روش انجام آزمایش فاویسم: راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

روش انجام آزمایش فاویسم

روش انجام آزمایش فاویسم برای تشخیص کمبود آنزیم G6PD  شامل روش‌های کیفی مانند تست نقطه فلورسانس و روش رنگ سنجی و روش های کمی می‌شود. این آزمایش‌ها فعالیت آنزیم را ارزیابی کرده و افراد پرخطر را شناسایی می‌کنند تا از همولیز ناشی از عوامل اکسیدان مانند باقلا یا داروها جلوگیری شود. با غربالگری سریع، می‌توان عوارض را کاهش داد و سلامت عمومی را بهبود بخشید.

جهت عضویت در کانال آموزشی در تلگرام به لینک زیر مراجعه کنید:
https://t.me/hematology_education

🚀عضویت در کانال تلگرام

فهرست مطالب

مقدمه: اهمیت روش انجام آزمایش فاویسم در تشخیص کمبود آنزیم G6PD

کمبود آنزیم گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز (G6PD)، که به عنوان فاویسم شناخته می‌شود، یکی از شایع‌ترین اختلالات ژنتیکی ارثی در جهان است. این کمبود باعث می‌شود گلبول‌های قرمز خون نسبت به عوامل اکسیدان مانند برخی داروها (مثل پریماکین برای مالاریا)، عفونت‌های ویروسی یا باکتریایی، و حتی مصرف مواد غذایی مانند باقلا حساس شوند و منجر به همولیز (تخریب گلبول‌های قرمز) شود. علائم می‌تواند شامل کم‌خونی همولیتیک، زردی، خستگی، درد شکمی و ادرار تیره باشد. روش انجام آزمایش فاویسم برای تشخیص زودهنگام این کمبود حیاتی است، به ویژه در جمعیت‌های پرخطر مانند افراد مدیترانه‌ای، آفریقایی و آسیایی، جایی که شیوع آن تا ۲۰-۳۰% می‌رسد. این آزمایش‌ها می‌توانند کیفی (برای غربالگری سریع و ارزان) یا کمی (برای اندازه‌گیری دقیق فعالیت آنزیم) باشند. در این مقاله، تمرکز بر دو روش کیفی استاندارد است: تست نقطه فلورسانس (Fluorescent Spot Test یا FST) و روش رنگ سنجی (Colorimetric Method). این روش‌ها بر اساس اصول بیوشیمیایی عمل می‌کنند و برای غربالگری انبوه در مراکز بهداشتی، بیمارستان‌ها و حتی مناطق روستایی مناسب هستند. روش انجام آزمایش فاویسم نه تنها به جلوگیری از عوارض کمک می‌کند، بلکه در برنامه‌های غربالگری نوزادان برای جلوگیری از کرنیکتروس (آسیب مغزی ناشی از زردی شدید) نقش کلیدی دارد. توجه: نتایج آزمایش ممکن است تحت تأثیر عوامل خارجی مانند عفونت اخیر یا انتقال خون قرار گیرد، بنابراین زمان‌بندی مناسب ضروری است.

روش انجام آزمایش فاویسم

بخش ۱: تست نقطه فلورسانس (FST) – جزئیات روش انجام آزمایش فاویسم به صورت کیفی

اهداف روش انجام آزمایش فاویسم با FST

روش انجام آزمایش فاویسم با استفاده از FST یک رویکرد غربالگری کیفی سریع است که برای شناسایی کمبود آنزیم G6PD در خون طراحی شده است. اصل علمی این روش بر پایه واکنش آنزیمی است: آنزیم G6PD، گلوکز-6-فسفات را اکسید کرده و NADPH تولید می‌کند. NADPH زیر نور فرابنفش (UV) با طول موج ۳۶۵ نانومتر، فلورسانس (درخشش) سبز روشن ایجاد می‌کند. این تست افراد با فعالیت آنزیم کمتر از ۳۰% سطح طبیعی را به طور مؤثر تشخیص می‌دهد و برای غربالگری سریع در محیط‌های آزمایشگاهی استاندارد یا حتی میدانی (مانند کمپ‌های بهداشتی) ایده‌آل است. هدف اصلی، شناسایی سریع موارد کمبود برای ارجاع به آزمایش‌های کمی دقیق‌تر است.

