خلاصه

محیط کشت تیوگلیکولات (Thioglycollate Broth) یک محیط کشت غنی‌شده و تمایزدهنده برای تعیین نیازهای اکسیژنی میکروارگانیسم‌ها مانند آناروب‌ها، آئروب‌ها و میکروآئروفیل‌ها است. این محیط کشت باکتری‌شناسی در جداسازی باکتری‌های سخت‌رشد مانند کلستریدیوم و باکتروئیدها، تست استریلیتی محصولات بیولوژیکی و کاربردهای فارماسی استفاده می‌شود. مقاله به اصول عملکرد محیط کشت تیوگلیکولات، ترکیب، روش تهیه، کشت، تفسیر نتایج و کنترل کیفی می‌پردازد.

مقدمه به محیط کشت تیوگلیکولات و اصول باکتری‌شناسی

محیط کشت تیوگلیکولات (Thioglycollate Broth) یک محیط کشت چندمنظوره، غنی‌شده و تمایزدهنده است که عمدتاً برای تعیین نیازهای اکسیژنی میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود. این محیط از رشد آناروب‌های اجباری، آئروب‌های اجباری، میکروآئروفیل‌ها، فاکولتاتیو آناروب‌ها، آئروتولرانت‌ها و میکروارگانیسم‌های فستیدیوس حمایت می‌کند. در باکتری‌شناسی تشخیصی، این محیط نقش کلیدی در جداسازی باکتری‌های سخت‌رشد مانند کلستریدیوم، باکتروئیدها و استرپتوکوک‌های آناروبیک ایفا می‌کند. همچنین، برای تست استریلیتی محصولات بیولوژیکی، آنتی‌بیوتیک‌ها، غذاها و تعیین ضریب فنولی و اثرات اسپورسیدال ضدعفونی‌کننده‌ها کاربرد دارد. این محیط با ایجاد گرادیان اکسیژنی از بالا (اکسیژن بالا) به پایین (اکسیژن کم) لوله، امکان تمایز نیازهای اکسیژنی را فراهم می‌کند. این مقاله همه جنبه‌های آن را با جزئیات بیشتر پوشش می‌دهد، از اصول تا کنترل کیفی، برای استفاده آموزشی پیشرفته.

ترکیب محیط کشت تیوگلیکولات و اجزای کلیدی آن

ترکیب تیپیکال تیوگلیکولات برحسب گرم در لیتر عبارت است از:
– هضم پانکراتیک کازئین (Pancreatic digest of casein): ۱۵ گرم – منبع کربن و نیتروژن.
– عصاره مخمر (Yeast extract): ۵ گرم – تقویت‌کننده رشد با ویتامین‌ها و عوامل رشد.
– گلوکز (Glucose): ۵٫۵ گرم – منبع انرژی اضافی برای متابولیسم.
– کلرید سدیم (Sodium chloride): ۲٫۵ گرم – حفظ تعادل اسمزی برای جلوگیری از شوک اسموتیک سلول‌ها.
– ال-سیستئین (L-cystine): ۰٫۵ گرم – منبع کربن و نیتروژن، کمک به کاهش پتانسیل اکسیداسیون-احیا.
– تیوگلیکولات سدیم (Sodium thioglycollate): ۰٫۵ گرم – عامل کاهش‌دهنده اصلی برای حذف اکسیژن مولکولی و خنثی‌سازی پراکسیدها.
– آگار: ۰٫۷۵ گرم – جلوگیری از جریان‌های همرفتی و انتشار اکسیژن، کمک به حفظ آناروبیوز در عمق لوله.
– رزازورین (Resazurin): ۱ میلی‌گرم – نشانگر اکسیداسیون-احیا (صورتی در حالت اکسید شده، بی‌رنگ در حالت کاهش‌یافته).
pH نهایی در ۲۵ درجه سانتی‌گراد: ۷٫۱ ± ۰٫۲. برخی فرمول‌ها شامل افزودنی‌هایی مانند هِمین (برای فاکتور X در باکتری‌های فستیدیوس)، ویتامین K (برای باکتری‌های گرم‌مثبت اسپورزا و باکتروئیدها)، یا تراشه‌های کربنات کلسیم (به عنوان بافر برای جلوگیری از تجمع اسید سمی) هستند. این ترکیبات محیط را برای رشد طیف وسیعی از باکتری‌ها مناسب می‌کنند، حتی در حضور فلزات سنگین یا مواد نگهدارنده جیوه‌ای.

