر pH است. برای نسخه‌های خاص مانند BHI با Fildes (برای H. influenzae) یا با همین و ویتامین K (برای آناروب‌ها)، افزودنی‌های اضافی لازم است.

روش تهیه محیط کشت BHI براث و آگار Brain Heart Infusion

تهیه BHI ساده است اما نیاز به دقت برای جلوگیری از آلودگی دارد. همیشه از آب مقطر یا دیونیزه استفاده کنید و تجهیزات را استریل نگه دارید.

– **تهیه BHI براث:**
1. 37-38.75 گرم پودر خشک را در 1 لیتر آب مقطر معلق کنید (برای Hardy: 38.75 g).
2. اگر لازم، حرارت ملایم دهید تا کامل حل شود (جوش نیاورید مگر برای حل کامل).
3. در لوله‌ها یا بطری‌ها تقسیم کنید (برای کشت خون، 5-10 ml در لوله).
4. در اتوکلاو 121°C به مدت 15 دقیقه استریل کنید (فشار 15 lbs).
5. خنک کنید تا 45-50°C، سپس افزودنی‌های حساس به حرارت (مانند خون یا آنتی‌بیوتیک) اضافه کنید.
6. برچسب بزنید با تاریخ تهیه، شماره بچ و شرایط ذخیره.

– **تهیه BHI آگار:**
1. 52 گرم پودر را در 1 لیتر آب معلق کنید.
2. به جوش آورید تا آگار کامل حل شود (حرارت مداوم با هم‌زدن).
3. در بطری‌ها تقسیم کنید و در اتوکلاو 121°C به مدت 15 دقیقه استریل کنید.
4. خنک کنید تا 45-50°C، افزودنی‌ها (مانند 5-10% خون) اضافه کنید.
5. در پلیت‌های استریل بریزید (15-20 ml در هر پلیت 90 mm) و اجازه دهید سفت شود.
6. برای استفاده از Vibrio، NaCl اضافی اضافه کنید.

نکات ایمنی: از دستکش و ماسک استفاده کنید، زیرا پودر ممکن است آلرژی‌زا باشد. محیط آماده را در تاریکی و زیر 20°C ذخیره کنید. برای کشت، نمونه را با لوپ استریل تلقیح کنید، در 35-37°C (برای باکتری‌ها) یا 25-30°C (برای قارچ‌ها) انکوبه کنید، با رطوبت افزایش‌یافته برای قارچ‌ها.

کنترل کیفی محیط کشت BHI و تست عملکرد Brain Heart Infusion

کنترل کیفی (QC) برای اطمینان از عملکرد محیط ضروری است و بر اساس استانداردهایی مانند CLSI M22-A3 انجام می‌شود. هر بچ باید تست شود.

– **بررسی فیزیکی:** محیط براث باید شفاف و کهربایی‌رنگ باشد؛ آگار سفت و بدون حباب. pH نهایی: 7.4 ± 0.2 در 25°C (اگر خارج از محدوده، پس از 24 ساعت دوباره چک کنید).

– **تست استریلیتی:** بخشی از محیط را بدون تلقیح انکوبه کنید؛ نباید رشدی باشد (24-48 ساعت در 35°C).

– **تست عملکرد با ارگانیسم‌های استاندارد (ATCC):**
– Escherichia coli ATCC 25922: رشد خوب، کدری براث پس از 24-48 ساعت در 35°C هوازی.
– Staphylococcus aureus ATCC 25923: رشد خوب، کدری براث.
– Streptococcus pneumoniae ATCC 6305: رشد لوکسوریانت، کلنی‌های خاکستری-سبز در آگار.
– Neisseria meningitidis ATCC 13090: رشد خوب، کلنی‌های خاکستری-قهوه‌ای.
– Candida albicans ATCC 10231: رشد لوکسوریانت.
– برای آگار: شمارش کلنی‌ها و مورفولوژی بررسی شود (مانند رشد خوب Listeria monocytogenes ATCC 19111).

– **ذخیره و انقضا:** پودر خشک در 2-30°C، دور از نور و رطوبت؛ محیط آماده در 2-8°C تا تاریخ انقضا. اگر تغییر رنگ یا رسوب دیدید، دور بریزید.