محدوده کاربرد روش انجام آزمایش فاویسم با FST

این روش برای نمونه‌های خون کامل انسانی، گرفته‌شده از ورید، مویرگ یا حتی خون بند ناف نوزادان، با مواد ضد انعقاد مانند EDTA (اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید) یا ACD (اسید سیتریک-دکستروز) قابل استفاده است. محدوده کاربرد شامل غربالگری نوزادان در روزهای اول تولد، بزرگسالان در مناطق مالاریایی قبل از تجویز داروهای اکسیدان، و جمعیت‌های پرخطر ژنتیکی می‌شود. این روش فقط جنبه غربالگری دارد و برای اندازه‌گیری کمی فعالیت آنزیم (مانند واحدهای U/g Hb) مناسب نیست. در موارد خاص مانند بیماران با هموگلوبینوپاتی (مانند تالاسمی) یا عفونت‌های اخیر، نتایج ممکن است نیاز به تفسیر دقیق‌تر داشته باشد.

وظایف و مسئولیت‌ها در اجرای روش انجام آزمایش فاویسم

– مدیر آزمایشگاه: مسئولیت نظارت کلی بر اجرای پروتکل، اطمینان از کنترل کیفیت، نگهداری و کالیبراسیون تجهیزات، بررسی تاریخ مصرف مواد، و آموزش مداوم پرسنل برای جلوگیری از خطاهای انسانی.

– کارشناس یا تکنسین آزمایشگاه: انجام گام‌به‌گام مراحل تست، ثبت دقیق نتایج در سیستم‌های دیجیتال یا دستی، تفسیر اولیه نتایج، و گزارش هرگونه ناهنجاری یا مشکل فنی به مدیر.

– همه پرسنل درگیر: رعایت دقیق پروتکل‌های ایمنی زیستی طبق استانداردهای OSHA (مانند جلوگیری از آلودگی خونی)، استفاده اجباری از تجهیزات حفاظت فردی (PPE) شامل دستکش نیتریل، عینک ایمنی، ماسک و لباس آزمایشگاهی یک‌بارمصرف، و مدیریت صحیح زباله‌های بیولوژیکی از طریق اتوکلاو یا سوزاندن برای جلوگیری از انتقال عفونت‌هایی مانند هپاتیت یا HIV.

مواد، تجهیزات و معرف‌ها مورد نیاز برای روش انجام آزمایش فاویسم با FST

– معرف‌ها: کیت استاندارد FST (مانند کیت‌های تجاری Trinity Biotech یا مشابه، شامل سوبسترای G6PD حاوی گلوکز-6-فسفات، NADP و بافر TRIZMA با pH مناسب برای پایداری واکنش).

– کنترل‌های کیفیت: نمونه‌های کنترل عادی (با فعالیت بالای ۳۰%)، متوسط (۳۰-۸۰%) و کمبود (کمتر از ۳۰%) – می‌توان از کیت‌های آماده یا خون‌های تاییدشده آزمایشگاهی استفاده کرد.

– تجهیزات: کاغذ فیلتر جذب‌کننده مانند Whatman No. 1 برای نقطه‌گذاری، پیپت‌های دقیق میکرولیتری (۱۰ و ۲۰۰ μL) برای اندازه‌گیری دقیق حجم‌ها، لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۱.۵ میلی‌لیتری (مانند اپندورف)، انکوباتور یا وان آب گرم با کنترل دما روی ۳۷ درجه سانتی‌گراد (برای شبیه‌سازی شرایط بدن)، زمان‌سنج دیجیتال دقیق، کابینت یا دستگاه بررسی فلورسانس با نور UV بلندموج (۳۶۵ نانومتر، مانند مدل‌های Spectroline)، و یخچال آزمایشگاهی برای نگهداری نمونه‌ها و معرف‌ها در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد.

– نکته نگهداری: تمام معرف‌ها باید در شرایط تاریک و سرد نگه داشته شوند تا از تخریب آنزیم‌ها جلوگیری شود. همیشه تاریخ انقضا و شرایط ذخیره‌سازی را قبل از استفاده بررسی کنید تا نتایج کاذب جلوگیری شود.