اصول عملکرد محیط کشت تیوگلیکولات در رشد میکروارگانیسم‌ها

تیوگلیکولات با ایجاد محیط کاهش‌یافته و گرادیان اکسیژنی، رشد باکتری‌ها را در شرایط اکسیژنی متفاوت امکان‌پذیر می‌کند. تیوگلیکولات سدیم به عنوان عامل کاهش‌دهنده عمل کرده، اکسیژن مولکولی را حذف، از تشکیل پراکسیدها جلوگیری و اثرات سمی فلزات سنگین را خنثی می‌کند. ال-سیستئین و تیوگلیکولات سدیم پتانسیل اکسیداسیون-احیا را پایین نگه می‌دارند. رزازورین نشانگر اکسیژنی است که صورتی شدن بیش از یک نوار باریک در سطح، نشان‌دهنده اکسیداسیون است و نیاز به جوشاندن مجدد دارد. آگار با جلوگیری از جریان‌های همرفتی، CO2 و مواد کاهنده را حفظ کرده و رشد اینوکولوم‌های کوچک و آناروب‌ها را تسهیل می‌کند. اصول کلیدی:
– تامین عوامل رشد: گلوکز، پپتون کازئین و عصاره مخمر برای تکثیر باکتریایی.
– آناروبیوز: تیوگلیکولات سدیم و سیستئین امکان رشد کلستریدیوم و آناروب‌های سخت را حتی در شرایط آئروبیک فراهم می‌کنند.
– تمایز: گرادیان اکسیژنی اجازه شناسایی نیازهای اکسیژنی را می‌دهد.
الگوهای رشد بر اساس نیاز اکسیژنی:
– آئروب‌های اجباری: در بالای لوله (اکسیژن بالا)، زیرا نمی‌توانند به صورت آناروبیک تخمیر یا تنفس کنند.
– آناروب‌های اجباری: در پایین لوله (اکسیژن کم)، زیرا اکسیژن برای آن‌ها سمی است.
– فاکولتاتیو آناروب‌ها: عمدتاً بالا اما در سراسر لوله، زیرا بدون اکسیژن رشد می‌کنند اما با اکسیژن ATP بیشتری تولید می‌کنند.
– میکروآئروفیل‌ها: در بخش بالایی اما نه دقیقاً بالا، زیرا به اکسیژن نیاز دارند اما غلظت بالا سمی است.
– آئروتولرانت‌ها: پخش یکنواخت، زیرا اکسیژن نیاز ندارند اما تحمل می‌کنند.
این اصول محیط را برای جداسازی آناروب‌ها از خون یا محصولات غلیظ مناسب می‌کند.

کاربردهای محیط کشت تیوگلیکولات در آزمایشگاه میکروبیولوژی

– تعیین نیاز اکسیژنی میکروارگانیسم‌ها و تمایز بین انواع باکتری‌ها.
– کشت آناروب‌ها، آئروب‌ها، میکروآئروفیل‌ها و فستیدیوس‌ها مانند کلستریدیوم، باکتروئیدها، استرپتوکوک‌های آناروبیک.
– تست استریلیتی محصولات بیولوژیکی غلیظ، آنتی‌بیوتیک‌ها، غذاها و تجهیزات پزشکی (با روش فیلتراسیون غشایی یا تلقیح مستقیم).
– جداسازی آناروب‌های سخت از خون در عفونت‌های آناروبیک مشکوک (با رقت حداقل ۱:۱۰ برای جلوگیری از انعقاد و رقیق‌سازی مواد باکتریسیدال طبیعی).
– تعیین ضریب فنولی و اثرات اسپورسیدال ضدعفونی‌کننده‌ها.
– شبیه‌سازی فرآیندهای آسپتیک در فارماسی و صنایع غذایی.
– کشت باکتری‌های حساس به اکسیژن در آزمایشگاه‌های بالینی و تحقیقاتی.
این محیط برای محصولات توربید که کشت آن‌ها دشوار است، ایده‌آل است.

روش تهیه محیط کشت تیوگلیکولات

۱. ۲۹٫۵ گرم پودر را در ۱ لیتر آب مقطر معلق کنید (غلظت ممکن است بسته به تولیدکننده متفاوت باشد).
۲. بجوشانید تا کامل حل شود و همگن گردد.
۳. در لوله‌ها یا بطری‌های پیچ‌دار با سوراخ مرکزی و لاینر لاستیکی (۵۰ میلی‌لیتر در هر بطری) تقسیم کنید.
۴. در اتوکلاو ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید، با درپوش شل.
۵. پس از خنک شدن، درپوش‌ها را محکم کنید و با فویل یا پوشش محافظ (خیسانده در اتانول ۷۰%) بپوشانید.
۶. برچسب‌گذاری با تاریخ و شماره بچ انجام دهید.
برای فرم‌های آماده، از بطری‌های استریل استفاده کنید. اگر بیش از نوار باریکی در سطح صورتی شد (اکسیداسیون)، بطری را با درپوش شل در آب جوش ۱۵ دقیقه قرار دهید تا اکسیژن خارج شود. ماندگاری تا ۲ سال در جای خنک و تاریک، مشروط به عدم تغییر حجم یا ظاهر.