– **تفسیر نتایج:** در براث، کدری نشان‌دهنده رشد است؛ در آگار، کلنی‌های ایزوله بررسی شوند. برای شناسایی کامل، تست‌های بیوشیمیایی، میکروسکوپی یا سرولوژیکی لازم است.

جهت مطالعه ی جامع در مورد کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی: راهنمای آموزشی کامل برای کارشناسان آزمایشگاه

همچنین

جهت مطالعه ی جامع در زمینه ی کنترل کیفی میکروبیولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:

مزایا و محدودیت‌های محیط کشت BHI در آزمایشگاه میکروبیولوژی Brain Heart Infusion

**مزایا:**
– غنی و versatile، حمایت از رشد گسترده میکروارگانیسم‌ها.
– آسان تهیه و ذخیره.
– قابل اصلاح برای کاربردهای خاص (مانند افزودن خون برای قارچ‌ها).
– دقت بالا در تست‌های MIC نسبت به روش‌های دیگر.

**محدودیت‌ها:**
– غیرانتخابی، بنابراین در نمونه‌های آلوده، فلورای نرمال ممکن است رشد بیش از حد کند.
– برخی سویه‌ها رشد ضعیف دارند؛ نیاز به انکوباسیون طولانی برای قارچ‌ها.
– زمان‌بر برای تهیه سریالی در تست‌های رقت.
– برای شناسایی کامل، تست‌های اضافی لازم است.

سوالات رایج

1. محیط کشت BHI چیست؟

محیط کشت BHI یا Brain Heart Infusion یک محیط غنی برای رشد باکتری‌ها، قارچ‌ها و مخمرها است که از اینفیوژن مغز و قلب حیوانات ساخته می‌شود.

2. تاریخچه محیط کشت BHI چگونه است؟

این محیط در سال 1919 توسط Rosenow معرفی شد و در 1923 توسط Hayden اصلاح گردید برای بهبود رشد باکتری‌های فستیدیوس.

3. کاربرد اصلی BHI در آزمایشگاه چیست؟

برای کشت باکتری‌های فستیدیوس مانند استرپتوکوک و نایسریا، کشت خون، و تهیه اینوکولوم در تست‌های آنتی‌بیوتیکی استفاده می‌شود.

4. ترکیبات BHI براث شامل چه مواردی است؟

اینفیوژن مغز گوساله 200g/L، قلب گاو 250g/L، پروتئوز پپتون 10g/L، دکستروز 2g/L، NaCl 5g/L، Na₂HPO₄ 2.5g/L.

5. چگونه BHI آگار تهیه می‌شود؟

52g پودر در 1L آب حل کنید، بجوشانید، اتوکلاو کنید، خنک نمایید و در پلیت‌ها بریزید.

6. pH مناسب برای BHI چقدر است؟

pH نهایی 7.4 ± 0.2 در 25°C برای رشد بهینه میکروارگانیسم‌ها.

7. چگونه کنترل کیفی BHI انجام می‌شود؟

با بررسی فیزیکی، تست استریلیتی و تست رشد با سویه‌های استاندارد مانند E. coli ATCC 25922.

8. مزایای BHI چیست؟

غنی، versatile، آسان تهیه و قابل اصلاح برای کاربردهای خاص مانند افزودن خون.

9. محدودیت‌های BHI کدامند؟

غیرانتخابی بودن که ممکن است رشد فلورای نرمال را افزایش دهد و نیاز به تست‌های اضافی برای شناسایی.

10. BHI برای چه میکروارگانیسم‌هایی مناسب است؟

باکتری‌های فستیدیوس، آناروب‌ها، قارچ‌ها و مخمرها مانند Streptococcus و Candida.

11. چگونه BHI را ذخیره کنیم؟

پودر خشک در 2-30°C دور از نور، محیط آماده در 2-8°C تا انقضا.

12. تفاوت BHI براث و آگار چیست؟

براث برای رشد مایع و تست‌های بیوشیمیایی، آگار برای جداسازی کلنی‌ها و شمارش.