مراحل دقیق روش انجام آزمایش فاویسم با FST (گام‌به‌گام با توضیحات کامل)

روش انجام آزمایش فاویسم با FST معمولاً ۳۰ تا ۴۵ دقیقه زمان می‌برد و باید در محیطی با دمای کنترل‌شده (۲۰-۲۵ درجه سانتی‌گراد) و نور کم اجرا شود تا فلورسانس تحت تأثیر قرار نگیرد:

۱. آماده‌سازی نمونه و کنترل‌ها: نمونه خون کامل تازه (ترجیحاً کمتر از ۷۲ ساعت از زمان خون‌گیری، نگهداری در یخچال) را دریافت و بررسی کنید. چک کنید که نمونه بدون لخته، همولیز قابل مشاهده (که می‌تواند NADPH طبیعی را آزاد کند و نتیجه کاذب بدهد)، یا برچسب ناقص باشد. اگر نمونه نامناسب، آن را رد کرده و نمونه جدیدی درخواست کنید. کنترل‌ها را با حجم مشخص آب مقطر استریل (معمولاً ۰.۵ میلی‌لیتر) احیا کنید، به آرامی با پیپت مخلوط کنید (از ورتکس شدید خودداری کنید تا آنزیم آسیب نبیند)، و از نظر شفافیت و عدم رسوب بصری بررسی کنید.

۲. عملیات مقدماتی: دستورالعمل دقیق کیت را مطالعه کنید تا از نسبت‌های صحیح اطمینان حاصل شود. انکوباتور را حداقل ۳۰ دقیقه قبل روی ۳۷ درجه سانتی‌گراد گرم کنید تا دما پایدار بماند (نوسان دما می‌تواند واکنش را مختل کند). سوبسترای G6PD را با بافر TRIZMA (معمولاً ۲ میلی‌لیتر) مخلوط کنید؛ به آرامی بچرخانید و چند بار وارونه کنید تا کاملاً حل شود، اما از ایجاد حباب هوا جلوگیری کنید زیرا می‌تواند اکسیداسیون ناخواسته ایجاد کند. کاغذ فیلتر را به قطعات مناسب (۵x۵ سانتی‌متر) برش دهید و روی سطح تمیز و خشک قرار دهید تا آلودگی جلوگیری شود.

۳. اجرای تست اصلی: در یک لوله تمیز، ۱۰ میکرولیتر از خون نمونه یا کنترل را با پیپت دقیق بردارید و به ۲۰۰ میکرولیتر سوبسترای آماده‌شده اضافه کنید. بلافاصله با پیپتینگ ملایم (بالا و پایین کردن آرام) مخلوط کنید تا یکنواخت شود، اما از لرزش شدید اجتناب کنید تا آنزیم دناتوره نشود. سپس، ۱۰ میکرولیتر از این مخلوط را روی کاغذ فیلتر نقطه‌گذاری کنید – این نقطه به عنوان “زمان صفر” عمل می‌کند و برای مقایسه پایه‌ای با نقطه پس از انکوباسیون استفاده می‌شود. لوله را در انکوباتور قرار دهید و برای ۱۰-۱۵ دقیقه (بسته به کیت، معمولاً ۱۰ دقیقه) نگه دارید تا واکنش آنزیمی کامل شود. پس از خارج کردن لوله، ۱۰ میکرولیتر دیگر از مخلوط را کنار نقطه اول نقطه‌گذاری کنید. این مراحل را همزمان برای تمام کنترل‌ها (عادی، متوسط، کمبود) تکرار کنید تا مقایسه مستقیم و دقیق ممکن باشد و خطاهای سیستمیک کاهش یابد.

۴. خشک کردن و مشاهده فلورسانس: کاغذ فیلتر را در دمای اتاق و دور از نور مستقیم خورشید یا منابع حرارتی برای ۵-۱۰ دقیقه خشک کنید تا رطوبت کاملاً تبخیر شود (رطوبت می‌تواند فلورسانس را کاهش دهد). سپس، کاغذ خشک‌شده را در کابینت فلورسانس زیر نور UV بلندموج در محیط کاملاً تاریک قرار دهید. فلورسانس را بلافاصله بررسی کنید، زیرا با گذشت زمان ممکن است کمرنگ شود. در نمونه‌های با فعالیت طبیعی، NADPH تولیدشده باعث فلورسانس سبز روشن و پایدار می‌شود، در حالی که کمبود باعث عدم یا ضعف فلورسانس است.