روش کشت در محیط تیوگلیکولات و تکنیک‌های تلقیح

۱. نمونه را با تکنیک آسپتیک تلقیح کنید (به کف لوله برسانید تا گرادیان حفظ شود).
۲. برای آناروبیوز کامل، با پارافین مایع یا آگار استریل لایه‌ای روی آن بریزید (برای آناروب‌ها ضروری نیست اما مفید است).
۳. در ۳۵-۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید (۲۴-۷۲ ساعت اولیه، تا ۱۴ روز برای کشت خون).
۴. روزانه بررسی کنید: توربیدیتی، کلنی‌ها روی گلبول‌های قرمز، همولیز، حباب‌های گاز، لخته‌ها.
۵. رشد را با رنگ‌آمیزی گرم، ساب‌کالچر و بررسی میکروسکوپی تأیید کنید.
۶. برای کشت خون، رقت ۱:۱۰ رعایت شود و از SPS اجتناب کنید زیرا برای استرپتوکوک‌های آناروبیک مهارکننده است.
دستورالعمل نوشته‌شده برای هر بطری صادر شود.

تفسیر نتایج

رشد کدر، کلنی‌ها یا توربیدیتی نشان‌دهنده رشد است. الگوهای توزیع برای تمایز نیاز اکسیژنی استفاده شود (مانند اصول). مثال‌های خاص:
– کاندیدا آلبیکانس: رشد فلوکولنت (توده‌ای).
– کلستریدیوم اسپوروژنس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– پپتواسترپتوکوکوس آناروبیوس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– کلستریدیوم پرفرینجنز: توربید و/یا کلنی‌ها.
– باکتروئیدز فراژیلیس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– باکتروئیدز ولگاتوس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– استافیلوکوکوس اورئوس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– پسودوموناس آئروژینوزا: توربید و/یا کلنی‌ها.
– میکروکوکوس لوتئوس: توربید و/یا کلنی‌ها.
– استرپتوکوکوس پنومونیه: توربید و/یا کلنی‌ها.
– اشریشیا کلی: توربید و/یا کلنی‌ها.
– سالمونلا تیفی‌موریوم: توربید و/یا کلنی‌ها.
– سالمونلا آبونی: توربید و/یا کلنی‌ها.
برای کشت خون: توربیدیتی بالای لایه گلبول‌های قرمز، کلنی‌های پنبه‌ای، همولیز، گاز یا لخته نشان‌دهنده رشد است. عدم رشد در شرایط آئروبیک برای آناروب‌ها تأییدکننده است. برای شناسایی کامل، تست‌های بیوشیمیایی و مولکولی نیاز است.

کنترل کیفی محیط کشت تیوگلیکولات و تست‌های استاندارد

– ظاهر: شفاف، زرد روشن بدون رسوب یا تغییر رنگ.
– pH: ۶٫۹-۷٫۳.
– استریلیتی: بدون رشد پس از انکوباسیون.
– تست عملکردی: با سویه‌های کنترل مانند کلستریدیوم اسپوروژنس (ATCC 19404 – رشد توربید/کلنی در پایین)، استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923 – رشد توربید در بالا)، با رشد لوکسوریانت در ≤۳ روز.
– هر بچ با ارگانیسم‌های QC (مانند باکتروئیدز فراژیلیس، استرپتوکوکوس پنومونیه) تست شود.
– بررسی اکسیداسیون: صورتی شدن بیش از نوار باریک نشان‌دهنده نامناسب بودن است.
– کاربران نهایی باید QC را طبق مقررات محلی انجام دهند.

جهت مطالعه جامع در مورد محیط کشت های میکروبی به لینک زیر مراجعه کنید:

کنترل کیفی محیط های کشت میکروبی: راهنمای آموزشی کامل برای کارشناسان آزمایشگاه

محدودیت‌ها

– برای شناسایی کامل، تست‌های بیوشیمیایی اضافی نیاز است؛ تنها تمایز نیاز اکسیژنی را فراهم می‌کند.
– بیش از ۳۰٪ اکسیداسیون (صورتی شدن) پس از جوشاندن، محیط را نامناسب می‌کند.
– جوشاندن بیش از یک بار رادیکال‌های اکسیژنی سمی تولید می‌کند.
– برای کشت میکروآئروفیل و آناروب، نسبت سطح به حجم لوله مهم است تا گرادیان حفظ شود.
– ذخیره در دمای پایین اکسیژن بیشتری جذب می‌کند و عملکرد را کاهش می‌دهد.
– SPS برای کشت خون اضافه نشود زیرا مهارکننده است.
– برای محصولات غلیظ، ممکن است نیاز به رقت یا افزودنی‌های خاص باشد.
– باید تازه تهیه یا ظرف ۴ ساعت استفاده شود.

نگهداری و دفع محیط تیوگلیکولات با ایمنی بالا

در ۲-۸ درجه سانتی‌گراد، دور از نور و رطوبت نگهداری کنید. پس از باز کردن، خشک و بسته نگه دارید. مواد آلوده را در اتوکلاو ۱۲۱ درجه به مدت ۱۵ دقیقه استریل کنید قبل از دفع. از تماس با پوست و چشم اجتناب کنید؛ در صورت تماس، با آب شستشو دهید.