کنترل کیفیت در روش انجام آزمایش فاویسم با FST

برای اطمینان از دقت، هر سری تست (batch) باید شامل اجرای همزمان کنترل‌های عادی، متوسط و کمبود باشد. نتایج مورد انتظار: کنترل عادی فلورسانس قوی و یکنواخت نشان دهد، کنترل متوسط فلورسانس متوسط و کنترل کمبود فلورسانس ضعیف یا отсут. تمام نتایج را در لاگ آزمایشگاه ثبت کنید، شامل تاریخ، نام اپراتور، شماره سریال کیت، دمای انکوباتور و نتایج بصری. اگر کنترل‌ها با انتظارات مطابقت نداشته باشند، تست را تکرار کنید یا عوامل مانند تاریخ انقضای کیت، دمای انکوباتور یا کیفیت نور UV را بررسی و کالیبره کنید. ضریب تغییرات (CV) بین سری‌ها باید کمتر از ۱۰% باشد. نگهداری منظم تجهیزات (مانند کالیبراسیون انکوباتور هر ۶ ماه) برای دقت ضروری است.

جهت مطالعه جامع در مورد کنترل کیفی هماتولوژی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی هماتولوژی (Levey-Jennings + قوانین Westgard): راهنمای جامع برای کارشناسان آزمایشگاه

تفسیر نتایج روش انجام آزمایش فاویسم با FST

– فعالیت طبیعی (Normal, بیش از ۳۰% فعالیت استاندارد): فلورسانس سبز روشن و قوی، مشابه کنترل عادی، نشان‌دهنده عدم کمبود.

– فعالیت متوسط (Intermediate, ۳۰-۸۰% فعالیت): فلورسانس ضعیف‌تر از طبیعی اما قابل مشاهده، اغلب در زنان هتروزیگوت (حامل ژن) دیده می‌شود و نیاز به پیگیری دارد.

– کمبود شدید (Deficient, کمتر از ۳۰% فعالیت): فلورسانس ضعیف، کمرنگ یا کاملاً absent، مشابه کنترل کمبود، که نشان‌دهنده ریسک بالای همولیز است.

نکته مهم: حساسیت تست برای تشخیص هتروزیگوت‌ها محدود است (حدود ۷۰-۸۰%) و نتایج کاذب طبیعی ممکن است در شرایطی مانند کم‌خونی شدید، کمبود آهن، عفونت‌های اخیر، بارداری یا پس از انتقال خون رخ دهد، زیرا گلبول‌های جوان‌تر فعالیت بالاتری دارند. در موارد مبهم یا نتایج متوسط، روش‌های کمی مانند اسپکتروفوتومتری برای اندازه‌گیری دقیق فعالیت آنزیم (با واحد U/g Hb) توصیه می‌شود.

مشکلات احتمالی و عیب‌یابی در روش انجام آزمایش فاویسم با FST

– عدم فلورسانس در کنترل عادی: ممکن است به دلیل کیت تاریخ‌گذشته، نگهداری نامناسب (مانند قرار گرفتن در گرما یا نور) یا دمای انکوباتور پایین‌تر از ۳۷ درجه باشد. راه‌حل: تاریخ کیت را چک کنید، دما را با ترمومتر مستقل اندازه‌گیری کنید و تست را با کیت جدید تکرار نمایید.

– فلورسانس ضعیف یا ناهمگن در همه نمونه‌ها: نمونه خون قدیمی (بیش از یک هفته)، دمای اتاق بالا (بیش از ۳۰ درجه سانتی‌گراد) یا باتری ضعیف لامپ UV. راه‌حل: از نمونه‌های تازه استفاده کنید، محیط را خنک نگه دارید و تجهیزات را کالیبره یا باتری را تعویض کنید.

– نتایج کاذب مثبت یا منفی: در همولیز حاد، نوزادان با سطوح بالای بیلی‌روبین یا بیماران با لکوسیتوز (افزایش گلبول سفید)، تست را حداقل ۲-۴ هفته پس از بهبودی تکرار کنید.

– مسائل ایمنی: همه نمونه‌های خون را به عنوان بالقوه عفونی در نظر بگیرید. از تماس مستقیم با پوست یا چشم اجتناب کنید و زباله‌ها را طبق پروتکل‌های بیولوژیکی (مانند اتوکلاو در ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد برای ۱۵ دقیقه یا سوزاندن) دفع نمایید. در صورت نشت، محل را با هیپوکلریت سدیم ۱۰% ضدعفونی کنید.

توصیه‌های کلی و نکات کاربردی در روش انجام آزمایش فاویسم با FST

– زمان کل فرآیند: حدود ۳۰-۴۵ دقیقه، که آن را برای غربالگری انبوه (مانند در برنامه‌های ملی نوزادان) بسیار کارآمد می‌کند.

– مزایا: ساده و کاربرپسند (نیاز به آموزش کم)، هزینه پایین (کمتر از ۵ دلار به ازای هر تست)، نیاز به تجهیزات minimal (فقط UV و انکوباتور پایه)، و قابل حمل برای مناطق دورافتاده بدون برق پایدار (با استفاده از انکوباتورهای باتری‌دار).

– معایب: طبیعت کیفی و وابستگی به تفسیر بصری (که می‌تواند субъектив باشد)، نیاز به زنجیره سرد برای نگهداری معرف‌ها (۲-۸ درجه)، و حساسیت پایین‌تر برای موارد متوسط کمبود.

– کاربردهای بالینی: غربالگری روتین نوزادان برای جلوگیری از زردی شدید و آسیب مغزی، ارزیابی قبل از درمان مالاریا ویواکس با داروهای اکسیدان، و بررسی خانوادگی در افراد با سابقه فاویسم. آموزش پرسنل برای تشخیص دقیق فلورسانس (مانند استفاده از عکس‌های مرجع) ضروری است تا خطای انسانی کاهش یابد.

بخش ۲: روش رنگ سنجی (Colorimetric Method) – جزئیات روش انجام آزمایش فاویسم به صورت کیفی

اهداف روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

روش انجام آزمایش فاویسم با رویکرد رنگ سنجی یک غربالگری کیفی است که کمبود G6PD را بر اساس سرعت تغییر رنگ تشخیص می‌دهد. اصل بیوشیمیایی: آنزیم G6PD، گلوکز-6-فسفات را به 6-فسفوگلوکونات تبدیل کرده و NADPH تولید می‌کند. NADPH رنگ آبی را احیا کرده و به فرم بی‌رنگ یا زرد-قرمز تبدیل می‌کند. در نمونه‌های طبیعی، تغییر رنگ سریع (در عرض چند دقیقه) رخ می‌دهد، در حالی که در کمبود، تغییر کند یا absent است. این روش برای شناسایی موارد کمبود کامل یا شدید طراحی شده و در تنظیمات آزمایشگاهی با منابع محدود مفید است.

محدوده کاربرد روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

این روش برای خون کامل تازه انسانی (از ورید، مویرگ یا کف پا در نوزادان) با ضد انعقاد EDTA یا هپارین قابل است. نمونه باید تازه (کمتر از ۲۴ ساعت ایده‌آل) یا حداکثر ۳ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود تا فعالیت آنزیم حفظ شود. محدوده شامل غربالگری آزمایشگاهی، جمعیت‌های پرخطر ژنتیکی و برنامه‌های مالاریا است. نه برای نمونه‌های منجمد (که آنزیم را غیرفعال می‌کند) یا همولیز شده (که NADPH آزاد می‌کند). در موارد آنمی شدید، تنظیم غلظت نمونه ضروری است.

وظایف و مسئولیت‌ها در اجرای روش انجام آزمایش فاویسم

– مدیر آزمایشگاه: نظارت بر پروتکل، کنترل کیفیت، نگهداری معرف‌ها در شرایط تاریک و سرد (برای جلوگیری از اکسیداسیون رنگ)، و آموزش پرسنل در مورد زمان‌بندی دقیق.

– تکنسین: اجرای تست با دقت زمانی، ثبت نتایج در لاگ دیجیتال، و گزارش مشکلات مانند تغییر رنگ نامشخص.

– همه پرسنل: استفاده از PPE کامل، رعایت ایمنی زیستی، و دفع ایمن زباله‌ها برای جلوگیری از خطرات شیمیایی (رنگ می‌تواند تحریک‌کننده باشد) و بیولوژیکی.

مواد، تجهیزات و معرف‌ها مورد نیاز برای روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

– معرف‌ها: بافر Tris 0.74 M با pH 8.0 حاوی رنگ (رنگ آبی)، NADP 3 mM (حدود 2.3 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، گلوکز-6-فسفات (G6P) 50 mM (15.2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر بدون آب)، و PMS (فنازین متوسولفات) به عنوان کاتالیزور اختیاری برای تسریع واکنش.

– کنترل‌ها: خون‌های شناخته‌شده عادی (تغییر سریع رنگ)، کمبود کامل (عدم تغییر) و نسبی (تاخیر متوسط).

– تجهیزات: پیپت‌های دقیق برای حجم‌های ۲۰ μL تا ۱ mL، لوله‌های شیشه‌ای شفاف برای مشاهده رنگ، آب مقطر استریل، انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد، زمان‌سنج دقیق، روغن معدنی (برای جلوگیری از اکسیداسیون هوا)، کاغذ پارافین برای آب‌بندی لوله‌ها، سانتریفیوژ (برای شفاف‌سازی اختیاری در ۲۰۰۰ دور در دقیقه)، کاغذ جذب‌کننده خون برای نوزادان (ضخامت ۱-۲ میلی‌متر)، و پانچر برای برش دیسک‌های ۵-۶ میلی‌متری.

– نکته: معرف‌ها را تازه تهیه کنید و در تاریکی نگه دارید، زیرا رنگ حساس به نور است.

مراحل دقیق روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی (گام‌به‌گام با توضیحات کامل)

روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی ۳۰ تا ۹۰ دقیقه زمان می‌برد (بسته به سرعت تغییر رنگ) و باید در دمای ثابت ۳۷ درجه سانتی‌گراد اجرا شود تا واکنش آنزیمی شبیه‌سازی شود:

۱. تهیه لیزات (همولیزات) از خون کامل: از خون تازه با ضد انعقاد استفاده کنید و از انجماد اجتناب کنید زیرا آنزیم را تخریب می‌کند. در لوله، ۱ میلی‌لیتر آب مقطر استریل اضافه کنید و ۲۰ میکرولیتر خون کامل بریزید. اجازه دهید ۵-۱۰ دقیقه در دمای اتاق بماند تا گلبول‌های قرمز کاملاً لیز شوند و هموگلوبین آزاد شود (به آرامی هم بزنید تا کف نکند). اگر سطح هموگلوبین (Hb) بیمار غیر از ۱۵ گرم در دسی‌لیتر باشد، غلظت را برای جلوگیری از نتایج کاذب تنظیم کنید: فرمول حجم خون = ۰.۳ / Hb بیمار (میلی‌لیتر برای ۱ میلی‌لیتر آب). مثال: اگر Hb=۱۰ g/dL، ۰.۰۳ میلی‌لیتر (۳۰ μL) خون اضافه کنید. این تنظیم حیاتی است زیرا غلظت بالا زمان تغییر را تاخیر می‌اندازد و غلظت پایین سرعت می‌بخشد.

۲. تهیه لیزات برای نوزادان (از خون کف پا): خون را روی کاغذ جذب‌کننده پخش کنید، اجازه دهید خشک شود (دور از نور، گرما یا گردوغبار). پیش از ۱ ساعت، دیسک‌های ۵-۶ میلی‌متری پانچ کنید. بر اساس Hb: بیش از ۱۵ g/dL = ۱ دیسک، ۱۰-۱۵ = ۲ دیسک، کمتر از ۱۰ = ۳ دیسک در ۰.۵ میلی‌لیتر آب مقطر. ۵-۱۰ دقیقه صبر کنید تا هموگلوبین استخراج شود، سپس محتویات را به لوله تست منتقل کنید و زمان شروع را ثبت کنید. روغن معدنی اضافه کنید تا از تماس با هوا جلوگیری شود و درب لوله را با کاغذ پارافین ببندید تا تبخیر کاهش یابد. هشدار: غلظت نامناسب می‌تواند منجر به تفسیر غلط شود، بنابراین Hb بیمار را همیشه چک کنید.

۳. اجرای تست اصلی: مخلوط معرف‌ها (بافر Tris + رنگ + NADP + G6P) را تازه تهیه کنید و ۰.۵ میلی‌لیتر از آن را به لیزات اضافه کنید. روغن معدنی روی سطح بریزید تا اکسیداسیون هوا جلوگیری شود و لوله را با پارافین آب‌بندی کنید. لوله را در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار دهید و زمان دقیق تغییر رنگ از آبی به زرد-قرمز (بی‌رنگ شدن رنگ) را با زمان‌سنج ثبت کنید. این مراحل را برای کنترل‌ها همزمان تکرار کنید تا مقایسه استاندارد باشد. اگر دمای محیط کمتر از ۲۵ درجه باشد، زمان تغییر طولانی‌تر می‌شود، بنابراین دما را ثابت نگه دارید.

۴. خواندن و ثبت نتایج: زمان دقیق decolorization (بی‌رنگ شدن) را یادداشت کنید. اگر مخلوط کدر باشد، لوله را سانتریفیوژ کنید (۲۰۰۰ دور در دقیقه برای ۵ دقیقه) تا شفاف شود و رنگ دقیق‌تر مشاهده گردد. نتایج را بلافاصله ثبت کنید زیرا رنگ ممکن است با گذشت زمان برگردد.

کنترل کیفیت در روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

هر سری تست باید کنترل‌های عادی (تغییر رنگ سریع در ۱۰-۳۰ دقیقه)، کمبود (عدم تغییر تا بیش از ۶۰ دقیقه) و نسبی (تاخیر ۳۰-۶۰ دقیقه) را شامل شود. نتایج را در لاگ آزمایشگاه ثبت کنید و ضریب تغییرات (CV) درون‌سری و بین‌سری را کمتر از ۱۰% نگه دارید. اگر کنترل‌ها غیرمنتظره باشند، عوامل مانند کیفیت معرف‌ها (تاریخ انقضا)، دمای انکوباتور یا pH بافر را بررسی کنید و تست را تکرار نمایید. نگهداری منظم (مانند چک هفتگی انکوباتور) برای دقت ضروری است.

تفسیر نتایج روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

– فعالیت طبیعی (Normal): تغییر رنگ از آبی به زرد-قرمز در ۱۰-۶۰ دقیقه (معمولاً سریع‌تر در ۲۰-۳۰ دقیقه) در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد، نشان‌دهنده فعالیت کافی آنزیم.

– کمبود شدید (Deficiency): عدم تغییر رنگ یا تغییر بسیار کند پس از بیش از ۶۰ دقیقه، نشان‌دهنده ریسک بالا.

– نکته: برای موارد هتروزیگوت (متوسط)، زمان تغییر ممکن است بین ۳۰-۶۰ دقیقه باشد و نیاز به تایید کمی دارد. نتایج کاذب طبیعی در کم‌خونی، عفونت یا پس از همولیز حاد رخ می‌دهد، بنابراین تاریخچه بیمار را در نظر بگیرید.

مشکلات احتمالی و عیب‌یابی در روش انجام آزمایش فاویسم با روش رنگ سنجی

– تاخیر غیرمنتظره در نمونه عادی: ممکن است به دلیل تنظیم نکردن غلظت Hb، معرف‌های قدیمی (رنگ اکسید شده) یا دمای انکوباتور پایین. راه‌حل: فرمول Hb را دوباره محاسبه کنید، معرف‌ها را تازه تهیه نمایید و دما را با ترمومتر چک کنید.

– لیز ناقص یا کدر بودن مخلوط: زمان لیز را به ۱۵ دقیقه افزایش دهید یا از آب مقطر تازه استفاده کنید.

– رنگ مبهم یا بازگشت رنگ: روغن معدنی کافی اضافه نشده یا لوله خوب آب‌بندی نشده؛ راه‌حل: روغن بیشتری بریزید و دما را دقیق نگه دارید.

– مسائل ایمنی: رنگ و PMS می‌توانند سمی و تحریک‌کننده باشند؛ از تماس پوستی یا استنشاق اجتناب کنید، در هود تهویه کار کنید و زباله‌ها را به عنوان پسماند شیمیایی خطرناک دفع نمایید (طبق مقررات محلی).

توصیه‌های کلی و نکات کاربردی

– زمان کل: ۳۰-۹۰ دقیقه، بسته به نمونه، که آن را برای غربالگری روزانه مناسب می‌کند اما نه برای موارد اورژانسی.

– مزایا: ساده و ارزان (هزینه کمتر از ۳ دلار به ازای تست)، نیاز به تجهیزات پایه (بدون نیاز به دستگاه‌های گران مانند اسپکتروفوتومتر)، و قابل اجرا در آزمایشگاه‌های کوچک.

– معایب: وابستگی به زمان‌بندی دقیق و تفسیر بصری (که می‌تواند تحت تأثیر نور محیط باشد)، حساسیت پایین‌تر برای موارد متوسط، و نیاز به انکوباتور ثابت.

– کاربردهای بالینی: غربالگری نوزادان در برنامه‌های بهداشتی، ارزیابی قبل از تجویز داروهای ضد مالاریا، و تشخیص در خانواده‌های با سابقه فاویسم. رفرنس‌های استاندارد مانند روش‌های هنری (۱۹۸۴) و باور (۱۹۸۲) برای تنظیم دقیق پیشنهاد می‌شود.

نتیجه‌گیری:

روش انجام آزمایش فاویسم با استفاده از FST و روش رنگ سنجی ابزارهای کیفی مؤثری برای غربالگری سریع کمبود G6PD هستند که می‌توانند جان‌ها را نجات دهند با جلوگیری از عوارض همولیتیک. FST برای سرعت و سادگی برتر است، در حالی که روش رنگ سنجی دقت زمانی بیشتری ارائه می‌دهد. برای موارد مشکوک یا متوسط، همیشه از روش‌های کمی مانند اندازه‌گیری اسپکتروفوتومتریک فعالیت آنزیم استفاده کنید تا تشخیص دقیق‌تر شود. این روش‌ها بر اساس استانداردهای جهانی مانند WHO تدوین شده‌اند و نیاز به آموزش، کنترل کیفیت و ایمنی دارند. در نهایت، روش انجام آزمایش فاویسم باید بخشی از برنامه‌های بهداشتی پیشگیرانه باشد، به ویژه در مناطق با شیوع بالا.

پرسش‌های متداول

۱. روش انجام آزمایش فاویسم چیست؟

یک تست آزمایشگاهی کیفی یا کمی برای تشخیص کمبود آنزیم گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز در گلبول‌های قرمز خون، که برای جلوگیری از همولیز ناشی از عوامل اکسیدان ضروری است.

۲. چرا روش انجام آزمایش فاویسم مهم است؟

برای شناسایی افراد پرخطر و جلوگیری از عوارض مانند کم‌خونی شدید، زردی و آسیب مغزی، به ویژه در نوزادان و بیماران مالاریایی.

۳. تفاوت روش کیفی و کمی در آزمایش فاویسم چیست؟

روش کیفی (مانند FST یا روش رنگ سنجی) برای غربالگری سریع و شناسایی کمبود کلی استفاده می‌شود، در حالی که کمی فعالیت دقیق آنزیم را با واحدهای عددی اندازه‌گیری می‌کند و استاندارد طلایی است.

۴. چه زمانی نباید روش انجام آزمایش فاویسم اجرا شود؟

در دوره همولیز حاد یا عفونت اخیر، زیرا نتایج کاذب طبیعی ممکن است ایجاد کند؛ حداقل ۲-۴ هفته صبر کنید تا گلبول‌ها پایدار شوند.

۵. نمونه مناسب برای روش FST در آزمایش فاویسم چیست؟

خون کامل تازه با EDTA یا ACD، نگهداری در ۲-۸ درجه سانتی‌گراد، بدون لخته یا همولیز قابل مشاهده.

۶. چگونه فلورسانس در روش FST تفسیر می‌شود؟

فلورسانس قوی سبز برای فعالیت طبیعی (>۳۰%)، متوسط برای کمبود نسبی (۳۰-۸۰%)، و ضعیف یا absent برای کمبود شدید (<۳۰%).

۷. معرف‌های اصلی در روش رنگ سنجی برای آزمایش فاویسم چیست؟

بافر Tris با رنگ، NADP، گلوکز-6-فسفات و PMS، که در نسبت‌های دقیق ترکیب می‌شوند تا واکنش کاهش رنگ را تسهیل کنند.

۸. چگونه لیزات در روش رنگ سنجی تنظیم می‌شود؟

بر اساس سطح هموگلوبین بیمار با فرمول ۰.۳ / Hb برای جلوگیری از نتایج کاذب، و برای نوزادان از دیسک‌های خون روی کاغذ جذب‌کننده.

۹. نتایج روش رنگ سنجی چگونه تفسیر می‌شود؟

تغییر رنگ سریع (۱۰-۶۰ دقیقه) برای طبیعی، عدم تغییر (>۶۰ دقیقه) برای کمبود.

۱۰. مزایای روش‌های کیفی در آزمایش فاویسم چیست؟

ساده، ارزان، سریع و بدون نیاز به تجهیزات پیچیده، ایده‌آل برای غربالگری انبوه در مناطق کم‌منبع.

منابع معتبر برای مطالعه بیشتر

“`

دیدگاهتان را بنویسید